Спосіб визначення рівня активних і латентних форм желатиназ у тканині пацієнтів з варикоцеле

Реферат: Спосіб визначення рівня активних і латентних форм желатиназ у тканині пацієнтів з варикоцеле, згідно з яким препарат гомогенізують у 1 % розчині додецилсульфату натрію, гомогенат центрифугують при 3000 об/ну, 20 мкл надосаду вносять у лунки гелю та проводять електрофорез при температурі +4 °C в напрузі електричного поля 150 В протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивають у тритоні Х-100, потім інкубують у буфері з додаванням хлориду кальцію при рН=7,5 впродовж 18 годин при температурі +37 °C, фіксують і забарвлюють 0,25 % Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізується у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їх локалізація відповідає молекулярній масі кожного з ферментів, що визначають за стандартами молекулярних мас. Спочатку пацієнтам, хворим на варикоцеле, здійснюють мікрохірургічну субінгвінальну варикоцелектомію, під час якої виконують під місцевою анестезією внутрішньо розчином лідокаїну та буівакаїну, відступивши 1 см від зовнішнього пахового кільця, поздовжній розріз шкіри по ходу сім'яного канатика розміром до 3 см. Після розведення фасцій сім'яний канатик мобілізують і фіксують на крючку або гумових тримачах, за допомогою оптичного збільшення у 8-18 разів ідентифікують, перев'язують і пересікають зовнішню сім'яну вену. Після розкриття сім'яного канатика диференціюють вени, сім'яну артерію та лімфатичні судини, використовуючи для диференціації сім'яної артерії інтраопераційно комплекс для доплерографічних обстежень. Усі вени виділяють, перев'язують, пересікають і здійснюють забір препарату - частини варикозно розширеної вени сім'яного канатика для подальшого дослідження, поміщаючи препарат у рідкий азот і транспортуючи його до лабораторії для визначення рівня матриксних металопротеїназ. Фасції та підшкірну клітковину зшивають пошарово і на шкіру накладають внутрішньошкірний шов vicril 4/0. Препарат зберігають у рідкому азоті при температурі -180 °C не більше ніж 1 місяць, а безпосередньо перед дослідженням подрібнюють у рідкому азоті. Концентрації активних та латентних форм матриксних металопротеїназ в отриманому UA 87180 U (12) UA 87180 U препараті визначають методом зимографії в 12 % поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію і 0,1 % желатину як субстрату. Оцінку протеолітичної активності проводять шляхом виміру площі зони лізису і визначають концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. UA 87180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до урології, і може бути використана при визначенні рівня активних і латентних форм желатиназ у стінці вени сім'яного канатика у пацієнтів з варикоцеле. Варикоцеле - це варикозне розширення вен сім'яного канатика і яєчка. Варикоцеле посідає перше місце серед чинників, що призводять до чоловічого безпліддя. На даний момент доведено негативний вплив варикоцеле на функцію яєчка за рахунок підвищення температури калитки. Внаслідок цього погіршується вироблення тестостерону клітинами Лейдіга, вражаються мембрани гермінативного епітелію та порушується функція клітин Сертолі [Khera M, Lipshultz LI. Evolving approach to the varicocele. Urol Clin North Am 2008;35(2): 183-9]. Також важливу роль відіграє застій венозної крові, що спричиняє гіпоксію, погіршення виведення гонадотоксинів і підвищення рівня окислювального стресу клітин [Fertil Steril. 2004 Dec;82(6): 1684-6. Increased seminal reactive oxygen species levels in patients with varicoceles correlate with varicocele grade but not with testis size. Allamaneni SS, Naughton CK, Sharma RK, Thomas AJ Jr, Agarwal A.]. З достатньою вірогідністю можна вважати, що основною причиною виникнення варикоцелє є слабкість судинної стінки. Матриксні металопротеїнази (ММП) - це Zn-залежні ендопептидази, що мають властивість руйнувати основні компоненти екстрацелюлярного матрикса і відіграють важливу роль у процесі його регульованої деградації. Була досліджена та доведена роль ММП у багатьох патологічних станах. Ревматоїдний артрит, остеоартрит, виразкова хвороба, аутоімунні захворювання, гіпертонія, пухлинні інвазії та метастазування - це не повний перелік захворювань, що протікають з порушенням регуляції деградації екстрацелюлярного матриксу, тобто за участю ММП [Ганусевич И.И. Роль матриксных металлопротеиназ (ММП) при злокачественных новообразованиях. Характеристика ММП, регуляция их активности, прогностическое значение. Онкология 2010; 12, №1(43), С. 10-16]. Враховуючи виявлені зміни сполучного компоненту судинної стінки вен лозовидного сплетення у пацієнтів з варикоцелє досліджували роль ММП в етіології цього захворювання [Angiology. 