Спосіб детекції трансформаційної події gt73 ріпаку методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб детекції трансформаційної події ріпаку GT73 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; синтез фрагментів цільових генів. Для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пари олігонуклеотидних праймерів, специфічні до трансформаційної події GT73 (1 мкМ GT1F; 1 мкМ GT1R), до гену СР4 epsps, який відповідає за стійкість рослин до гліфосату (0,25 мкМ 4EPSPSF; 0,25 мкМ 4EPSPSR), та пару праймерів до фрагмента власного гену ріпаку ацетил-коензим А карбоксилази (0,75 мкМ асс2; 0,75 мкМ асс3), та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв при 94 °С; 34 цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °С, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 62 °С, синтез фрагментів цільових генів протягом 30 сек. при 72 °С; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °С. UA 88203 U (54) СПОСІБ ДЕТЕКЦІЇ ТРАНСФОРМАЦІЙНОЇ ПОДІЇ GT73 РІПАКУ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЇ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ UA 88203 U UA 88203 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетичної інженерії та молекулярної біології і може бути застосована для детекції та дослідницьких робіт по вивченню трансформаційної події GT73, яка несе гени, які кодують гліфосат-толерантну ізоформу ферменту 5-енолпірувілшикімат-3-фосфат синтази (EPSPS) Agrobacterium tumefaciens штаму СР4 та фермент гліфосат оксидоредуктазу Ochrobacterium anthropi відповідно, у генетично модифікованого ріпаку, та для детекції таких рослин у навколишньому середовищі. Гени СР4 epsps та goxv247 трансформаційної події GT73 знаходяться під контролем 35 S промоторів вірусу мозаїки норичнику (FMV) та кодують гліфосат-толерантну ізоформу ферменту 5-енолпірувілшикімат-3-фосфат синтази EPSPS та фермент гліфосат оксидоредуктазу, який надають рослині стійкості до гербіцидів на основі гліфосату [1]. Одним з основних методів виявлення генетично модифікованих організмів є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Вона передбачає ампліфікацію за допомогою ДНК-полімерази ділянки ДНК, яка обмежена двома різноспрямованими олігонуклеотидними праймерами [2]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило цю методику зручною та загальновживаною [3]. Відомо, що для детекції чужорідних генів широко використовують мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію, яка передбачає синтез в одній реакції декількох ділянок ДНК, обмежених різними парами праймерів [4]. Для гену або цільової ділянки ДНК підбирають пари праймерів, за допомогою яких проводять ампліфікацію необхідних ділянок характерної довжини для ідентифікації після розділення методом електрофорезу в агарозному гелі. Для контролю якості виділеної ДНК проводять ампліфікацію фрагментів власних генів рослин (внутрішній позитивний контроль). В якості негативного контролю використовують очищену загальну ДНК нетрансгенної рослини ріпаку. Найближчим аналогом запропонованої корисної моделі є спосіб детекції трансформаційної події ріпаку GT73 разом з трьома трансформаційними подіями Оху 235 (відповідає за стійкість до гербіцидів на основі оксинілу) та MS8/RF3 і HCN92/28 (відповідають за стійкість до гербіцидів на основі фосфінотрицину) методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням специфічних олігонуклеотидних праймерів до трансформаційних подій та однієї пари праймерів, специфічної до референтного гену ріпаку - ацетил-коензим А карбоксилази [5]. Згідно з цим методом для проведення мультиплексної ПЛР здійснюють ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 5 хв. при 95 °C; 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 95 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 1 хвилину при 61 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 30 секунд при 72 °C; кінцевий синтез фрагментів ДНК протягом 10 хв при 72 °C. Ампліфіковані фрагменти розділяють методом електрофорезу в агарозному гелі (1,2 %) протягом 1 години при напрузі 150 В і витримують у бромистому етидії для візуалізації. Застосування методу, який є найближчим аналогом запропонованої корисної моделі, дозволяє виявляти одночасно чотири трансформаційні події ріпаку, що дозволяє зменшити затрати часу та реактивів, а також референтний ген як внутрішній позитивний контроль. Недоліком даного найближчого аналогу є використання однієї пари праймерів до кожної трансформаційної події та її структурних частин, що при можливій неспецифічній посадці (локалізації) створює ймовірність отримання хибно-позитивних результатів або при деградації праймерів - недостовірний негативний результат. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача удосконалення та деталізації способу якісної детекції трансформаційної події GT73 для зменшення вірогідності отримання хибно-позитивних сигналів, яка вирішується шляхом використання специфічної до генетичної конструкції пари праймерів (GT1F та GT1R), специфічної пари праймерів (4EPSPSF та 4EPSPSR) до гену СР4 epsps, що входить до конструкції та надає стійкість до дії гліфосату, та специфічної до референтного гену ріпаку ацетил-коензим А карбоксилази пари праймерів (асс2 та асс3). Поставлена задача вирішується тим, що використовують спосіб детекції трансформаційної події ріпаку GT73 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів, у якому новим є те, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пару олігонуклеотидних праймерів, специфічних до трансформаційної події GT73 (1 мкМ GT1F; 1 мкМ GT1R), до гену, що входить до конструкції, якою відбувалась трансформація (0,25 мкМ 4EPSPSF; 0,25 мкМ 4EPSPSR), та пару праймерів до фрагмента власного гену ріпаку ацетилкоензим А карбоксилази (0,75 мкМ асс2; 0,75 мкМ асс3), та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 