Спосіб одержання позитивної сироватки для діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби в реакції зв’язування комплементу

Реферат: Спосіб одержання позитивної сироватки для діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби в реакції зв'язування комплементу (РЗК) включає вирощування культури на синтетичному середовищі, підготовку імуногенного препарату для імунізації, гіперімунізацію, відбір крові і відокремлення цільового продукту. Використовують із збудника паратуберкульозу штам «Деметра», застосовують як ад'ювант - вазелінове масло, як тварин-продуцентів використовують кроликів, 3-разово вводять імуногенний препарат. UA 92953 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ПОЗИТИВНОЇ СИРОВАТКИ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ ПАРАТУБЕРКУЛЬОЗУ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ В РЕАКЦІЇ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ UA 92953 U UA 92953 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної імунології та біотехнології, а саме до способів одержання імунної сироватки з високим титром антитіл проти збудника паратуберкульозу і призначеної для застосування як контролю специфічної активності паратуберкульозного антигену в реакції зв'язування комплементу (РЗК). Відомий спосіб одержання позитивної сироватки, який включає проведення імунізації кроликів шляхом 5-кратного одночасного підшкірного і внутрішньовенного введення антигену з інтервалом 5-7 діб (А.И. Алиев, Н.Г.Фадеева // Применение ΡΗΓΑ для диагностики паратуберкулеза животных. // Сб. н. работ ДагНИВИ. - 1976. - Т. 8. - С. 82-86). Існує спосіб одержання позитивної паратуберкульозної сироватки крові від кроликів для ΡΗΓΑ, задача якого вирішується 5-разовим внутрішньовенним введенням інактивованої культури збудника паратуберкульозу (Н.И. Григорьева // Активность и специфичность сывороток от кроликов, гипериммунизированных микобактериями туберкулеза птичьего вида и возбудителем паратуберкулеза.// Бюл. ВИЭВ. - М., 1990. - Вып. 73-74. - С.76-80). Однак відомі способи мають такі недоліки: сироватки призначені для ΡΗΓΑ, тривалі терміни гіперімунізації і невисокі титри антитіл, що утворюються в крові кроликів та низька активність отриманих сироваток в РЗК. Найбільш близьким аналогом є спосіб отримання позитивної паратуберкульозної сироватки для РЗК (М.П. Новикова. Метод изготовления позитивной паратуберкулезной сыворотки для РСК// Сб. н. работ СибНИВИ. - 1972. - Вып. XX. - С.34-39). У цьому способі культуру збудника паратуберкульозу вирощують на синтетичному середовищі Сотона, як продуцентів гіперімунної сироватки крові використовують бичків та овець, яких імунізують інактивованою культурою збудника паратуберкульозу на фізіологічному розчині шляхом 8-разового підшкірного введення поступово наростаючих доз антигену. Недоліками даного способу є використання ВРХ як тварин-продуцентів, багаторазовість введення антигену, що збільшує термін отримання сироватки, та низка її активність з титром антитіл 1:30. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб одержання позитивної сироватки для діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби в реакції зв'язування комплементу (РЗК), що включає вирощування культури на синтетичному середовищі, підготовку імуногенного препарату для імунізації, гіперімунізацію, відбір крові і відокремлення цільового продукту, шляхом використання із збудника паратуберкульозу штаму "Деметра", застосування як ад'юванта - вазелінового масла, використання кроликів в якості тварин-продуцентів, 3-и разового введення імуногенного препарату, щоб забезпечити отримання високоактивної позитивної сироватки для контролю специфічної активності паратуберкульозного антигену в реакції зв'язування комплементу (РЗК). Порівняльний аналіз з аналогом дозволяє зробити висновок про те, що заявлений спосіб відрізняється від відомого, застосуванням імуногенного препарату, виготовленого на вазеліновому маслі із збудника паратуберкульозу штам "Деметра", вирощеного на синтетичному середовищі Watson-Reid, використанням кроликів як тварин-продуцентів, 3кратністю введення імуногенного препарату. Спосіб виконується таким чином. Культуру збудника паратуберкульозу вирощують на синтетичному середовищі Watson-Reid впродовж 1,5-2 місяців. Після інактивації бактеріальну масу промивають стерильним фізіологічним розчином, віджимають, поміщають у стерильний флакон, заморожують. Для виготовлення імуногенного препарату готують суспензію бактеріальної маси МАР на 3 3 3 стерильному вазеліновому маслі в концентрації 20 мг/см , 30 мг/см , 30 мг/см - для першого, другого та третього введення. Для імунізації відбирають клінічно здорових, раніше не реагуючих на туберкуліни (ППД) для