Спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи nk603 методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи NK603 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів. Для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пару олігонуклеотидних праймерів, специфічних до ділянки з'єднання на 5'-кінці трансформаційної події NK603 (0,45 мкМ SEQ ID NO 13; 0,45 мкМ SEQ ID NO 14), пару праймерів, специфічних до ділянки з'єднання на 3'-кінці трансформаційної події NK603 (0,45 мкМ NK603F; 0,45 мкМ NK603R), і пару праймерів до фрагмента власного гена кукурудзи adh-1 (0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-Rl). UA 77768 U (12) UA 77768 U UA 77768 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетичної інженерії та молекулярної біології і може бути застосована для детекції генетично модифікованої кукурудзи в навколишньому середовищі та дослідницьких робіт по вивченню трансформаційної події NK603, яка містить ген СР4 epsps, що кодує толерантну до гербіцидів на основі гліфосату форму ферменту 5-енолпірувілшикімат-3фосфат-синтази (EPSPS). Рослинна форма EPSPS бере участь в біосинтезі ароматичних амінокислот (тирозину, фенілаланіну, триптофану) і може специфічно зв'язуватись та інактивуватись гліфосатом. Ген СР4 epsps, який кодує толерантну до гліфосату форму ферменту, був виділений з ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens штаму СР4 і перенесений в геном кукурудзи. Подія NK603 містить дві копії гена СР4 epsps. Експресія першої копії регулюється за допомогою промотору актину рису 1 і NOS-термінатору, друга копія знаходиться під контролем 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти і NOS-термінатору [І]. Одним з основних методів виявлення генетично модифікованих організмів є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Вона передбачає ампліфікацію за допомогою ДНК-полімерази ділянки ДНК, яка обмежена двома різноспрямованими олігонуклеотидними праймерами [2]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило цю методику зручною та загальновживаною [3]. Відомо, що для детекції чужорідних генів широко використовують мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію, яка передбачає синтез в одній реакції декількох ділянок ДНК, обмежених різними парами праймерів [4]. Для гена або цільової ділянки ДНК підбирають пари праймерів, за допомогою яких проводять ампліфікацію необхідних ділянок характерної довжини для ідентифікації після розділення методом електрофорезу в агарозному гелі. Для контролю якості виділеної ДНК проводять ампліфікацію фрагментів власних генів рослин (внутрішній позитивний контроль). Як негативний контроль використовують очищену загальну ДНК нетрансгенної рослини кукурудзи. Прототипом запропонованої корисної моделі є спосіб детекції трансформаційних подій кукурудзи MON810 та NK603 методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням двох пар специфічних до трансформаційних подій MON810 та NK603 олігонуклеотидних праймерів та однієї пари праймерів, специфічної до референтного гена кукурудзи - zein [5]. Згідно з цим методом для проведення мультиплексної ПЛР здійснюють ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 5 хв. при 95 °C; 40 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек при 95 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 10 сек при 58 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 10 секунд при 72 °C; кінцевий синтез фрагментів ДНК протягом 7 хв. при 72 °C. Ампліфіковані фрагменти розділяють методом електрофорезу в агарозному гелі (2 %) протягом 30 хв. при напрузі 100 В і витримують у етидіумі броміді для візуалізації. Застосування методу, який є прототипом запропонованої корисної моделі, дозволяє виявляти одночасно дві трансформаційні події кукурудзи, що дозволяє зменшити затрати часу та реактивів, а також референтний ген кукурудзи як внутрішній позитивний контроль. Недоліком даного прототипу є використання однієї пари праймерів до трансформаційної події NK603, що при можливій неспецифічній посадці створює ймовірність отримання хибнопозитивних результатів або при деградації праймерів - недостовірний негативний результат. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача удосконалення способу якісної детекції трансформаційної події NK603 для зменшення вірогідності отримання хибнопозитивних сигналів, яка вирішується шляхом використання двох пар специфічних до трансформаційної події праймерів (SEQIDNO13 та SEQIDNO14; NK603F та NK603R) та специфічної до референтного гену кукурудзи adh-1 пари праймерів (Adh-F3 та Adh-Rl). Поставлена задача вирішується тим, що використовують спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи NK603 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів, у якому новим є те, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пару олігонуклеотидних праймерів, специфічних до ділянки з'єднання на 5'-кінці трансформаційної події NK603 (0,45 мкМ SEQIDNO13; 0,45 мкМ SEQIDNO14), пару праймерів, специфічних до ділянки з'єднання на 3'-кінці трансформаційної події NK603 (0,45 мкМ NK603F; 0,45 мкМ NK603R) та пару праймерів до фрагмента власного гена кукурудзи adh-1 (0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-R1), та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами 1 UA 77768 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 протягом 30 сек. при 56 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 33 сек. при 72 °C; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °C. Перевага запропонованої корисної моделі в порівнянні з прототипом полягає у зменшенні ймовірності отримання хибно-позитивних результатів за рахунок використання двох пар специфічних праймерів до трансформаційної події кукурудзи NK603. Для проведення ПЛР використовують праймери наступних нуклеотидних послідовностей: 1. Для ампліфікації фрагменту ДНК, який складається з 5'-фланкуючої ділянки рослинної ДНК та фрагменту промотору актину рису 1 (P-ractl) [6] SEQ ID NO 13 5'-AATCGATCCAAAATCGCGACTG-3' SEQ ID NO 14 5'-TTCACTTTGGGCCACCTTTAT-3' 2. Для ампліфікації фрагменту генетичної конструкції та 3'-фланкуючої, ділянки рослинної ДНК [7] NK603F 5'-ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA-3' NK603R 5'-AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT-3' 3. Для ампліфікації фрагменту власного гена кукурудзи adh-1 Adh-F3 5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3' Adh-R1 5'-GACAGAGGAGAAACAAGGCG-3' У триплексній ПЛР одночасно використовують вищенаведені пари праймерів у наступних концентраціях: 0,45 мкМ SEQIDNO13; 0,45 мкМ SEQ ID NO 14; 0,45 мкМ NK603F; 0,45 мкМ NK603R; 0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-R1. Відповідно до запропонованої корисної моделі для здійснення ампліфікації фрагментів цільових генів послідовно виконують наступні дії: 1. Проводять денатурацію рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 2. Проводять 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек при 56 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 33 сек при 72 °C; 3. Проводять кінцевий синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °C. Продукти ПЛР являють собою фрагменти цільових генів, які мають характерну довжину, що дозволяє розрізнити їх після електрофоретичного розділення в агарозному гелі (2 %) з етидіум бромідом при напрузі електричного поля 3,5 В/см: фрагмент ДНК розміром 498 пар основ (п.о.), який складається з 5'-фланкуючої ділянки рослинної ДНК та ділянки ДНК генетичної конструкції, якою проводилась трансформація; фрагмент власного гена кукурудзи adh-і розміром 231 п.о.; фрагмент ДНК, який складається з 3'-фланкуючої ділянки рослинної ДНК та ділянки ДНК генетичної конструкції, розміром 108 п.о. Також на електрофореграмі виявляється фрагмент довжиною 372 п.о., утворений в результаті синтезу ділянки, яка обмежена праймерами з різних пар (SEQ ID NO 13 та NK603F), що додатково свідчить про наявність трансформаційної події NK603 у зразку ДНК. Технічним результатом від реалізації запропонованої корисної моделі є чотири ампліфіковані фрагменти цільових послідовностей з ДНК кукурудзи при використанні трьох пар специфічних праймерів, що дозволяє визначити наявність у геномі рослини трансформаційної події NK603, засвідчити присутність ядерної ДНК кукурудзи у препараті та придатність препарату ДІЖ для проведення ПЛР. Бажаний результат досягають внаслідок використання для мультиплексної ПЛР розробленого набору праймерів та підібраних умов для ампліфікації цільових фрагментів ДНК. Запропонований спосіб детекції трансформаційної події NK603 з геном СР4 epsps, який кодує толерантну до гербіцидів на основі гліфосату форму ферменту 5-енолпірувілшикімат-3фосфат-синтази (EPSPS), у комплексному препараті ДНК рослин методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції має переваги у значній економії затрат часу, реактивів, робочого навантаження та можливості достовірної детекції трансгенів у комплексних препаратах ДНК. Джерела інформації: 1. Center for Environmental Risk Assessment (CERA). GM Crop Database. Режим доступу: http://www.cera-gmc.org. 2. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia/ RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p. 1350-1354. 3. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / RK Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, and HA Erlich // Science, 1988, v. 239, p. 487-491. 2 UA 77768 U 5 10 4. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification / JS Chamberlain, RA Gibbs, JE Ranier, PN Nguyen, CT Caskey // Nucleic Acids Research, 1988, № 16 (23), p. 11141-11156. 5. Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods / Hsin-Ying Huang, Tzu-Ming Pan // J. Agric. Food Chem, 2004, № 52, p. 3264-3268. - прототип. 6. US patent US 2002/0013960 Al. Corn event PV-ZMGT32 (NK603) and compositions and methods for detection thereof / Carl Frederick Behr et al-pub. date Jan. 31,2002-14 p. 7. European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EU-RL GMFF). EU Database of Reference Methods for GMO Analysis. Режим доступу: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи NK603 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів, який відрізняється тим, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пару олігонуклеотидних праймерів, специфічних до ділянки з'єднання на 5'-кінці трансформаційної події NK603 (0,45 мкМ SEQ ID NO 13; 0,45 мкМ SEQ ID NO 14), пару праймерів, специфічних до ділянки з'єднання на 3'-кінці трансформаційної події NK603 (0,45 мкМ NK603F; 0,45 мкМ NK603R), і пару праймерів до фрагмента власного гена кукурудзи adh-1 (0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-Rl) та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек при 56 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 33 сек при 72 °C; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °C. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3