2006 Oct-Nov;57(5):546-55. The histopathology of varicose vein disease. Somers P, KnaapenM.]. Відомо визначення концентрації желатиназ в пухлинній тканині щурів, згідно з яким, препарат гомогенізують у 1 % розчині додецилсульфату натрію, гомогенат центрифугують при 3000 об/хв., 20 мкл надосаду вносять у лунки гелю та здійснюють електрофорез при температурі +4 °C в напрузі електричного поля 150 В протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивають у тритоні Х-100, потім інкубують у буфері з додаванням хлориду кальцію (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37 °C, фіксують і забарвлюють 0,25 % Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їхня локалізація відповідала молекулярній масі кожного з ферментів, які визначають за стандартами молекулярних мас [De Clerk YA, Perez N, Shimada H et al. Inhibition of invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases. Cancer research 1992; 52: 701-8]. Зазначений спосіб має вузькі функціональні можливості і не може бути використаний для визначення рівня активних і латентних форм желатиназ у стінці вени сім'яного канатика у пацієнтів з варикоцеле. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу з розширенням його функціональних можливостей для визначення рівня активних і латентних форм желатиназ у стінці вени сім'яного канатика у пацієнтів з варикоцеле. Поставлену задачу вирішують тим, що в способі визначенні рівня активних і латентних форм желатиназ у стінці вени сім'яного канатика у пацієнтів з варикоцеле, згідно з яким, препарат гомогенізують у 1 % розчині додецилсульфату натрію, гомогенат центрифугують при 3000 об/хв., 20 мкл надосаду вносять у лунки гелю та проводять електрофорез при температурі +4 °C в напрузі електричного поля 150 В протягом 4 годин, а після розділення досліджуваних білків гель відмивають у тритоні Х-100, потім інкубують у буфері з додаванням хлориду кальцію при рН=7,5 впродовж 18 годин при температурі +37 °C, фіксують і забарвлюють 0,25 % Кумассі діамантовим синім, після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізується у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їх локалізація відповідає молекулярній масі кожного з ферментів, що визначають за стандартами молекулярних мас, згідно з корисною моделлю, спочатку пацієнтам, хворим на варикоцеле, здійснюють мікрохірургічну субінгвінальну варикоцелектомію, під час якої виконують місцеву анастезію розчином лідокаїну та буівакаїну і, відступивши 1см від зовнішнього пахового кільця, 1 UA 87180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 здійснюють поздовжній розріз шкіри по ходу сім'яного канатика розміром до 3 см, після розведення фасцій сім'яний канатик мобілізують і фіксують на крючку або гумових тримачах, за допомогою оптичного збільшення у 8-18 разів ідентифікують, перев'язують і пересікають зовнішню сім'яну вену, після розкриття сім'яного канатика диференціюють вени, сім'яну артерію та лімфатичні судини, використовуючи для диференціації сім'яної артерії інтраопераційно комплекс для доплерографічних обстежень, усі вени виділяють, перев'язують, пересікають і здійснюють забір препарату - частини варикозно розширеної вени сім'яного канатика для подальшого дослідження, поміщаючи препарат у рідкий азот і транспортуючи його до лабораторії для визначення рівня матриксних металопротеіназів, а фасції та підшкірну клітковину зшивають пошарово і на шкіру накладають внутрішньошкірний шов vicril 4/0, одержаний препарат зберігають у рідкому азоті при температурі -180 °C не більше, ніж 1 місяць, а безпосередньо перед дослідженням подрібнюють у рідкому азоті, концентрації активних та латентних форм матриксних металопротеїназ в отриманому препараті визначають методом зимографії в 12-и % поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію і 0,1 % желатину як субстрату, оцінку протеолітичної активності проводять шляхом виміру площі зони лізису і визначають концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Спосіб, що заявляється, має ширші функціональні можливості у порівнянні з прототипом і дозволяє визначити рівень активних і латентних форм желатиназ у стінці вени сім'яного канатика у пацієнтів з варикоцеле. Спосіб здійснюють наступним чином. Пацієнтам, хворим на варикоцеле, виконують мікрохірургічної субінгвінальної варикоцелектомії за класичною методикою. Під місцевою анестезією внутрішньо розчином лідокаїну та буівакаїну, відступивши 1см від зовнішнього пахового кільця, виконують поздовжній розріз шкіри по ходу сім'яного канатика розміром до 3 см. Після розведення фасцій сім'яний канатик мобілізують і фіксують на крючку або гумових тримачах. За допомогою оптичного