Штам гібридомних тваринних клітин mus musculus l., що культивується та продукує моноклональні антитіла, які специфічно зв’язуються з розчинним фібрином плазми крові

Штам гібридомних тваринних клітин Mus musculus L., отриманий шляхом гібридизації клітин селезінки мишей лінії Balb/c, імунізованих фібрином desAABB в забуференому фізіологічному розчині з додаванням сечовини до кінцевої концентрації 2 М з клітинами мієломи миші X63-Ag 8.6.5.3, що культивується та продукує моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з мономерним і полімерним фібрином desAA, фібрином desAABB та розчинним фібрином плазми крові людини, але не взаємодіють із фібриногеном та з продуктами деградації фібрин(оген)у плазміном, крім Хфрагмента фібрину, та які призначені для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини. (19) UA (21) a200712284 (22) 06.11.2007 (24) 10.07.2009 (46) 10.07.2009, Бюл.№ 13, 2009 р. (72) КОМІСАРЕНКО СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, КОЛЕСНІКОВА ІРИНА МИКОЛАЇВНА, ЛУГОВСЬКИЙ ЕДУАРД ВІТАЛІЙОВИЧ, ЛЯШКО КАТЕРИНА ДМИТРІВНА, ГРИЦЕНКО ПАВЛО ГРИГОРОВИЧ, ЛИТВИНОВА ЛЮДМИЛА МИХАЙЛІВНА, КОСТЮЧЕНКО ОЛЕНА ПЕТРІВНА, ЛУГОВСЬКА НАТАЛІЯ ЕДУАРДІВНА, ГОГОЛИНСЬКА ГЕНРІЄТТА КАЗИМИРІВНА (73) ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) US B2 6451545, 17.09.2002. RU C2 2173347, 10.09.2001. UA C2 73232, 15.06.2005. US A 5821068, 13.10.1998. US 4722903, 02.02.1988. US A1 20020015972, 07.02.2002. EP A1 1832654, 12.09.2007 (ABSTRACT). WO A1 2006070776, 06.07.2006. US A 5837540, 17.11.1998. US 5019499, 28.05.1991. US A 5453359, 26.09.1995. Dempfle CE et al.:” Binding of a new monoclonal antibody against N-terminal heptapeptide of fibrin alpha-chain to fibrin polymerization site “A”: effects of fibrinogen and fibrinogen derivatives, and pretreatment of samples with NaSCN”, Blood Coagul. Fibrinolysis )ISSN:0957-5235), 1993 Feb; Volume:4 (Issue: 1), page 79-86 (ABSTRACT). Nakahara K et al.:” Measurement of soluble fibrin monomer-fibrinogen complex in plasmas derived from C2 2 (11) 1 3 олігомери, які складаються з фібрину desAA, на кінцях якого знаходяться молекули фібриногену. Такі комплекси та олігомери складають істинний розчинний фібрин. Центри полімеризації фібрину забезпечують міжмолекулярна взаємодії фібрину на всіх стадіях процесу з утворенням надмолекулярних структур і трьохмірної сітки фібрину, яка є каркасом любого тромбу. Ранні; визначення розчинного фібрину та своєчасне застосування антикоагулянтів може запобігти утворенню тромбів. Діагностика передтромботичних станів може бути досягнута шляхом кількісного визначення розчинного фібрину за допомогою монАТ, які реагують з фібрином і не взаємодіють з фібриногеном та продуктами деградації фібрин(оген)у. Відомо цілий ряд гібридом, описаних у науковій та патентній літературі, які одержані до різноманітних імуногенів і продукують фібринспецифічні монАТ до різних сайтів фібрину. Такі монАТ використовують при створенні імунодіагностичних тест-систем для моніторингу гемостазу [1,2,]. Відомо, що як імуноген використано фрагмент фібрину, який утворюється при його обробці бромціаном, N-кінцевий дисульфідний вузол, та одержано монАТ T2G1, специфічні до ділянки Ββ15-21 фібрину [3]. З такою ж специфічністю одержано монАТ 59D8, які реагують з фібрином desAABB, не реагують з фібриногеном і використовуються для детекції тромбу [4]. Проте вказані види антитіл реагують з фібрином лише після відщеплення