Спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи mon810 методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи MON810 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів. Для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пари олігонуклеотидних праймерів, специфічні до трансформаційної події MON810 (0,25 мкМ VM01; 0,25 мкМ VM03), до генетичної конструкції, якою відбувалась трансформація (0,45 MicMmgl; 0,45 мкМ mg2), і пару праймерів до фрагмента власного гена кукурудзи adh-1 (0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-Rl). UA 77769 U (12) UA 77769 U UA 77769 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до генетичної інженерії та молекулярної біології і може бути застосована для детекції та дослідницьких робіт по вивченню трансформаційної події MON810, яка несе ген crylAb з Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, що кодує CrylAb дельта-ендотоксин, у генетично модифікованої кукурудзи, та для детекції таких рослин у навколишньому середовищі. Ген crylAb трансформаційної події MON810 знаходиться під контролем 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти та кодує CrylAb дельта-ендотоксин, який надає рослині резистентності до європейського кукурудзяного метелика (ЕСВ; Ostrinia nubilalis), основної комахи-шкідника кукурудзи в сільському господарстві [1]. Одним з основних методів виявлення генетично модифікованих організмів є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Вона передбачає ампліфікацію за допомогою ДНК-полімерази ділянки ДНК, яка обмежена двома різноспрямованими олігонуклеотидними праймерами [2]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило цю методику зручною та загальновживаною [3]. Відомо, що для детекції чужорідних генів широко використовують мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію, яка передбачає синтез в одній реакції декількох ділянок ДНК, обмежених різними парами праймерів [4]. Для гену або цільової ділянки ДНК підбирають пари праймерів, за допомогою яких проводять ампліфікацію необхідних ділянок характерної довжини для ідентифікації після розділення методом електрофорезу в агарозному гелі. Для контролю якості виділеної ДНК проводять ампліфікацію фрагментів власних генів рослин (внутрішній позитивний контроль). Як негативний контроль використовують очищену загальну ДНК нетрансгенної рослини кукурудзи. Прототипом запропонованої корисної моделі є спосіб детекції трансформаційних подій кукурудзи MON810 та NK603 методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням двох пар специфічних до трансформаційних подій MON810 та NK603 олігонуклеотидних праймерів та однієї пари праймерів, специфічної до референтного гена кукурудзи - zein [5]. Згідно з цим методом для проведення мультиплексної ПЛР здійснюють ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 5 хв при 95 °C; 40 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 95 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 10 сек. при 58 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 10 секунд при 72 °C; кінцевий синтез фрагментів ДНК протягом 7 хв. при 72 °C. Ампліфіковані фрагменти розділяють методом електрофорезу в агарозному гелі (2 %) протягом 30 хвилин при напрузі 100 В і витримують у етидіум броміді для візуалізації. Застосування методу, який є прототипом запропонованої корисної моделі, дозволяє виявляти одночасно дві трансформаційні події кукурудзи, що дозволяє зменшити затрати часу та реактивів, а також референтний ген кукурудзи як внутрішній позитивний контроль. Недоліком даного прототипу є використання однієї пари праймерів до трансформаційної події MON810, що при можливій неспецифічній посадці (локалізації) створює ймовірність отримання хибно-позитивних результатів або при деградації праймерів - недостовірний негативний результат. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача удосконалення способу якісної детекції трансформаційної події MON810 для зменшення вірогідності отримання хибнопозитивних сигналів, яка вирішується шляхом використання специфічної до трансформаційної події пари праймерів (VM01 та VM03), специфічної до генетичної конструкції пари праймерів (mgl та mg2) та специфічної до референтного гену кукурудзи adh- і пари праймерів (Adh-F3 та Adh-Rl). Поставлена задача вирішується тим, що використовують спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи MON810 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів, у якому новим є те, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пари олігонуклеотидних праймерів, специфічні до трансформаційної події MON810 (0,25 мкМ VM01; 0,25 мкМ VM03), до генетичної конструкції, якою відбувалась трансформація (0,45 MKMmgl; 0,45 мкМ mg2), і пару праймерів до фрагмента власного гена кукурудзи adh-1 (0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-Rl) та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 57 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 27 сек. при 72 °C; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °C. 1 UA 77769 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Перевага запропонованої корисної моделі в порівнянні з прототипом полягає у зменшенні ймовірності отримання хибно-позитивних результатів за рахунок використання двох пар праймерів до трансформаційної події кукурудзи MON810. Для проведення ПЛР використовують праймери наступних нуклеотидних послідовностей: 1. Для ампліфікації фрагменту ДНК, який складається з