збільшення (в 8-18 разів) ідентифікують, перев'язують і пересікають зовнішню сім'яну вену. Після розкриття сім'яного канатика диференціюють вени, сім'яну артерію та лімфатичні судини. Для диференціації сім'яної артерії інтраопераційно використовують комплекс для доплерографічних обстежень. Усі вени виділяють, перев'язують і пересікають. Крім цього, проводять забір частини варикозно розширеної вени сім'яного канатика для подальшого дослідження. Препарат поміщають у рідкий азот і транспортують до лабораторії, де в ньому визначають рівень ММП. Фасції та підшкірну клітковину зшивають пошарово, на шкіру накладають внутрішньо шкірний шов vicril 4/0. Зразок судини зберігають у рідкому азоті при температурі -180 °C не більше, ніж 1 місяць, а безпосередньо перед дослідженням подрібнюють у рідкому азоті. Концентрації активних та латентних форм ММП в отриманому зразку визначають методом зимографії в 12 % поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію і 0,1 % желатину як субстрату (6). 50 мг зразка гомогенізують у 1 % розчині додецилсульфату натрію, гомогенат центрифугують при 3000 об/ ну, 20 мкл надосаду вносять у лунки гелю та проводять електрофорез при температурі +4 °C в напрузі електричного поля 150 В протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивають у тритоні Х-100, потім інкубують у буфері з додаванням хлориду кальцію (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37 °C, фіксують і забарвлюють 0,25 % Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність ММП візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їх локалізація відповідала молекулярній масі кожного з ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводять шляхом виміру площі зони лізису та визначають концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ ("Sigma"). Враховуючи доведений деструктивний вплив матриксних металопротеїназ на позаклітинну матрицю тканини, можна зробити висновок, що підвищення їх вмісту у стінці судини призводить до дезорганізації її клітин та, як наслідок, варикозному розширенню. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 60 Спосіб визначення рівня активних і латентних форм желатиназ у тканині пацієнтів з варикоцеле, згідно з яким, препарат гомогенізують у 1 % розчині додецилсульфату натрію, гомогенат центрифугують при 3000 об/ну, 20 мкл надосаду вносять у лунки гелю та проводять електрофорез при температурі +4 °C в напрузі електричного поля 150 В протягом 4 годин, а після розділення досліджуваних білків гель відмивають у тритоні Х-100, потім інкубують у 2 UA 87180 U 5 10 15 20 буфері з додаванням хлориду кальцію при рН=7,5 впродовж 18 годин при температурі +37 °C, фіксують і забарвлюють 0,25 % Кумассі діамантовим синім, після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність желатиназ візуалізується у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їх локалізація відповідає молекулярній масі кожного з ферментів, що визначають за стандартами молекулярних мас, який відрізняється тим, що спочатку пацієнтам, хворим на варикоцеле, здійснюють мікрохірургічну субінгвінальну варикоцелектомію, під час якої виконують під місцевою анестезією внутрішньо розчином лідокаїну та буівакаїну, відступивши 1 см від зовнішнього пахового кільця, поздовжній розріз шкіри по ходу сім'яного канатика розміром до 3 см, після розведення фасцій сім'яний канатик мобілізують і фіксують на крючку або гумових тримачах, за допомогою оптичного збільшення у 8-18 разів ідентифікують, перев'язують і пересікають зовнішню сім'яну вену, після розкриття сім'яного канатика диференціюють вени, сім'яну артерію та лімфатичні судини, використовуючи для диференціації сім'яної артерії інтраопераційно комплекс для доплерографічних обстежень, усі вени виділяють, перев'язують, пересікають і здійснюють забір препарату - частини варикозно розширеної вени сім'яного канатика для подальшого дослідження, поміщаючи препарат у рідкий азот і транспортуючи його до лабораторії для визначення рівня матриксних металопротеїназ, а фасції та підшкірну клітковину зшивають пошарово і на шкіру накладають внутрішньошкірний шов vicril 4/0, препарат зберігають у рідкому азоті при температурі -180 °C не більше ніж 1 місяць, а безпосередньо перед дослідженням подрібнюють у рідкому азоті, концентрації активних та латентних форм матриксних металопротеїназ в отриманому препараті визначають методом зимографії в 12 % поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію і 0,1 % желатину як субстрату, оцінку протеолітичної активності проводять шляхом виміру площі зони лізису і визначають концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. 25 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3