Вірусологічне живильне середовище “селеногідролізин”

Реферат: Вірусологічне живильне середовище складається зі плазмозаміщуючих розчинів геосену, гідролізину, збалансованого фізіологічного розчину та додатково містить натрій селеністокислий Na2SeО3. UA 92827 U (54) ВІРУСОЛОГІЧНЕ ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ "СЕЛЕНОГІДРОЛІЗИН" UA 92827 U UA 92827 U 5 10 15 20 25 30 Корисна модель належить до мікробіології та може бути використана у ветеринарній та медичній вірусології для культивування клітин тварин. Відоме живильне середовище [патент № 23620, опубл.02.06.1998 р., МПК C12N 5/06, C12R 1/91, С 12R 1/93, C12Q 1/70. "Вірусологічне живильне середовище "Геосгідролізин" для культивування клітин ссавців і птахів"], до складу якого входять плазмозамінні розчини геосену і гідролізину. Недоліком відомого середовища є дефіцит біологічно активних сполук, препарати селену та низька чутливість середовища. В основу корисної моделі поставлена задача створення живильного середовища, яке за своїми фізико-хімічними властивостями та вмістом поживних та біологічно-активних сполук наближається до середовищ, у яких клітини існують in vivo. Поставлена задача вирішується тим, що створюють вірусологічне живильне середовище, яке складається зі збалансованого фізіологічного розчину та плазмозаміщуючих розчинів геосену і гідролізину, згідно з корисною моделлю, додатково додають натрій селеністокислий Na2SeO3 концентрацією 0,1 %. Отримання запропонованого середовища включає роздільне приготування основного поживного середовища, базисного розчину селеніту натрію із наступним їх поєднанням. Як джерело селену використовують натрій селеністокислий Na2SeO3, який містить основної речовини селену не менше 98 %. Для цього у відомі розчини геосену та гідролізину додатково додають селеніт натрію у наступних співвідношеннях, мас. %: геосен 5 - 15 гідролізин 5 селеніт натрію 0,1 розчин Хенкса решта до 100 %. Геосен - використовують як готовий фармакопейний препарат № 75.933.4. Гідролізин отримують шляхом кислотного гідролізу фібринних згустків крові великої рогатої худоби. Збалансований розчин Хенкса готують за загальновідомими правилами. Ефективність селену, як складової частини глутатіонпероксидази полягає в наданні захисної дії проти окислювального стресу, каталізує розпад перекису водню або розкладання гідроперекисів ліпідів і тим самим перериває переокислювальну ланцюгову реакцію вільних радикалів. При дефіциті селену активність цього ферменту різко знижується, особливо в крові (майже до нуля). Зниження активності глутатіонпероксидази супроводжується різким зменшенням бактерицидної активності нейтрофілів за рахунок незавершеного фагоцитозу, загальмовується утворення імунних тіл. Безпосередньо перед використанням у відоме живильне середовище вносять сироватку крові великої рогатої худоби кількістю 10 % і антибіотики: пеніцилін, натрієву сіль, стрептоміцину 3 сульфат кількістю - 100 ОД/см кожного, з внесенням приготованого базисного розчину селеніту натрію до кінцевої концентрації в поживному середовищі 0,1. 35 Таблиця 1 Розрахунок основного розчину селеніту натрію -4 Об'єм основного розчину селеніту натрію 10 г/см Кінцева концентрація селеніту натрію 3 3 0,0001 мг/см 0,00001 мг/см 0,1 0,01 0,2 0,02 0,45 0,045 1,0 0,1 Об'єм живильного середовища, № п/п 3 см 1. 2. 3. 4. 100,0 200,0 450,0 1000,0 3 У таблиці 1 наведено розрахунок основного розчину селеніту натрію на різні об'єми живильного середовища. Для зручності роботи з малими кількостями селеніту натрію, їх 3 3 застосовують у г/см що відповідає наступним показникам в мг/см , наприклад: 40 -3 3 3 -7 3 3 10 г/см -1 мг/см ; 10 г/см -0,0001 мг/см ; -4 3 3 -8 3 3 10 г/см -0,1 мг/см ; 10 г/см -0,00001 мг/см ; -5 3 3 -9 3 3 10 г/см -0,01 мг/см ; 10 г/см -0,000001 мг/см ; -6 3 3 -10 3 3 10 г/см -0,001 мг/см ; 10 г/см -0,0000001 мг/см 1 UA 92827 U 5 Отримане живильне середовище "Селеногеосгідролізин" використовують як ростове живильне середовище для отримання первинно-трипсинізованих або перещеплюваних культур клітин. Ефективність живильного середовища "Селеногеосгідролізин" визначається за культурально-морфологічною характеристикою та за проліферативними властивостями клітин вивчають морфологічну характеристику клітин по схемі Л.