фібринопептиду В і не можуть бути використані для визначений істинного розчинного фібрину, основним компонентом якого є фібрин desAA. Відомі тест-системи, створені на основі монАТ МН1 для визначення in vitro наявності або кількості розчинних поперечно прошитих (стабілізованих фактором ХІІІа) фібринових полімерів desAABB та розчинних поперечно непрошитих (нестабілізованих) фібринових полімерів desAABB у зразках плазми крові для визначення схильності до передтромботичних станів [5]. Однак монАТ МН1 не реагують з фібриногеном, продуктами деградації фібрин(оген)у, з окремими поліпептидними ланцюгами (Αα, Ββ, γ) фібриногену або фібрину, а також з фібриновими мономерами та полімерами desAA, з фібриновими мономерами desAABB, з комплексом фібриновий мономер desAA -фібриноген, тобто не можуть бути використані для ранньої діагностики передтромботичних станів. Відомі монАТ до синтетичного пептиду, який імітує фрагмент фібрину Αα 17-22, що експонується після відщеплення тромбіном фібринопептиду А від фібриногену [6]. Ця ділянка молекули фібрину містить центр полімеризації, який блокується при міжмолекулярних взаємодіях з фібрин(оген)ом, які перешкоджають антитілам реагувати з своїм епітопом на розчинному фібрині в плазмі крові. Проте для прояву спорідненості антитіл до свого епітопу необхідно проводити попередню дисоціацію комплексів та олігомерів розчинного фібрину хаотропними іонами високої концентрації. Відомий метод визначення розчинного фібрину за допомогою монАТ IF-43, епітоп яких знахо 87375 4 диться на ділянці Аа 17-78 і відкривається при відщепленні фібринопептиду А та утворенні комплексу однієї молекули фібрину desAA з двома молекулами фібриногену [7]. Метод не потребує попередньої обробки плазми. Недоліком цього методу є те, що структура комплексу може змінюватися з часом за рахунок приєднання інших білків плазми крові і це впливатиме на одержання стабільних результатів. Відомі монАТ J2-23 для визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини, які специфічно розпізнають структурні зміни в С-термінальнір області Αα-ланцюга фібрину, що відбуваються при розщепленні фібриноген}' тромбіном [8]. При використанні монАТ для визначення фібрину має значення з якою ділянкою молекули фібрину реагують ці антитіла. Таким чином, немає однозначності у визначенні концентрацій утвореного фібрину, а питання щодо удосконалення та стандартизації тестсистем для його визначення на основі монАТ ще й досі залишається невирішеним. Найбільш близьким аналогом до запропонованого штаму за імунологічною характеристикою, є штам гібридомних клітин [9]. МонАТ F405 реагують з фібриногеном, обробленим отрутою змії батроксобіном, тобто з фібрином desAA, з фібриногеном, обробленим тромбіном, тобто з фібрином desAABB, та з розчинним фібрином плазми крові людини без будь якої попередньої обробки. МонАТ F405 не реагують із фібриногеном та продуктами його деградації плазміном (Χ, Υ, Ε, D), з окремими поліпептидними ланцюгами фібриногену (Αα, Ββ, γ) та з D-димером фібрину і DD/E комплексом. Одержані антитіла розпізнають продукти деградації плазміном фібрину (Χ, Υ, Е). Епітоп їх знаходиться у Ε-фрагменті фібрин}' та в його утворенні приймають участь амінокислотні залишками N-кінцевого фрагменту а-ланцюга фібрину (GPRWERHQ). Належать монАТ до ізотипу IgGl. Однак вказані монАТ погано зв'язуються з протеїнΑ сефарозою, що затруднює їх виділення. В основу винаходу поставлена здача одержання