Спосіб отримання трансферфакторних поліпептидів з певною специфічністю

Реферат: UA 88026 U UA 88026 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема до онкології, і може бути використана при отриманні препаратів для імунотерапії хворих онкологічного профілю. Трансферфакторні поліпептиди (ТФП) являють собою низькомолекулярні поліпептиди (3-12 кД) [1] Т-клітинного походження, які здатні афінно зв'язуватись з гомологічним антигеном [2] і переносити клітинно-опосередковану імунну реакцію на антиген від імунного донора до неімунного реципієнта [3]. Здатність тварин синтезувати ТФП рестриктована молекулами головного комплексу гістосумісності, проте перенос антигенспецифічної імунореактивності за допомогою ТФП генетично необмежений [4]. Не виключено, що крім Т-лімфоцитів, ТФП можуть продукувати всі або майже всі імунокомпетентні клітини [5]. Клінічними дослідженнями із застосуванням ТФП доведено, що такий препарат може бути ефективним засобом імунотерапії хворих з широким спектром імунопатології, включаючи рецидивуючі та дисеміновані інфекції [6,7]. Дослідники, що вивчали ефективність ТФП в імунотерапії онкологічних хворих, застосовували як неспецифічні препарати, отримані з лейкомаси донорів [8] чи осіб, що перебували в контакті з онкохворими [9], так і специфічні, отримані з лейкоцитів онкологічних хворих [10]. Разом з тим, для проведення імунотерапії хворих дуже важливо мати достатню кількість ТФП визначеної антигенної специфічності. За прототип вибрано спосіб отримання ТФП з лімфоцитів щурів [Патент на корисну модель № 43728, UA, МПК А61К 35/28. Спосіб отримання фактора переносу, специфічного до клітин ксеногенної пухлини / заявник та патентовласник ДУ "Національний інститут раку" (UA). - № u200903731; заявл. 29.04.2009; опубл. 25.08.2009, бюл №16], за яким низькомолекулярну речовину з лімфоцитів селезінки щурів, імунізованих внутрішньоочеревинним введенням живих ксеногенних пухлинних клітин мишачої карциноми легені Льюїс, отримували на 14-у добу після імунізації. Потім препарат заморожували і зберігали до часу використання. За допомогою цієї речовини авторам вдалося перенести імунну реакцію на пухлинні клітини в системі in vitro та in vivo. Позитивним у прототипі є розробка технології отримання ТФП, специфічних до клітин ксеногенної пухлини, що дає можливість отримати препарат ТФП проти конкретної пухлини для використання в імунотерапії. Недоліком прототипу є неможливість отримання достатньої кількості препарату ТФП для проведення декількох курсів імунотерапії. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб отримання трансферфакторних поліпептидів з певною специфічністю шляхом їх виділення із клітин курячих ембріонів, в які попередньо були введені зразки пухлиноспецифічних ТФП, що дасть можливість отримати достатню кількість препарату ТФП, специфічних до конкретної пухлини для використання в імунотерапії онкологічного хворого. Поставлена задача вирішується таким чином: Інтактним щурам одноразово внутрішньоочеревинно вводять суспензію свіжовиділених 6 клітин меланоми В16 (MB 16) в кількості 2×10 клітин/на тварину в об'ємі 0,2 мл забуференого фізіологічного розчину (ЗФР). На 14-у добу після імунізації під ефірним наркозом тварин умертвляють та видаляють селезінку, тканину якої піддають механічній дезінтеграції та фільтрації крізь капронове сито. Еритроцити лізують 0,83 % розчином хлористого амонію впродовж 8 хв при 4 С. Після дворазового відмивання в ЗФР за допомогою центрифугування 8 (200 g, 10 хв) осад лімфоцитів (5×10 ) ресуспендують в ЗФР та піддають п'ятиразовому замороженню/відтаюванню відповідно при мінус 20 °C/37 °C. Деполімеризацію всієї позаклітинної ДНК здійснюють за допомогою інкубації з панкреатичною ДНК-азою (1 мг/мл), активованою іонами магнію впродовж 30 хв. при 37 °C, після чого зразки центрифугують при 5000 g 20 хв і ультрафільтрують. Ультрафільтрацію проводять на конічних фільтрах "Centriflo25" з номінальною відсічною молекулярною масою 25 кД ("Amicon", США) за допомогою центрифугування протягом 25 хв при 400 g. Після ультрафільтрації в кожній з фракцій визначають вміст загального білка за методом Бредфорда [12] для їх стандартизації. Отриману низькомолекулярну фракцію стерилізують за допомогою мікрофільтрації крізь мембрану з діаметром пор 0,22 мкм ("Millipor", США). Після цього в алантоїсний мішок яєць з 9-денними курячими ембріонами вводять 100 пг отриманого зразка пухлиноспецифічних ТФП в 100 мкл ЗФР. На 15-у добу ембріонального розвитку проводять механічну дезінтеграцію