Спосіб одержання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (рід) та імуноферментному аналізі (іфа)

Реферат: Спосіб одержання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) та імуноферментному аналізі (ІФА) включає гіперімунізацію тварин-продуцентів, стимуляцію імунної відповіді, відбір крові і відокремлення цільового продукту, визначення активності сироватки в РІД. Проводять стимуляцію експресії вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ) та його антигенів у специфічному інактивованому препараті для гіперімунізації тварин-продуцентів з використанням інгібітору деацетилаз гістонів натрію вальпроату. Виготовляють сироватку за допомогою її розведення до титру антитіл, який дорівнює титру міжнародних позитивних референс-стандартів для діагностики лейкозу ВРХ, ліофілізують для тривалого збереження активності, застосовують метод ПЛР при відборі тварин-продуцентів, виготовленні препаратів для гіперімунізації та при контролі кінцевого продукту, визначають активність сироватки в ІФА. UA 67726 U (12) UA 67726 U UA 67726 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної біотехнології, а саме до способів одержання референтних сироваток, призначених для використання як референтного стандарту для систем визначення антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ). Корисна модель може бути використана на підприємствах по виробництву діагностичних ветеринарних препаратів у технології виготовлення стандартної панелі сироваток з метою контролю якості тест-систем для серологічної діагностики лейкозу ВРХ, що дозволить підвищити ефективність діагностики лейкозу ВРХ згідно з вимогами міжнародних стандартів. Відомий спосіб одержання діагностичної сироватки (патент РФ № 2135210, кл. А61К39/40, С07К16/12, А61К39/39, “Способ получения диагностической сыворотки”), який включає багаторазову імунізацію тварин-продуцентів авірулентним антигенним матеріалом з використанням імуномодуляторів тималіну та циклофосфану. Існує спосіб одержання протилейкозної сироватки крові (А. С № 1671312, кл. А61Л39/42 “Способ получения противолейкозной сыворотки крови”), задача якого досягається одержанням сироватки крові від баранів, експериментально заражених інтратестикулярно кров'ю хворої на 6 3 лейкоз корови з 2,5-5,0 х10 лімфоцитів/см . Недоліком даних способів є висока трудомісткість, низький вихід цільового продукту у зв'язку з використанням дрібних лабораторних тварин як продуцентів гіперімунної сироватки, а також застосування високовартісних фармакологічних препаратів для стимулювання імунної відповіді. Найбільш близьким технічним рішенням до способу, що заявляється, є спосіб одержання високоактивних преципітувальних протилейкозних сироваток (Патент України № 35438 А61К39/08, А 61К39/395 “Спосіб одержання високоактивних преципітувальних протилейкозних сироваток”). У цьому способі як продуцентів гіперімунної сироватки крові використовують бичків, яких імунізують інактивованими специфічними імуногенними препаратами з наступим введенням крові від хворих на лейкоз тварин. Недоліками даного способу є отримання придатного для реакції преципітації готового продукту у нативному стані, що не забезпечує довготривалого збереження значень його специфічних характеристик, а також відсутність молекулярно-генетичних методів контролю на контамінацію вірусом лейкозу ВРХ та сторонніми вірусами при виготовленні препаратів для імунізації та відборі тварин-продуцентів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб одержання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) та імуноферментному аналізі (ІФА), що включає гіперімунізацію тварин-продуцентів, стимуляцію імунної відповіді, відбір крові і відокремлення цільового продукту, визначення активності сироватки в РІД шляхом стимуляції експресії ВЛВРХ та його антигенів у специфічному інактивованому препараті для гіперімунізації тварин-продуцентів з використанням інгібітору деацетилаз гістонів натрію вальпроату, виготовлення сироватки за допомогою її розведення до титру антитіл, який дорівнює титру міжнародних позитивних референс-стандартів для діагностики лейкозу ВРХ, ліофілізації для тривалого збереження активності, застосування методу ПЛР при відборі тварин-продуцентів, виготовленні препаратів для гіперімунізації та при контролі кінцевого продукту, визначення активності сироватки в РІД та ІФА, щоб забезпечити підвищення ефективності контролю якості тест-систем для серологічної діагностикилейкозу ВРХ. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що заявлений спосіб відрізняється від відомого розведенням кінцевого продукту до титру міжнародних позитивних референс-стандартів, застосуванням для гіперімунізації тварин-продуцентів специфічного інактивованого препарату з підвищеним вмістом антигенів ВЛВРХ, ліофілізацією кінцевого продукту з метою довготривалого збереження значень специфічних показників та застосуванням молекулярно-генетичних методів контролю на контамінацію вірусом лейкозу ВРХ та сторонніми вірусами, проведенням контролю активності сироватки в РІД та ІФА, чим досягається отримання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу ВРХ згідно з міжнародними стандартами, що відповідає критерію «новизна». Спосіб виконується таким чином. Відбирають донорів крові для виготовлення специфічних інактивованих імуногенних препаратів для гіперімунізації (велику рогату худобу віком 2-3 роки, яка вільна від інфекції ВЛВРХ, та тварин віком 4 - 6 років, хворих на хронічний лімфолейкоз), а також продуцентів референтної позитивної сироватки (велику рогату худобу віком 10 - 12 місяців, яка вільна від інфекції ВЛВРХ) з використанням гематологічних (вміст лейкоцитів, лімфоцитів), серологічних (наявність антитіл до ВЛВРХ у РІД та ІФА), а також молекулярно-генетичних (виявлення провірусу ВЛВРХ методом ПЛР) тестів. 1 UA 67726 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Виготовляють специфічний імуногенний інактивований препарат № 1, який містить антигени ВЛВРХ, одержані з культуральної рідини перещеплюваної лінії клітин FLK-BLV. Виготовляють специфічний імуногенний інактивований препарат № 2, який містить антигени ВЛВРХ та лейкоцитів хворої на хронічний лімфолейкоз великої рогатої худоби. Для стимуляції експресії вірусу лейкозу та його антигенів лейкоцити, з яких виготовляють препарат, піддають короткостроковому культивуванню у присутності інгібітору деацетилаз гістонів. Проводять гіперімунізацію тварин-продуцентів двома препаратами (препарат № 1 та № 2) 3 одночасно, тричі, з інтервалом 14 діб, підшкірно, дозою 2 см . Через 1,5 місяці проводять 3 реімунізацію тварин препаратом № 1 дворазово, з інтервалом 14 діб, підшкірно, дозою 2 см . З метою стимуляції імунної відповіді через 14 діб після реімунізації тваринам підшкірно вводять розведену фізіологічним розчином периферичну кров хворої на хронічний лімфолейкоз ВРХ з 3 вмістом 1500 лейкоцитів в 1см . Контроль сироваток крові гіперімунізованих тварин на накопичення антитіл до ВЛВРХ проводять в РІД кожні 14 діб після стимуляції імунної відповіді. Після накопичення антитіл до ВЛВРХ у максимальних титрах, які не змінюються під час двох послідовних досліджень, проводять відбір крові від тварин-продуцентів шляхом тотального знекровлення. Отримують сироватку крові, стерилізують фільтрацією через пластини з діаметром пор 0,2 мкм, консервують додаванням натрію етилмеркурій саліцилату у кінцевій концентрації 1:10000. За результатами РІД визначають титр сироватки, який дорівнює титру міжнародних позитивних референс-стандартів для серологічної діагностики лейкозу ВРХ згідно з вимогами міжнародних стандартів. Проводять розведення одержаної сироватки до встановленого титру. Розчинником слугує сироватка крові ВРХ, вільна від антитіл проти ВЛВРХ. Проводять 3 ліофілізацію сироватки в об'ємі 1 см за спеціальним режимом до рівня масової частки вологи не більше 1%. Контроль отриманої сироватки на контамінацію ВЛВРХ та сторонніми вірусами проводять методом ПЛР. Активність сироватки визначають в РІД та ІФА у порівнянні з міжнародними позитивними референс-стандартами для діагностики лейкозу ВРХ. Приклад 1. Для одержання специфічного імуногенного інактивованого препарату, який використовують для гіперімунізації тварин-продуцентів, з периферичної