штаму гібридомних клітин Mus musculus Lпродуцентів монАТ, що специфічно реагують із фібрином, але не взаємодіють із фібриногеном і продуктами їх деградації плазміном, і які призначені для розробки кількісного бісайтового імунохімічного аналізу фібрин-мономерів та розчинного фібрину в плазмі крові людини. Поставлена задача вирішена шляхом одержання нового штаму гібридомних клітин, який продукує монАТ, позначені як FnI-3С, з високою константою дисоціації (KD) в реакції з фібрином (9,76×10-10М), ці монАТ не реагують ні з фібриногеном, ні з продуктами деградації фібрин(оген)у плазміном, за виключенням Х-фрагменту фібрину. Білки плазми крові не заважають реакції монАТ з їх епітопом, який розміщений, на відміну від монАТ прототипу, на Ββ-ланцюзі фібрин(оген)у та експонується при перетворенні фібриногену в фібрин дезАА. Спорідненість антитіл зростає після відщеплення тромбіном фібринопептиду В. Вони також добре реагують з полімерним прошитим фібрином дезААВВ, слабше - з непрошитим. За допомогою 5 імуноблотаналізу з використанням фібрину дезААВВ, D-димеру та N-ДСВ фібрину, відновлених βмеркаптоетанолом, встановлено, що монАТ FnI3С реагують з трьох поліпептидних ланцюгів фібрину дезААВВ тільки з його β-ланцюгом (Вβ 15461) і не реагують із жодним з поліпептидних складових D-димеру, включаючи його Bd-ланцюг (134-461), та N-ДСВ фібрину, включаючи його BNДСВ (Ββ15-118). При обробці фібрину плазміном відбувається руйнування епітопу. МонАТ FnI-ЗС не реагують з Е-фрагментом, який включає амінокислотні залишки В β ланцюга 55-122 та з Dфрагментом фібриногену та D-димером фібрину. Ці результати свідчать, що епітоп монАТ FnI-3С розташований на ділянці Ββ 122-134, розміщеній в суперспіральній області молекули фібрину, на відміну від найближчого аналога [9], епітоп яких представлений амінокислотними залишками aланцюга у Е-фрагменти фібрину. Належать монАТ FnI-3С до ізотипу IgG2a тому мають більшу спорідненість до протеїн А-сефарози, на відміну від монАТ прототипу, що полегшує їх виділення на згаданому афінному сорбенті. Ці характеристики дозволяють використовувати монАТ І-3С-7с для визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини за допомогою бісайтового імуноферментного аналізу (ІФА) в концентрації до 0,10мкг/мл розведеної у десять разів плазми крові людини. При побудові калібрувального графіка використовують стандартні зразки фібрин-мономеру в розчині 5%-го обезжиреного сухого молока з додаванням цитрату натрію до 0,38%, які готують на забуференому фізіологічному розчині, що містить 0,1% твіну-20, на відміну від [9], де для підтримки фібрину в розчині додають пептид GPRP у молярному співвідношенні фібрин : GPRP = 1 : 1000. Штам гібридомних клітин, що заявляється, одержують наступним чином. Мишей лінії Balb/c імунізують введенням у порожнину черева 100мкг очищеного препарату фібрину desAABB в 100мкл забуференого фізіологічного розчину з додаванням сечовини до кінцевої концентрації 2Μ у вигляді емульсії з повним ад'ювантом Фрейнда (1:1). Фібрин одержують за методом [10]. Повторні імунізації проводять тією ж кількістю антигену в неповному ад'юванті Фрейнда, з додаванням сечовини до кінцевої концентрації 2М. За три дні до гібридизації мишам з достатнім титром антитіл у сироватці крові вводять антиген у забуференому фізіологічному розчині (ЗФР) 0,01Μ К-фосфатний буфер, рН 7,4 з 0,14Μ NaCl, з додаванням сечовини до кінцевої концентрації 2М. [11, 12]. У мишей у