Спосіб атенуації вірусів хвороби марека першого серотипу

Реферат: UA 90121 U UA 90121 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, ветеринарної вірусології, зокрема до способів атенуації вірусів. Хвороба Марека є найрозповсюдшенішою хворобою курей. Вірус, що викликає хворобу Марека зв'язаний з клітинами. Його лімфотропні властивості схожі з властивостями гаммавірусів і позначаються як серотип 1. Існує спосіб атенуації вірусів [Патент RU № 2202357 МПК C12N 5/00, C12N 7/00, А61К 35/76 "Способ аттенуации вирусов"]. Але у цьому способі головною задачею є тільки підвищення безпеки ослаблених вірусів. Відомий спосіб культивування вірусу грипу [Virology Jornal /The new temperature-sensitive mutation PA-F35S fordeveloping recombinant avian attenuated H5N1 influenza vaccine]. Культивування вірусу грипу у цьому способі проводиться за температури 29-31 °C, оптимальною температурою є 37 °C. Тому при створенні несприятливих умов культивування ослабляються вірулентні властивості вірусу. Найбільш близьким технічним рішенням до способу, що заявляється, є спосіб культивування в перещеплюваних клітинних культурах [Jornal Viruses 2012 /Development of liveattenuated influenza vaccines agaivst outbreaks of H5N1 influenza]. За цим способом проводять напрацювання культури клітин, зараження клітинних культур інфікуючою дозою 100ТЦД50/мл, спостереження за розвитком цитопатичнх змін в клітинних культурах (реплікація вірусу в клітинних культурах), знімання з культурального посуду вірусовміщуючої біомаси на 6-7 добу з послідуючим зараженням знову напрацьованої клітинної культури в продовж 35-40 (і більше) пасажів. Це рішення вибрано як найближчий аналог. Недоліком найближчого аналога є те, що спосіб трудомісткий, економічно маловигідний. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб атенуації вірусів хвороби Марека першого серотипу, що включає напрацювання культури клітин, зараження клітинних культур інфікуючою дозою, спостереження за розвитком цитопатичнх змін в клітинних культурах (реплікація вірусу в клітинних культурах), знімання з культурального посуду вірусовміщуючої біомаси шляхом використання інфікованої дози 1000ТЦД50/мл, знімання з культурального посуду вірусовміщуючої біомаси на 4 добу, використання як клітинних систем первиннотрипсинізованої культури клітин та перещеплюваної клітинної культури, щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз з найближчим аналогом дає змогу зробити висновок, що використання у способі інфікованої дози 1000ТЦД50/мл, знімання з культурального посуду вірусовміщуючої біомаси на 4 добу забезпечує прискорення атенуації, а використання первиннотрипсинізованої культури клітин та перещеплюваної клітинної культури забезпечує імуногенні властивості вірусів. Спосіб виконується таким чином. Атенуація ізолятів вірусу хвороби Марека першого серотипу проводиться шляхом швидких та перемежаючих пасажів в первинній (ФЕК) та перещеплюваній (CEF) культурах клітин фібробластів курячих ембріонів. Для атенуації ВХМ необхідно напрацювання первиннотрипсинізованої культури клітин з метою накопичення вірусної біомаси відібраних ізолятів вірусу хвороби Марека першого серотипу. Первинну культуру фібробластів ембріонів курей (ФЕК) готують за допомогою трипсинізації тканин ембріонів курей 11-12 добової інкубації згідно з "Методическими рекомендациями по работе с клеточными культурами птиц" (С.-П., 1988). Яйця для інкубації надходили із птахогосподарств, які благополучні щодо інфекційних хвороб курей. Поверхню яєць обробляють 70 % спиртом та фламбували. Ембріони асептично діставали у чашку Петрі з розчином Хенкса та антибіотиками (гентаміцин, дифлюкан), котрим тричі промивали. У ембріонів видаляють голови, крила, кінцівки, потім тушки збирають у сосуд з розчином Хенкса та антибіотиками (гентаміцин, цефтриаксон), двічі промивають і подрібнюють стерильними ножицями. Подрібнену тканину ембріонів переносять у колбу з плоским дном ємністю 100-250 мл та заливають теплим розчином трипсину. Попередньо простерилізований кип'ятінням магніт обережно по стінці вносять до колби, яку ставлять на магнітну мішалку на (15-20) хвилин. Швидкість перемішування була такою, щоб на поверхні рідини не утворювалась піна. Трипсинізацію проводять у (2-3) цикли. Отриману суспензію клітин фільтрують через (3-4)шаровий марлевий фільтр, додають (2-3)% сироватки крові ВРХ для інактивації трипсину. Профільтровану клітинну суспензію центрифугугують при (1000-1500) об/хв., (10-15) хвилин. Після чого супернатант зливають, а до осаду додають 50 мл ростового поживного середовища з антибіотиками (гентаміцин, діфлюкан) та обережно ресуспендують плавними круговими рухами. 