крові хворої на хронічний лімфолейкоз ВРХ виділяють лейкоцити, які піддають культивуванню за температури 37 °С протягом 72 годин. Для стимуляції експресії вірусу лейкозу та його антигенів до ростового 3 середовища додають натрію вальпроат у кінцевій концентрації 0,2-1,0 мМ/см . Рівень експресії вірусу лейкозу у короткостроково культивованих лейкоцитах визначають за допомогою ПЛР з використанням тест-систем для детекції ДНК провірусу та РНК ВЛКРС (таблиця 1). Приклад 2. Проводять контроль активності одержаної сироватки в РІД та ІФА у порівнянні з міжнародними позитивними референс-стандартами для діагностики лейкозу ВРХ з використанням комерційних тест-систем для серологічної діагностики лейкозу ВРХ. В РІД визначають активність одержаної сироватки у порівнянні з міжнародними позитивними референс-стандартами Е05 (Німеччина) і/або А2 (Польща). В ІФА визначають активність одержаної сироватки у порівнянні з міжнародними позитивними референс-стандартами Е05 (Німеччина) і/або Р9 (Польща). Досліджують сироватки, розведені сироваткою крові ВРХ, вільною від антитіл проти ВЛВРХ, відповідно до вимог міжнародних стандартів щодо діагностики лейкозу ВРХ [ОІЕ Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 2008. - ch. 2.4.11 Enzootic Bovine Leukosis. - P. 729-738], а саме: в тест-системі ІФА досліджують окремі польові сироватки крові ВРХ та збірну пробу, виготовлену з 10 польових сироваток. Згідно з міжнародними вимогами, при дослідженні окремих проб сироваток позитивна референтна сироватка, розведена до титру 1:10, має бути позитивною. При тестуванні збірних проб сироваток позитивна референтна сироватка, розведена до титру, що у 10 разів перевищує кількість окремих проб у збірній пробі, має бути позитивною. За результатами випробувань активність одержаної сироватки в РІД та ІФА дорівнювала активності міжнародних позитивних референс-стандартів для діагностики лейкозу ВРХ (таблиця 2). Таким чином, застосування запропонованого способу одержання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) та імуноферментному аналізі (ІФА) дозволяє отримувати цільовий продукт, який відповідає вимогам міжнародних стандартів. Цим досягається підвищення ефективності контролю якості тест-систем для серологічної діагностики лейкозу ВРХ. 2 UA 67726 U Таблиця 1 Спосіб одержання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) та імуноферментному аналізі (ІФА) № пп. 1 2 Матеріал для дослідження Наявність специфічного фрагменту провірусу ВЛВРХ Наявність РНК ВЛВРХ Ступінь інтенсивності реакції + + ++ + + + Лейкоцити, культивовані з додаванням натрію вальпроату Лейкоцити, культивовані без додавання натрію вальпроату Таблиця 2 № пп. Матеріал для дослідження 1 Одержана сироватка Позитивна референтна сироватка 2 Е05 (Німеччина) Позитивна референтна сироватка для 3 РІД А2 (Польща) Позитивна референтна сироватки для 4 ІФА Р9 (Польща) Результат РІД, титр +, 1:4 Результат ІФА, титр +, 1:10 та 1:100 +, 1:4 +, 1:10 та 1:100 +, 1:4 Не досліджували Не досліджували +, 1:10 та 1:100 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб одержання референтної позитивної сироватки для діагностики лейкозу великої рогатої худоби в реакції імунодифузії (РІД) та імуноферментному аналізі (ІФА), що включає гіперімунізацію тварин-продуцентів, стимуляцію імунної відповіді, відбір крові і відокремлення цільового продукту, визначення активності сироватки в РІД, який відрізняється тим, що проводять стимуляцію експресії вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛВРХ) та його антигенів у специфічному інактивованому препараті для гіперімунізації тварин-продуцентів з використанням інгібітору деацетилаз гістонів натрію вальпроату, виготовляють сироватку за допомогою її розведення до титру антитіл, який дорівнює титру міжнародних позитивних референс-стандартів для діагностики лейкозу ВРХ, ліофілізують для тривалого збереження активності, застосовують метод ПЛР при відборі тварин-продуцентів, виготовленні препаратів для гіперімунізації та при контролі кінцевого продукту, визначають активність сироватки в ІФА. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3