стерильних умовах беруть селезінку та виділяють клітини, які промивають розчином Хенкса. Клітини селезінки (1x10 клітин) гібридизують з клітинами мієломи миші X63-Ag 8.6.5.3 (5x107 клітин), додаючи до осаду суміші клітин 1мл 50%-го поліетиленгліколю з молекулярною масою 3000 Да протягом 1 хвилини. Після злиття клітини промивають розчином Хенкса і розсівають у чотири 24-лункові планшети („Costar", США) по 1мл на лунку. Для культивування та селекції гібридом використовують поживне середовище RPMI-1640 з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки, 1×10-4 Μ гіпоксантину, 4x10-7 Μ 87375 6 аміноптерину і 1,6х10-5 Μ тимідину [11, 12]. Відбір гібридомних клітин, що секретують в окремих лунках антитіла потрібної специфічності, здійснюють за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (тІФА): у лунки полістиролового планшету, заздалегідь покриті антигенами [13, 14, 15] в концентрації 10мкг/мл (для D-димера та Е- і Dфрагментів у 0,02 Μ бікарбонатному буфері рН 9,5, для фібриногену - в 0,2 Μ ацетатному буфері рН 8,5, а для фібрину desAA та desAABB - у 0,2 Μ ацетатному буфері рН 8,5 з додаванням сечовини до кінцевої концентрації 3 М). В подальшому в лунки вносять культуральну рідину, на якій ростуть гібридомні клітини, і інкубують 1год при температурі 37°С. Промивають планшет проточною водою шість разів, струшують, заповнюють лунки ЗФР з 0,05% твіном-20 (ТФБ), через три хвилини струшують, старанно видаляють залишки вологи і вносять у лунки кон'югат пероксидази з кролячими антитілами до IgG миші у розведенні 1:1000. Після інкубації при температурі 37°С протягом однієї години планшети промивають, лунки заповнюють субстратною сумішшю - 0,03% Н2О2 і 0,4мг/мл офенілендіаміну в 0,05 Μ К-фосфатному буфері, рН 6,0. Реакцію зупиняють додаванням 50мкл 2 Μ H2SO4. Оптичну густину визначають за довжини хвилі 492 нм на автоматичному мікроспектрофотометрі. Гібридоми, що продукують монАТ, клонують чотири рази методом кінцевих розведень, висіваючи по одній клітині в лунку, що містить 5x104 неімунних клітин селезінки миші. Після клонування частка клітин, що синтезує антитіла заданої специфічності, складає 100%. Продукція антитіл зберігається, як мінімум, протягом 16 пасажей. Штам, що заявляється, характеризується наступними ознаками. 1. Культуральні властивості. Для вирощування штаму використовують культуральні флакони з поживним середовищем Ігла в модифікації Дульбекко або RPMI-1640 з 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ глютаміну, 1мМ пірувату натрію, 0,05мМ, 2-меркаптоетанолу, 50мкг/мл гентаміцину, 20мМ HEPES. Посівна доза складає 50-100 тис. клітин/мл. Через 3-4 дні клітини підраховують і пересівають. Ростуть клітини при температурі 37°С. При використанні 20мМ HEPES в поживному середовищі необов'язково створювати 5% концентрацію СО2 в атмосфері. Характер росту - стаціонарна суспензія. 2. Характеристика корисного продукту. Мон AT FnI-3С належать до субкласу IgG2a. Специфічність: мономерний і полімерний фібрин desAA, фібрин desAABB та розчинний фібрин плазми крові людини. Антигенна детермінанта (епітоп), що розпізнається антитілами, розміщена в Ββ-ланцюзі фібрину, вірогідно на ділянці Ββ122-134. KD монАТ у реакції з фібрином desAABB складає 9,76x10-10 М. МонАТ не реагують з фібриногеном та з продуктами деградації фібрин(оген)у плазміном та бромціаном, крім X-фрагменту фібрину. 