Спосіб визначення кількості дезоксиніваленолу у плазмі крові птиці

Реферат: Спосіб визначення кількості дезоксиніваленолу у плазмі крові птиці включає, відбирання проб крові у птиці, отримання плазми крові, проведення екстракції, пропускання через картридж, елюювання та упарювання до сухого залишку, розчинення та утримання дезоксиніваленолу з використанням імуноафінної колонки, упарювання елюату екстракту і відновлення в рухомій фазі, визначення дезоксиніваленолу за допомогою рідинного хроматографа. Використовують 1 мл плазми крові, з якої дезоксиніваленол екстрагують 2 мл фосфатного буфера. Для утримання використовують імуноафінну колонку, через яку пропускають розведений об'єм зразка, після чого - промивають 14 мл фосфатного буфера та 6 мл деіонізованої води. Елюювання проводять 4 мл метанолу. Елюат упарюють досуха та розводять 1 мл рухомої фази. Аналіз проводять на рідинному хроматографі з діодно-матричним детектором та оберненофазовою хроматографічною колонкою із захисним картриджем з використанням рухомої фази ацетонітрил/вода/метанол 3:94:3 (%). UA 93016 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ДЕЗОКСИНІВАЛЕНОЛУ У ПЛАЗМІ КРОВІ ПТИЦІ UA 93016 U UA 93016 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема до досліджування біологічного матеріалу особливими способами і може бути використана при визначенні мікрокількостей дезоксиніваленолу у плазмі крові птиці. Відомий аналог [Н. Valenta, S. Dänicke, S. Döll // Mycotoxin Res.,_2003. - 19(1). - P. 51-55], до складу якого входить: відбирання проб крові у птиці, отримання сироватки крові, проведення екстракції 1,5 мл сироватки з 1,0 мл фосфатного буферу, пропускання через картридж, елюювання 35 мл етилацетату та випарювання насухо, розчинення в 1,5-4,0 мл 5 % поліетиленгліколю, утримання дезоксиніваленолу з використанням імуноафінної колонки, упарювання елюату екстракту і відновлення в 200 мкл рухомої фази ацетонітрил/вода (13:87, v/v), та визначення дезоксиніваленолу за допомогою рідинного хроматографа. Недоліками даного способу є: використання сироватки для екстракції дезоксиніваленолу, застосування додаткового картриджу, етилацетату та поліетиленгліколю для екстракції, недостатній ступінь вимивання з імуноафінної колонки, недостатній ступінь відновлення та малий об'єм кінцевого елюату. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб, який буде високочутливим та адаптованим до сучасних способів визначення дезоксиніваленолу за допомогою використання для екстракції замість сироватки плазми крові, застосування фосфатного буфера для екстракції, збільшення ступеня вимивання з імуноафінної колонки, збільшення відновлення та збільшення об'єму кінцевого елюату. Поставлена задача здійснюють шляхом створення способу визначення дезоксиніваленолу у плазмі крові птиці, у якому для екстракції замість сироватки використовується 1 мл плазми крові, з якої дезоксиніваленол екстрагують 2 мл фосфатного буфера, для утримання використовується імуноафінна колонка, через яку пропускають розведений об'єм зразка, після чого - промивають 14 мл фосфатного буферу та 6 мл деіонізованої води, а елюювання проводять 4 мл метанолу, причому - елюат упарюють досуха та розводять 1 мл рухомої фази, аналіз проводять на рідинному хроматографі з діодно-матричним детектором та оберненофазною хроматографічною колонкою із захисним картриджем з використанням рухомої фази ацетонітрил/вода/метанол 3:94:3 (%). Визначення дезоксиніваленолу у плазмі крові курчат-бройлерів згідно з заявленим способом здійснюють за наступною схемою: Екстракція здійснюється таким чином: до 1 мл плазми крові додають 2 мл фосфатного буферу (рН 6,8). Розчин перемішують на вортексі упродовж декількох хвилин. Для утримання використовують імуноафінну колонку. Перед використанням потрібно відкрити пробку на дні імуноафінної колонки та пропустити наповнювач колонки. Розведений об'єм зразка пропускають крізь імуноафінну колонку, зі швидкістю потоку 1 крапля за секунду. Повільний постійний тиск є визначним фактором для "закріплення" дезоксиніваленолу на антитілах. Ця процедура може бути виконана вручну насосом або з використанням вакуумної елюювальної системи. Відмивання проводять таким чином: промити колонку 14 мл фосфатного буферу (рН 7,4). Повторити процедуру промивання 6 мл деіонізованої води, переконавшись, що весь залишок буфера вимито з колонки перед наступним етапом. Елюювання проводять таким чином: помістити серцевидну колбу під колонкою та