34 циклів, кожен з яких 1 UA 88203 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 62 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 30 сек. при 72 °C; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв при 72 °C. Перевага запропонованої корисної моделі у порівнянні з прототипом полягає у зменшенні ймовірності отримання хибно-позитивних результатів за рахунок використання пари праймерів до гену СР4 epsps, який входить до складу генетичної конструкції. Для проведення ПЛР використовують праймери наступних нуклеотидних послідовностей: 1. Для ампліфікації фрагменту ДНК, який складається з фланкуючої ділянки рослинної ДНК та 35S промотору вірусу мозаїки норичнику генетичної конструкції, якою проводилась трансформація [6] • GT1F 5' - TGA ACT ТТС СТТ ТАТ GTA АТТ ТТС CAG АА - 3' • GT1R 5' - GCT TATACG AAG GCA AGA ААА GGA-3' 2. Для ампліфікації фрагменту ДНК, який обмежений ділянками гену СР4 epsps [7] • 4EPSPSF 5' - САА CGC ААА ТСТ ССС ТТА TCG G-3' • 4EPSPSR 5' - GAC СТС САА АСА TGA AGG АСС Τ - 3' • Для ампліфікації фрагменту власного гену ріпаку ацетил-коензим А карбоксилази • асс2 5' - GGC GCA GCA TCG GCT - З' • асс3 5' - GAG ААТ GAG GAG GAC САА GC ТС - 3' [8]. У триплексній ПЛР одночасно використовують вищенаведені пари праймерів у наступних концентраціях: 1 мкМ GT1F; 1 мкМ GT1R; 0,25 мкМ 4EPSPSF; 0,25 мкМ 4EPSPSR; 0,75 мкМ асс2; 0,75 мкМ асс3. Відповідно до запропонованої корисної моделі для здійснення ампліфікації фрагментів цільових генів послідовно виконують наступні дії: 1. Проводять денатурацію рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 2. Проводять 34 цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 62 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 30 сек. при 72 °C; 3. Проводять кінцевий синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °C. Продукти ПЛР являють собою фрагменти цільових генів, які мають характерну довжину, що дозволяє розрізнити їх після електрофоретичного розділення в агарозному гелі (1,2 %) з бромистим етидієм при напрузі електричного поля 3,5 В/см: фрагмент власного гену ріпаку ацетил-коензим А карбоксилази розміром 196 пар основ (п.о.); фрагмент гену СР4 epsps, що входить до складу конструкції, розміром 273 п.о; фрагмент ДНК розміром 522 п.о., який складається з фланкуючої ділянки рослинної ДНК та ділянки ДНК генетичної конструкції, якою проводилась трансформація. Також на електрофореграмі виявляється фрагмент довжиною 1100 п.о., утворений в результаті синтезу ділянки, яка обмежена праймерами з різних пар, що додатково свідчить про наявність трансформаційної події GT73 у зразку ДНК. Технічним результатом від реалізації запропонованої корисної моделі є чотири ампліфіковані фрагменти цільових послідовностей з ДНК ріпаку при використанні трьох пар специфічних праймерів, що дозволяє визначити наявність у геномі рослини трансформаційної події GT73, засвідчити присутність ядерної ДНК ріпаку у препараті та придатність препарату ДНК для проведення ПЛР. Бажаний результат досягають внаслідок використання для мультиплексної ПЛР розробленого набору праймерів та підібраних умов для ампліфікації цільових фрагментів ДНК. Запропонований спосіб детекції трансформаційної події GT73, яка містить ген СР4 epsps з Agrobacterium tumefaciens, у комплексному препараті ДНК рослин методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції має переваги у значній економії затрат часу, реактивів, робочого навантаження та можливості достовірної детекції трансгенів у комплексних препаратах ДНК. 50 55 Джерела використаної інформації: [1] Center for Environmental Risk Assessment (CERA). GM Crop Database. Режим доступу: http://www.cera-gmc.org. [2] Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p. 1350-1354. [3] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / RK Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, and HA Erlich // Science, 1988, v. 239, p. 487-491. 2 UA 88203 U 5 10 [4] Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification / JS Chamberlain, RA Gibbs, JE Ranier, PN Nguyen, CT Caskey // Nucleic Acids Research, 1988, № 16 (23), p. 11 Hill 156. [5] Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean, and canola by multiplex PCR analysis / D James, AM Schmidt, Ε Wall, Μ Green, S Masri // J. Agric. Food Chem, 2003, № 51, p. 5829-5834. -прототип. [6] European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EU-RL GMFF). EU Database of Reference Methods for GMO Analysis. Режим доступу: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu. [7] GMO Detection Method Database (GMDD). Режим доступу: http://gmdd.shgmo.org. [8] A rapeseed-specific gene, acetyl-CoA carboxylase, can be used as a reference for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes from mixed food samples / Μ Hernandez, A Rio, Τ Esteve, S Prat, Μ Pla // J. Agric. Food Chem, 2001, № 49, p. 3622-3627. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб детекції трансформаційної події ріпаку GT73 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; синтез фрагментів цільових генів, який відрізняється тим, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пари олігонуклеотидних праймерів, специфічні до трансформаційної події GT73 (1 мкМ GT1F; 1 мкМ GT1R), до гену СР4 epsps, який відповідає за стійкість рослин до гліфосату (0,25 мкМ 4EPSPSF; 0,25 мкМ 4EPSPSR), та пару праймерів до фрагмента власного гену ріпаку ацетил-коензим А карбоксилази (0,75 мкМ асс2; 0,75 мкМ асс3), та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв при 94 °С; 34 цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °С, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 62 °С, синтез фрагментів цільових генів протягом 30 сек. при 72 °С; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °С. 30 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3