3. Продуктивність штаму. Концентрація антитіл у культуральній рідині за 3-4 дні культивування досягає 20-30мкг/мл. 4. Контамінації. За довготривалого спостереження бактерій, грибів і мікоплазм не виявлено. 7 5. Кріоконсервування. Для зберігання клітини штаму, що заявляється, ресуспендують у суміші, що складається з 10% диметилсульфоксиду та 90% ембріональної телячої сироватки, в концентрації 5 х 106 клітин/мл, розливають у пластикові ампули, поміщають у контейнери із спіненого полістиролу з товщиною стінок 1см, переносять у заморожувач (-70°С) на 18 годин. Потім клітини переносять у рідкий азот для довгого зберігання. Розморожують клітини при температурі +37°С у водяній бані. Життєздатність клітин оцінюють після фарбування їх трипановим синім. Звичайно вона становить близько 70%. Приклад. МонАТ FnI-3С виділяють афінною хроматографією із культурального середовища, на якому протягом 3-4 днів росли гібридомні клітини штаму, що заявляється. Культуральну рідину пропускають через колонку із протеїн G-сефарозою («Amersham Biosciences», Швеція), яку урівноважують 0,1 Μ К-фосфатним буфером, рН 7,2. Зв'язані антитіла елююють 0,1 Μ гліцин-НСІ буфером з рН 3, нейтралізують 1 Μ К2НРО4, концентрують і діалізують проти ЗФР за допомогою ультрафільтрації. Концентрацію антитіл визначають на спектрофотометрі. МонАТ FnI-ЗС, використовують для визначення концентрації фібрину desAA, фібрину desAABB та розчинного фібрину у плазмі крові людини за допомогою бісайтового ІФА. У 96-лункові полістиролові планшети вносять по 110мкл розчину монАТ у ЗФР із концентрацією 10мкг/мл і інкубують при 4°С протягом 18год. Потім лунки заповнюють ТФБ і витримують 30хв при кімнатній температурі, промивають проточною водою з-під крана шість разів та один раз ТФБ. До адсорбованих на полістиролі монАТ додають 100мкл розчину, що містить зразок фібрину (наприклад, розведену в 10 разів плазму крові людини). Розведення плазми готують у ТФБ з 0,1% твін-20 та з додаванням сухого обезжиреного молока і цитрату натрію з кінцевими концентраціями 5% і 0,38%, відповідно. У контрольних лунках фібрин відсутній. Інкубують 1год при температурі 37°С. Промивають проточною водою, ТФБ і додають у кожну лунку біотинильовані антитіла до фібрин(оген)у II-4d [16], які, на відміну від штаму FnI-3С, розпізнають іншу ділянку на молекулі, інкубують 1год при температурі 37°С, промивають планшет, як описано вище, і заповнюють кожну лунку кон'югатом стрептавідину з пероксидазою хрону («Pharmacia», Швеція), знову інкубують та промивають планшет, як і в попередні рази. У кожну лунку планшета вносять субстратну суміш (склад якої описано вище). Оптичну густину визначають при λ 492 нм за допомогою автоматичного багатоканального мікроспектрофотометра. Концентрацію фібрину обчислюють, за калібрувальним графіком. Чутливість визначення розчинного фібрину становить 0,1мкг/мл плазми, розведеної в десять разів. Таким чином, штам гібридомних тваринних клітин Mm musculus L., що продукує монАТ FnI-3С, які специфічно реагують з фібрином людини, призначений для створення імунодіагностичних тестсистем для кількісного визначення фібрину desAA, 87375 8 фібрину desAABB у складі розчинного фібрину в плазмі крові людини. Список посилань 1. Nieuwenhuizen W., Hoegee-De Nobel E., Laterveer R., A rapid monoclonal antibody-based enzyme immunoassay (EIA) for the quantitative determination soluble fibrin in plasma // Thrombosis and Haemostasis. - 1992. -Vol. 68(3).-P. 273-277. 