курячих ембріонів в стерильних умовах. Після дворазового відмивання в ЗФР за допомогою центрифугування (200 g, 10 хв) осад клітин ресуспендують в ЗФР, виходячи з пропорції 10 клітин/мл. Отримані від кожного ембріона клітини об'єднують в пул та заморожують при мінус 20 °C. Для руйнування клітин проводять п'ятиразове заморожування-відтаювання при мінус 20 °C/37 °C, відповідно. Деполімеризацію всієї позаклітинної ДНК проводять панкреатичною ДНК-азою (1 мг/мл) при 37 С упродовж 30 хв в присутності іонів магнію. Після цього зразок ТФП 1 UA 88026 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 центрифугують при 5000 g упродовж 20 хв та ультрафільтрують крізь мембрану Centriflo CF-25 ("Amicon", США). В отриманому зразку ТФП досліджують концентрацію білка за методом Бредфорда [12], стерилізують за допомогою мікрофільтрації крізь мембрану з діаметром пор 0,22 мкм ("Мі Пірог", США), заморожують та зберігають при мінус 20 °C для подальшого тестування. Специфічність зразка ТФП щодо клітин MB 16, отриманого із клітин курячих ембріонів, в які попередньо було введено зразок пухлиноспецифічних ТФП, підтверджується реакцією проліферації лімфоцитів в присутності відповідного антигену після впливу на ці лімфоцити пухлиноспецифічного зразка ТФП в системі in vitro та in vivo. Прикладом реалізації заявленого способу може вважатися результат отримання зразка ТФП із клітин курячих ембріонів, в які попередньо було введено зразок пухлиноспецифічних ТФП, та експериментальне підтвердження специфічності його дії. І. Інтактним щурам одноразово внутрішньоочеревинно ввели суспензію свіжовиділених і (отриманих шляхом механічної дезінтеграції) клітин MB 16 в кількості 2 × 10 клітин/на тварину в об'ємі 0,2 мл ЗФР. На 14-у добу після імунізації під ефірним наркозом тварин умертвили та видалили селезінку, тканину якої піддали механічній дезінтеграції та фільтрації крізь капронове сито. Еритроцити лізували 0,83 % розчином хлористого амонію впродовж 8 хв при +4 С. Після дворазового відмивання в ЗФР за допомогою центрифугування (200 g, 10 хв) осад лімфоцитів (5 × 10) ресуспендували в ЗФР та піддали п'ятиразовому замороженню/відтаюванню відповідно при мінус 20 °C/37 °C. Деполімеризацію всієї позаклітинної ДНК здійснювали за допомогою інкубації з панкреатичною ДНК-азою (1 мг/мл), активованою іонами магнію впродовж 30 хв при 37 °C, після чого зразок центрифугували при 5000 g 20 хв і ультрафільтрували. Ультрафільтрацію проводили на конічному фільтрі "Centriflo-25" з номінальною відсічною молекулярною масою 25 кД ("Amicon", США) за допомогою центрифугування протягом 25 хв при 400 g. Після ультрафільтрації вміст загального білку складав 11,7 мкг/мл. Отриману низькомолекулярну фракцію стерилізували за допомогою мікрофільтрації крізь мембрану з діаметром пор 0,22 мкм ("Millipor", США). Після цього в алантоїсний мішок яєць з 9-денними курячими ембріонами вводили 100 пг отриманого зразка пухлиноспецифічних ТФП в 100 мкл ЗФР. На 15-у добу ембріонального розвитку механічно дезінтегрували курячі ембріони в стерильних умовах. Після дворазового відмивання в ЗФР за допомогою центрифугування (200 g, 10 хв) осад клітин ресуспендували в ЗФР, виходячи з пропорції 10 клітин/мл. Отримані від кожного ембріона клітини об'єднали в пул та заморозили при мінус 20 °C. Для руйнування клітин провели п'ятиразове заморожування-відтаювання при мінус 20 °C / 37 °C, відповідно. Позаклітинну ДНК деполімеризували панкреатичною ДНК-азою (1 мг/мл) при 37 С упродовж 30 хв в присутності іонів магнію. Після цього зразок ТФП центрифугували при 5000 g упродовж 20 хв та ультрафільтрували крізь мембрану Centriflo CF-25 ("Amicon", США). В отриманому з клітин курячих ембріонів зразку ТФП концентрація білка склала 4,75 мкг/мл. Отриману низькомолекулярну фракцію стерилізували за допомогою мікрофільтрації крізь мембрану з діаметром пор 0,22 мкм ("Millipor", США), розфасували в стерильні ампули і зберігали при мінус 20 °C для подальшого тестування. Специфічність зразка ТФП щодо клітин MB 16, отриманого із клітин курячих ембріонів, в які попередньо було введено зразок специфічних ТФП, підтверджується результатами реакції проліферації лімфоцитів в присутності відповідного антигену. В системі in vitro після внесення 10 пг пухлиноспецифічного зразка ТФП в змішану культуру лімфоцитів мишей лінії C57BL/6 і клітин MB 16 спостерігається суттєво активніша проліферація лімфоцитів: проліферативний індекс (ПІ) складає (57,0±0,1) % в порівнянні із дією неспецифічного зразка ТФП (ПІ складає (26,5±0,3) %, р