ссавців та птиці кроликів масою 2,5-3 кг, якім 3-разово,з інтервалом 7 діб, підшкірно, дрібно (у три точки) вводять імуногенний препарат в дозі 1,0 см. Контроль сироваток крові імунізованих тварин на накопичення антитіл до МАР проводять після кожної стимуляції імунної відповіді в РЗК з комерційним паратуберкульозним антигеном у робочому титрі 1:100 (СибНИВИ). Через 7 діб після 3-го введення, проводять відбір крові від тварин-продуцентів. Отримують сироватку крові, розливають у стерильні флакони та консервують розчином фенолу до кінцевої концентрації 0,25 %. Активність сироватки визначають в РЗК в порівнянні з комерційною сироваткою (СибНИВИ). Приклад 1. Для одержання специфічного імуногенного препарату для гіперімунізації тваринпродуцентів використовують montanide ISA-700. Гіперімунізацію проводять 3-разовим підшкірним введенням імуногенного препарату з 3 інтервалом 7 діб в дозах 10, 20, 30 мг/см . Динаміку синтезу антитіл вивчають на 7, 14, 21 добу в РЗК (таблиця 1). 1 UA 92953 U 5 10 15 20 25 Приклад 2. Для одержання специфічного імуногенного препарату для гіперімунізації тваринпродуцентів використовують вазелінове масло. Гіперімунізацію проводять 4-разовим підшкірним введенням імуногенного препарату з 3 інтервалом 14 діб в дозах 5, 10, 20, 30 мг/см . Динаміку синтезу антитіл вивчають на 14, 28, 42, 56 добу (таблиця 1). Приклад 3 (спосіб, який пропонується). Для одержання специфічного імуногенного препарату для гіперімунізації тварин-продуцентів, у якості ад'юванту використовують вазелінове масло. Гіперімунізацію проводять 3-разовим підшкірним введенням імуногенного препарату з 3 інтервалом 7 діб в дозах 20, 30, 30 мг/см . Динаміку синтезу антитіл вивчають на 7, 14, 21 добу (таблиця 1). Приклад 4. Проводять контроль активності сироватки, одержаної по схемі заявленого способу у порівнянні з комерційною сироваткою (Росія, СибНИВИ) в РЗК (таблиця 2). За даними, наведеними в таблиці 1, найбільш інтенсивний синтез антитіл в сироватці крові спостерігається при гіперімунізації по способу, що заявляється (приклад 3). При цьому способі імунізації антитіла до збудника паратуберкульозу виявляли через 7 діб у титрі 1:10, а максимальний кінцевий титр антитіл становив 1:400. У прикладах 1 та 2 антитіла виявляли після другого введення імуногенного препарату, а кінцевий титр антитіл становив 1:180 і 1:360, відповідно. У порівняльному аналізі активності сироваток (таблиця 2) встановлено, що в сироватки, яка була отримана запропонованим способом, антитіла виявляли в титрі 1:400, тоді як у комерційної сироватки максимальний титр антитіл становив 1:280. Таким чином, використання запропонованого способу одержання позитивної сироватки для визначення активності антигену при діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби в реакціях зв'язування комплементу (РЗК) дозволяє отримувати високоактивну специфічну контрольну паратуберкульозну позитивну сироватку. Цим досягається підвищення ефективності контролю якості РЗК при серологічному дослідженні ВРХ на паратуберкульоз. Корисна модель може бути використана на підприємствах по виробництву діагностичних ветеринарних препаратів, що дозволить підвищити ефективність діагностики паратуберкульозу ВРХ. Таблиця 1 Спосіб одержання позитивної сироватки для діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби в реакції зв'язування комплементу (РЗК) Термін взяття крові (дні) Титри антитіл 7 Приклад 1 14 21 1:60 1:180 Приклад 2 28 42 1:80 1:260 14 56 1:360 7 1:10 Приклад 3 14 21 1:320 1:400 30 Таблиця 2 Розведення сироваток Сироватка одержана по схемі запропонованого способу 1:10 1:80 1:280 1:320 1:360 1:400 1:440 1:480 1:520 # # # # # +++ ++ + 1:10 # Комерційна сироватка 1:80 1:280 1:320 1:360 # +++ ++ Примітки. 1. Знак "#" - позитивна реакція, 100 % затримка гемолізу еритроцитів; 2. Знак "+++" - позитивна реакція, 75 % затримки гемолізу еритроцитів; 3. Знак "++" - негативна реакція, 50 % затримки гемолізу еритроцитів; 4. Знак "+" - негативна реакція, 25 % затримки гемолізу еритроцитів; 5. Знак "-" - негативна реакція, гемоліз еритроцитів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб одержання позитивної сироватки для діагностики паратуберкульозу великої рогатої худоби в реакції зв'язування комплементу (РЗК), що включає вирощування культури на синтетичному середовищі, підготовку імуногенного препарату для імунізації, гіперімунізацію, відбір крові і відокремлення цільового продукту, який відрізняється тим, що використовують із збудника паратуберкульозу штам "Деметра", застосовують як ад'ювант - вазелінове масло, як тварин-продуцентів використовують кроликів, 3-разово вводять імуногенний препарат. 2 UA 92953 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3