2. Tymkewycz P.M., Creighton Kempsford L.J., Gaffney P.J., Generation and partial characterization of five monoclonal antibodies with high affinities for fibrin // Blood Coagulation and Fibrinolysis. - 1993. Vol. 4. - P. 211 - 221. 3. Пат. 4722903 US, МКИ4, G01N33/577; C12N5/00; C07K15/04. Monoklonal antibodies specific to in vivo fragments derived from humen fibrinogen, humen fibrin I or humen fibrin II // Kudryk B.J.; Wiebe M.E. -Опубл. 02.02.1988. 4. Hui K.Y., Haber E., Matsueda G.R., Monoclonal antibodies to a synthetic fibrin-like peptide bind to human fibrin but not fibrinogen // Science. - 1983. - Vol. 222. - P. 1129 - 1132. 5. Пат. 2173347 RU, МКИ4, C12Q1/56, G01N33/53, 33/577, 33/96, C07K16/36, C12P21/08. Иммуноанализ растворимых фибриновых полимеров // Гарган П.Е., Плоплис В.А., Плезантс Д.Р. Опубл. 10.09.2001. 5. Dempfl C.E., Dollman M., Lill H. et al., Binding of a new monoclonal antibody against N-terminal heptapeptide of fibrin alpha-chain to fibrin polymerization site Ά': effects of fibrinogen and fibrinogen derivatives, and pretreatment of samples with NaSCN // Blood Coagulation and Fibrinolysis. 1993.-4.-P. 79-86. 6. Пат. 5821068 US, МКИ4 , G01N33/543, G01N33/577. Anti-human soluble fibrin antibody, hibridoma, and immunoassaying method // Soe G., Kohn I., Inuzuka K., Ito Y. - Опубл. 13.10.1998. 7. Пат. WO2006070776(Al) JP, МКИ4, С07К16/36; C12N15/10; C12N15/02; G01N33/53; G01N33/577; C12P21/08; C07K16/18. Anti-human soluble fibrin monoclonal antibody and immunological assay method using the antibody // Matsuo M, Ebinuma H., Miyazaki O., Tanaka K., Suzuki A. Опубл. 06.07.2006. 8. Пат. ЕР 1 832 654 Al, JP, МКИ4, С07К16/36; C12N5/10; C12N15/02; G01N33/53; G01N33/577; С12Р21/08. Anti-human soluble fibrin monoclonal antibody and immunological assay method using the antibody // Matsuo M., Ebinuma H., Miyazaki O., Tanaka K., Suzuki A. - Опубл. 12.09.2007. 9. Пат. 6451545 US, МКИ4, G01N33/543, G01N33/577. Monoclonal antibody specific to antihuman fibrin monomer, process producing rhe same, hybridomas, and immunoassay method // Tanaka S., Hamano Α., Umeda M. -Опубл. 17.09.2002. 10. Belitser V.A., Varetskaja T.V., Malneva G.V. Fibrinogen-fibrin interaction // Biochim. Biophys. Acta. - 1968. - 154. - P. 376-380. 11. Kohler G., Milstein C, Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. - 1975. - 256. - P. 495 - 497. 12. Lerner E.A., How to make a hybridoma // Yale j Biology and medicine. -1981.-54.-P. 387-402. 9 87375 13. Marder V.G., Budzynski A.Z., Barlow G.H., Comparison of the physiochemical properties of fragment D derivatives of fibrinogen and fragment DD of cross-linked fibrin // Biochim. et biophys. acta. 1976. - 427. - P. 1- 14. 14. Varetskaya T.V. Microheterogeneity of fibrinogen. Cryofibrinogen // Укр. біохім. журн. 1960. - 32. - P. 13-24. 15. Lugovskoi E.V., Gogolinskaya G.K., Preparation of fibrin desAA by trombin // Ukr. Biochem. J. - 1999. - 71, №4. - P. 107 - 108. Комп’ютерна верстка Л. Купенко 10 16. Пат. № 73232, UA, МІЖ, 7 C12N5/18, C12P21/08. Штам гібридом них тваринних клітин MUS MUSCULUS L. - продуцент моноклональних антитіл, які специфічно реагують з епітопом Nкінцевої ділянки γ-ланцюга D-димеру фібрину та D-фрагмента фібриногену людини // Комісаренко СВ., Колеснікова І.М., Луговський Е.В., Ляшко К.Д., Литвинова Л.М., Костюченко О.П., Гоголінська Г.К., Гриценко П.Г. -Заявл. 28.07. 2003. - Опубл. 15.06.2005, Бюл. №6. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601