Спосіб діагностики мvx методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб діагностики MVX методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції належить до мікробіології. Технічний результат корисної моделі полягає в розробці власних праймерів та підтвердження ефективності способу діагностики. UA 68996 U (54) СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ МVX МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЇ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ UA 68996 U UA 68996 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель спосіб діагностики MVX методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) належить до галузі мікробіологія і може бути використана для діагностики MVX в їстівних грибах або інших біологічних об'єктах. Аналогом до запропонованого способу є підсумки наукового проекту з вивчення Mushroom Virus X, що виконувався Департаментом навколишнього середовища, продовольства і сільського господарства (Defra) урядового відомства Великобританії у 2001-2007рр., що включає відбір зразків, екстракцію кДНК із зразків, проведення полімеразної ланцюгової реакції, візуалізацію та аналіз результатів. ПЛР-ампліфікація об'ємом реакції 50 мкл включає: вода mQ, (33 мкл), 10х ПЛР-буфер (5 мкл), 75мм MgC12 (1,5мкл), 20мм dNTP (1 мкл), 20п/моль кожного з праймерів, 2,5 одиниць Taq ДНК-полімерази і 5 мкл кДНК. Умови реакції ампліфікації: 2 хв при +96 °C (1 цикл), 30 сек при +94 °C, 30 сек. при температурі +55 °C, 3 хв при 72 °C (30 циклів), 10 хв при 72 °C (1 цикл). Візуалізація продуктів ампліфікації проводиться в 1 % агарозному гелі з використанням ТАЕбуферу та бромистого етидію. Спільними суттєвими ознаками вищевказаного наукового проекту та запропонованої корисної моделі є відбір зразків, екстракція кДНК із зразків, проведення реакції зворотної транскрипції (RT-ПЛР), візуалізація та аналіз результатів. Проаналізувавши аналог, виявлено, що в даній методиці при проведенні ПЛР рекомендовано проводити відпал праймерів при температурі +55 °C. В той час, згідно характеристик вищевказаних праймерів оптимум відпалу знаходиться для АВ 18s_fl і АВ 18s_rl 18SрРНК +52 °C, а для B3cl98_f2 і В3с198_г2 14,4 длРНК+49 °C. В основу корисної моделі спосіб діагностики MVX методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції поставлено задачу досягти точності і якості постановки ПЛР за допомогою розробки власних праймерів та підтвердити ефективність запровадженого способу діагностики. Корисна модель спосіб діагностики MVX методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, що включає відбір зразків, екстракцію длРНК із зразків, реакцію зворотної транскрипції, проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), візуалізацію та аналіз результатів, який відрізняється тим, що для проведення ПЛР використовується дві пари праймерів, одна пара АВ 18s_fl TAGGATAGAGGCCTACCA і АВ 18s_rl TTCGCAGTAGTCGGTCTTGA специфічна до послідовності до 18S рРНК Agaricus bisporus spp. з розміром продукту ампліфікації 617 пар нуклеотидних залишків (п.н.з.) і друга пара MVX1 TAGACAACATAACAGGCGTA і MVX_2 TCACCATTAGTA ТСССААСТ специфічна до послідовності 14,4 длРНК вірусу MVX з розміром продукту ампліфікації 174 п.н.з; оптимальна температура відпалу для пар праймерів АВ 18s_fl TAGGAT AGAGGCCTACCA і АВ 18s_rl TTCGCAGTAGTCGGTCTTGA та власно розроблених праймерів MVX_1 TAGACAACATAACAGGCGTA і MVX_2 TCACCATTAGTATCCCAACT становить +52 °C. Запропонований спосіб характеризується такими етапами: відбір зразків, екстракція кДНК із зразків, проведення реакції зворотної транскрипції, проведення ПЛР, візуалізація та аналіз результатів. Об'єм реакції містить 50 мкл: mQ, (33 мкл), 10х ПЛР-буфер (5 мкл), 75мм MgC12 (1,5мкл), 20мм dNTP (1 мкл), 20п/моль кожного з праймерів, 2,5 одиниць Taq ДНК-полімерази і 5 мкл кДНК. Умови реакції ампліфікації: 2 хв при +96 °C (1 цикл), 30 сек при +94 °C, 30 сек. при температурі +52 °C, 3 хв при 72 °C (30 циклів), 10 хв при 72 °C (1 цикл). Візуалізація продуктів ампліфікації проводити в 1 % агарозному гелі. В представленому нами способі для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовуються власно розроблена пара праймерів MVX_1 TAGACAACATAACAGGCGTA і MVX_2 TCACCATTAGTATCCСААСТ (табл.). Таблиця Пари праймерів, що використовується для RT-ПЛР Назва Сиквенс (послідовність) праймерів F`TAGАСААСАТААСAGGCGTА R`TCACCATTAGTATCCCA ACT РНК позитивний F` GGTAGGATAGAGGCCTACCA контроль R` TTCGCAGTAGTCGGTCTTGA MVX 14,4 1 Розмір (пар нуклеотидних залишків) Температура, °C 174 52 617 UA 68996 U 5 Отже, нами рекомендується використовувати температурний режим відпалу праймерів в межах +52 °C, який є оптимальним згідно характеристик власно розроблених праймерів MVX_1 F`TAGACAACATAACAGGCGTA і MVX_2 R`TCACCATTAGTATCCCA ACT та праймерів для внутрішнього контролю якості виділення длРНК і отримання кДНК. Завдяки запропонованому способу створюється можливість одночасного проведення діагностики, контролю якості виділення длРНК та проведення реакції зворотної транскрипції. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Спосіб діагностики MVX методом мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, що включає відбір зразків, екстракцію длРНК із зразків, реакцію зворотної транскрипції, проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), візуалізацію та аналіз результатів, який відрізняється тим, що для проведення ПЛР використовується дві пари праймерів, одна пара АВ 18s_fl TAGGATAGAGGCCTACCA і АВ 18s_rl TTCGCAGTAGTCGGTCTTGA специфічна до послідовності до 18S рРНК Agaricus bisporus spp. з розміром продукту ампліфікації 617 пар нуклеотидних залишків (п.н.з.) і друга пара MVX1 TAGACAACATAACAGGCGTA і MVX_2 TCACCATTAGTA ТСССААСТ специфічна до послідовності 14,4 длРНК вірусу MVX з розміром продукту ампліфікації 174 п.н.з; оптимальна температура відпалу для пар праймерів АВ 18s_fl TAGGAT AGAGGCCTACCA і АВ 18s_rl TTCGCAGTAGTCGGTCTTGA та власно розроблених праймерів MVX_1 TAGACAACATAACAGGCGTA і MVX_2 TCACCATTAGTATCCCAACT становить +52°С. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2