фланкуючої ділянки рослинної ДНК та 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти генетичної конструкції, якою проводилась трансформація [6] VM01 5'-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG-3' VM03 5'-TCCATCTTTGGGACCACTGTCG-3' 2. Для ампліфікації фрагменту ДНК, який складається з 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти та ділянки інтрону hsp70 [7] Mg1 5'-TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC-3' mg2 5'-TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT-3' 3. Для ампліфікації фрагменту власного гена кукурудзи adh-1 Adh-F3 5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3' Adh-R1 5'-GACAGAGGAGAAACAAGGCG-3'. У триплексній ПЛР одночасно використовують вищенаведені пари праймерів у наступних концентраціях: 0,25 мкМ VM01; 0,25 мкМ VM03; 0,45 мкМ mgl; 0,45 мкМ mg2; 0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-R1. Відповідно до запропонованої корисної моделі для здійснення ампліфікації фрагментів цільових генів послідовно виконують наступні дії: 1. Проводять денатурацію рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 2. Проводять 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 57 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 27 сек. при 72 °C; 3. Проводять кінцевий синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв при 72 °C. Продукти ПЛР являють собою фрагменти цільових генів, які мають характерну довжину, що дозволяє розрізнити їх після електрофоретичного розділення в агарозному гелі (2 %) з етидіум бромідом при напрузі електричного поля 3,5 В/см: фрагмент ДНК розміром 170 пар основ (п.о.), який складається з фланкуючої ділянки рослинної ДНК та ділянки ДНК генетичної конструкції, якою проводилась трансформація; фрагмент власного гена кукурудзи adh-1 розміром 231 п.о.; фрагмент ДНК генетичної конструкції розміром 401 п.о. Також на електрофореграмі виявляється фрагмент довжиною 645 п.о., утворений в результаті синтезу ділянки, яка обмежена праймерами з різних пар (VM01 та mg2), що додатково свідчить про наявність трансформаційної події MON810 у зразку ДНК. Технічним результатом від реалізації запропонованої корисної моделі є чотири ампліфіковані фрагменти цільових послідовностей з ДНК кукурудзи при використанні трьох пар специфічних праймерів, що дозволяє визначити наявність у геномі рослини трансформаційної події MON810, засвідчити присутність ядерної ДНК кукурудзи у препараті та придатність препарату ДНК для проведення ПЛР. Бажаний результат досягають внаслідок використання для мультиплексної ПЛР розробленого набору праймерів та підібраних умов для ампліфікації цільових фрагментів ДНК. Запропонований спосіб детекції трансформаційної події M0N810, яка містить ген crylAb з Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, у комплексному препараті ДНК рослин методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції має переваги у значній економії затрат часу, реактивів, робочого навантаження та можливості достовірної детекції трансгенів у комплексних препаратах ДНК. Джерела інформації: 1. Center for Environmental Risk Assessment (CERA). GM Crop Database. Режим доступу: http://www.cera-gmc.org. 2. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia/ RK Saiki, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich, and N Arnheim // Science, 1985, v. 230, p. 1350-1354. 3. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / RK Saiki, DH Gelfand, S Stoffel, SJ Scharf, R Higuchi, GT Horn, KB Mullis, and HA Erlich // Science, 1988, v. 239, p. 487-491. 4. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification / JS Chamberlain, RA Gibbs, JE Ranier, PN Nguyen, CT Caskey // Nucleic Acids Research, 1988, № 16 (23), p. 11141-11156. 2 UA 77769 U 5 5. Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods / Hsin-Ying Huang, Tzu-Ming Pan // J. Agric. Food Chem, 2004, № 52, p. 3264-3268. -прототип. 6. European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EU-RL GMFF). EU Database of Reference Methods for GMO Analysis. Режим доступу: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu. 7. GMO Detection Method Database (GMDD). Режим доступу: http://gmdd. shgmo. org. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб детекції трансформаційної події кукурудзи MON810 в генетично модифікованій рослині методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, для здійснення якого проводять денатурацію рослинної ДНК; цикли, кожен з яких включає денатурацію ДНК, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами, синтез фрагментів цільових генів; кінцевий синтез фрагментів цільових генів, який відрізняється тим, що для проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції використовують пари олігонуклеотидних праймерів, специфічні до трансформаційної події MON810 (0,25 мкМ VM01; 0,25 мкМ VM03), до генетичної конструкції, якою відбувалась трансформація (0,45 MicMmgl; 0,45 мкМ mg2), і пару праймерів до фрагмента власного гена кукурудзи adh-1 (0,20 мкМ Adh-F3; 0,20 мкМ Adh-Rl) та проводять ампліфікацію за наступних умов: денатурація рослинної ДНК протягом 4 хв. при 94 °C; 35 циклів, кожен з яких включає денатурацію ДНК протягом 30 сек. при 94 °C, ренатурацію рослинної ДНК з олігонуклеотидними праймерами протягом 30 сек. при 57 °C, синтез фрагментів цільових генів протягом 27 сек. при 72 °C; синтез фрагментів цільових генів протягом 10 хв. при 72 °C. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3