1 UA 90121 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Концентрацію життєздатних клітин підраховують за методом суправітального забарвлення трипановим синім у всіх квадратах камери Горяєва при малому збільшенні. Далі культуру ресуспендують у ростовому живильному середовищі з розрахунку, щоб посівна концентрація 3 фібробластів становила (500000-800000) клітин/см і висівають у культуральні посудини. Ростове живильне середовище складалося з рівних об'ємів середовищ Ігла та 199 і 10 % сироватки крові ВРХ. Повноцінний моношар клітин формувався на (3-4) добу. Одержаний моношар клітин інфікують відібраними для клонування ізолятами 2/11-5/11 вірусу хвороби Марека за загально прийнятою методикою. Атенуацію проводять за методом швидких та перемежаючих пасажів, суть якого полягає в наступному. Вже на ранніх етапах атенуації в популяції вірусу з'являються віріони-мутанти, що відрізняються більш швидким розмноженням у новій системі і атенуйованим фенотипом. Якщо, застосовувати велику інфікуючу дозу і збирати "ранній" врожай вірусу для чергового пасажу, то значно прискорюється процес атенуації. З цією метою відбирають культуральні посудини зі сформованим моношаром первинної культури фібробластів (ФЕК), з яких видаляють ростове середовище. Моношар промивають фізіологічним розчином (для нейтралізації сироватки крові великої рогатої худоби) та вносять 50 мл поживного середовища 199 або Ігла. Потім в кожний культуральний посуд 3 вносять по 5,0 см вірусовміщуючого матеріалу та погойдуванням розподіляють його рівномірно по шару клітин. У такому вигляді культуральний посуд залишають на 1-2 години за температури 22-37 °C для адсорбції вірусу на поверхні клітин. Далі залишки вірусовміщуючого матеріалу видаляють з матраців і вносять підтримуюче середовище (середовище Ігла та 199) у кількості 10 % від об'єму культурального посуду. За цією ж методикою проводять зараження перещеплюваних культур клітин. Усього для атенуації проведено від 17 до 23 пасажів ізолятів вірусів ХМ першого серотипу. Інфекційну активність ізолятів першого серотипу визначають шляхом титрування на 243 годинній культурі клітин ФЕК, яка вирощувалась в культуральних посудинах ємкістю 50 см . 1 5 Кожним десятикратним розведенням вірусу в поживному середовищі від 10- до 10- в об'ємі по 3 0,5 см заражають моношарову культуру по (3-4) флакони, з яких спочатку видаляють ростове і вносять підтримуюче середовище з рівних об'ємів Ігла і 199 з 2 % сироватки крові ВРХ. Приклад 1. Визначення нешкідливості ізолятів вірусу хвороби Марека після їх атенуації шляхом клонування в первинній та перещеплюваній культурах клітин Нешкідливість ізолятів вірусу х. Марека визначали на однодобових курчатах в умовах Одеської дослідної станції ННЦ "ІЕКВМ". Кожний атенуйований ізолят-3/11-5/11 вводили по 0,2 3 3 см , що вміщує 5000 ФУО/см , внутрішньом'язово курчатам однодобового віку. Четверта група контроль (контроль фізіологічного розвитку). В досліді використовували ізоляти, що були атенуйовані в первинній та перещеплюваній культурах клітин фібробластів курячих ембріонів за методом швидких та перемежаючи пасажів ізолят 3/11, ізолят 4/11, ізолят 5/11.Після закінчення досліду через 40 діб після введення ізолятів, всіх курчат було знекровлено та проведено їх патологоанатомічний розтин. Встановлено, що всі курчата, щеплені атенуйованими ізолятами були клінічно здоровими. Приклад 2. Перевірка імуногенної активності ізолятів вірусу хвороби Марека після їх атенуації. Для контролю імуногенної активності кожного атенуйованого ізоляту вірусу хвороби Марека було використано 6 груп однодобових курчат по 25 голів в кожній: - перша група - контроль імуногенності ізоляту 3/11; - друга група - контроль імуногенності ізоляту 4/11; - третя група - контроль імуногенності ізоляту 5/11; - четверта група - контроль інфекційної активності контрольного штаму JM; - п'ята група - контроль фізіологічного розвитку. 3 Курчатам перших трьох груп було введено внутрішньом'язово в об'ємі 0,2 см , що вміщує по 3 500 ФУО/см на голову кожного ізоляту окремо. На 21 добу цим та 25 курчатам четвертої групи 3 введено в об'ємі 0,2 см /голову, розведення цільної крові з культуральним середовищем 199 у співвідношенні 1:1 внутрішньочеревинно контрольний штам JM першого серотипу ВХМ. П'ята група, яку не імунізували і не інфікували вірусом, була залишена інтактним контролем (контроль фізіологічного розвитку). За курчатами велось спостереження впродовж 70 діб, звертали увагу на характер і ступінь поствакцинальних реакцій, фізіологічний розвиток і збереження поголів'я. Після завершення терміну спостереження курчат було забито з метою виключення можливих паталогоанатомічнх змін, які характерні для хвороби Марека. Серед імунізованих допускається відхід до 2 курчат в перші 10 діб життя. 2 UA 90121 U 5 10 Таким чином ізоляти атенуйованих в такий спосіб вірусів можна вважати придатними для конструювання вакцини за причини відсутності клінічного прояву захворювання серед імунізованих курчат, відсутності патологічних змін внутрішніх органів (залозистого шлунка, печінки, селезінки, тимусу та фабріцієвої бурси), характерних для хвороби Марека, при забої по закінченню контролю; та наявності таких змін не менше у 40 % курчат п'ятої групи (контроль патогенності епізоотичного штаму вірусу хвороби Марека). Такий спосіб атенуації може використовуватися для атенуації польових ізолятів ВХМ першого серотипу з метою створення моно- та полівалентних вакцин проти ХМ із актуальних в Україні штамів. Атенуація в такий спосіб запобігає циркуляції ВХМ першого серотипу серед птахопоголів'я. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб атенуації вірусів хвороби Марека першого серотипу, що включає напрацювання культури клітин, зараження клітинних культур інфікуючою дозою, спостереження за розвитком цитопатичних змін в клітинних культурах (реплікація вірусу в клітинних культурах), знімання з культурального посуду вірусовміщуючої біомаси, який відрізняється тим, що використовують інфіковану дозу 1000ТЦД50/мл, знімають з культурального посуду вірусовміщуючу біомасу на 4 добу, використовують як клітинні системи - первиннотрипсинізовану культуру клітин та перещеплювану клітинну культури. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3