П. Д'яконова. Таблиця 2 Коротка культурально-морфологічна характеристика клітин на середовищі Селеногеосгідролізин" через 72 години росту № п/п 1 Ознака Загальний вид моношару 2 3 4 5 6 7 8 10 15 20 25 Форма клітин Форма ядер Кількість ядер Щільність ядерної субстанції Структура цитоплазми Кількість загиблих кліток Кількість кліток з мітозами Середовище без селеніту нагрію Середовище із селенітом -7 3 (контроль) натрію 10 г /см (дослід) Острівки клітин Суцільниймоношар Полігональна, рідко Полігональна, рідко веретеноподібна, гігантські гігантські клітки клітини Овальна Овальна 2-6 2-6 Дрібно розпилена Дрібно розпилена Гомогенна, злегка вакуолізована Гомогенна 1-2 Відсутні 25 61-55 Готують суспензію клітин нирки теляти (НТ) у пропонованому середовищі "Селеногеосгідролізин" та висівають у пеніцилінові флакончики з покривними скельцями. Культивують клітини протягом 72 годин за температури 37° С Фарбують гематоксиліном і еозином. Вивчають морфологічну характеристику клітин при збільшенні світлового мікроскопа 40 × 7. Отже, додавання селеніту нагрію в пропоноване середовище посилює інтенсивність при вирощуванні клітин, спостерігається їх активний ріст. Клітини ростуть у вигляді суцільного моношару, а їх популяція однорідна та полігональної форми з овальними ядрами, які тісно прилеглі один до одного. Визначення проліферативних властивостей клітин проводять за схемою. Готують суспензію клітин нирки теляти, що перевиваються, в живильному середовищі "Селеногеосгідролізин" і висівають у пробірки. Облік зростання проводять протягом 5 діб. У різні терміни культивування проводять підрахунок клітин в камері Горяєва, після зняття їх зі скла 0,02 % розчином версену. При цьому визначають індекс проліферації, а це - відношення кількості клітин, що виросли, до посіяних. Результати вивчення проліферативної активності клітин, що перевиваються, представлені в таблиці 3. Таблиця 3 Проліферативна активність клітинної культури нирки теляти при вирощуванні на живильному середовищі "Селеногеосгідролізин" № п/п Живильне середовище Активність зростання 3 Кількість кліток в см Індекс проліферації 3 середовище Кількість кліток в см Індекс пліферації 1. 2. 30 Селеногеосгідролізин Контроль, 199 Час росту, діб 1 2 3 4 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 2,0 10 3,9 10 8,8 10 1,4 10 3,4 10 1,0 1,9 4,4 7,0 17,0 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 2,1 10 3,0 10 5,7 10 1.1 10 2.1 10 1,1 1,5 2,8 5,7 10,6 Як видно з даної таблиці 3, застосування селеніту натрію у складі запропонованого живильного середовища інтенсифікує ріст колоній на обох досліджених середовищах. У . 5 . 6 контролі, на середовищі 199, показники швидкості росту клітин були значно нижчі 2,1 10 -2,1 10 . Індекс проліферації клітин нирки телятина пропонованому живильному середовищі склав 17,0, у контрольній групі -10,0. 2 UA 92827 U Технічне рішення запропонованої корисної моделі вірусологічне живильне середовище "Селеногідролізин" дає змогу збільшити продукування бактерійної маси, покращити її якість, що має значне практичне значення у ветеринарній, медичній мікробіології та сприяє зниженню матеріальних витрат на дослідження. 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Вірусологічне живильне середовище, що містить плазмозаміщуючі розчини геосену, гідролізин, збалансований фізіологічний розчин, яке відрізняється тим, що додатково містить натрій селеністокислий Na2SeО3 наступного співвідношення, мас. %: плазмозаміщуючі розчини геосену 5-15 гідролізин 5 натрій селеністокислий Na2SeО3 0,1 збалансований фізіологічний розчин решта. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3