елюювати дезоксиніваленол пропусканням 4 мл метанолу, зі швидкістю потоку 1 крапля за секунду. Рекомендується повторення проходження потоку крізь колонку (зміною напряму потоку) тричі, щоб переконатись у повній денатурації моноклональних антитіл і послідовному звільненні дезоксиніваленолу у розчин. Потім елюат випарити до ≈ 0,5 мл використовуючи ротаційний випаровувач з водяною банею і досуха азотом. Випарений досуха елюат розвести 1 мл рухомої фази (ацетонітрил/вода/метанол у співвідношенні 3:94:3) і ретельно перемішати на вортексі протягом 30 секунд. Після цього кінцевий елюат об'ємом 1 мл перенести у скляну віалу. Визначення кількості дезоксиніваленолу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії. Визначення кількості дезоксиніваленолу проводять шляхом порівняння висоти піків з калібрувальною кривою стандарту. Віали з пробами поміщають у тримач автосамплера рідинного хроматографа з діодноматричний детектором та обернено-фазною хроматографічною колонкою - довжина 150 мм, внутрішній діаметр 4,6 мм, розмір часток 5,0 мкм із захисним картриджем - довжина 20 мм, внутрішній діаметр 4,0 мм, розмір часток 5,0 мкм і у відповідній програмі створити методику з умовами аналізу, вказаними нижче:швидкість потоку - 1 мл/хв, об'єм уведення - 100 мкл, температура колонки - 30 °C, діодно-матричний детектор, довжина хвилі - 218 нм, рухома фаза - ацетонітрил/вода/метанол 3:94:3 (%). Приклад. Визначення кількості дезоксиніваленолу у плазмі крові. 1 UA 93016 U 5 10 Випробування способу визначення дезоксиніваленолу проводили у плазмі крові курчатбройлерів. Відібрали проби крові, отримали плазму, внесли дезоксиніваленол у плазму, в кількостях, указаних в таблиці. Потім провели підготовку зразків до аналізу. До 1 мл плазми крові додали 2 мл фосфатного буферу (рН 6,8) та перемішали на вортексі. Після чого пропустили розведений об'єм зразка крізь імуноафінну колонку зі швидкістю потоку 1 крапля за секунду. Потім промили колонку 14 мл фосфатного буферу (рН 7,4). Після чого промили 6 мл деіонізованої води. Помістили серцевидну колбу під колонкою та елюювали дезоксиніваленол пропусканням 4 мл метанолу, зі швидкістю потоку 1 крапля за секунду. Елюат випарили досуха. Випарений досуха елюат розвели 1 мл рухомої фази (ацетонітрил/вода/метанол у співвідношенні 3:94:3) і ретельно перемішали на вортексі протягом 30 секунд. Весь зразок загальним об'ємом 1 мл перенесли у скляну віалу й аналізували на рідинному хроматографі. Після цього вираховується концентрація дезоксиніваленолу у кожному проаналізованому зразку і визначено середню концентрацію, стандартне відхилення, повернення та коефіцієнт варіації (CV, %). 15 Таблиця Результати визначення кількості дезоксиніваленолу внесеного у плазму крові курчат-бройлерів Показник Х1, нг/мл Х2, нг/мл Х3, нг/мл Х4, нг/мл Х5, нг/мл Х1, нг/мл Х2, нг/мл Х3, нг/мл Х4, нг/мл X5, нг/мл Кс, нг/мл СВ П, % CV, % Концентрація дезоксиніваленолу, нг/мл додано 25 нг/мл додано 50 нг/мл додано 100 нг/мл 21,117 46,302 90,469 22,051 44,194 93,923 21,905 43,677 91,130 20,997 45,475 92,317 21,009 44,129 91,976 22,630 44,158 91,532 21,319 45,359 92,552 21,992 44,961 91,828 22,587 46,443 91,075 21,773 43,502 90,467 21,74 44,82 91,73 0,61 1,05 1,05 86,95 89,64 91,73 2,81 2,34 1,14 Псереднє = 89,44±2,39 %; СVсереднє = 1,26±0,86 % 20 25 30 де: СВ - стандартне відхилення; Кс - середнє значення отриманої концентрації аналізу; П повернення (П = (Кс х 100) / доданий вміст, %); CV - коефіцієнт варіації (CV = (СВ / Кс) х 100, %). Повернення обраховується для визначення правильності і становить: за вмістом дезоксиніваленолу 25 нг/мл - 86,95 %; 50 нг/мл - 89,64 %; 100 нг/мл - 91,73 %. Псереднє = 89,44±2,39 %, що відповідає мінімально допустимим значенням. Коефіцієнт варіації обраховується з метою порівняльного аналізу результатів. Що характеризують внутрішньо лабораторну відтворюваність і становить: за вмісту дезоксиніваленолу 25 нг/мл - 2,81 %; 50 нг/мл - 2,34 %; 100 нг/мл - 1,14 %. СVсереднє = 1,26±0,86 %. Технічним рішенням пропонованої корисної моделі - за допомогою способу визначення кількості дезоксиніваленолу у плазмі крові птиці є підтвердження діагнозу та встановлення ступеня тяжкості захворювання, що значно підвищить ефективність пошуку способів нейтралізації мікотоксинів та збільшить ефективність заходів і засобів профілактики та лікування мікотоксикозів, дасть змогу вирішити проблеми, пов'язані із вивченням механізму токсичної дії мікотоксинів на організм птиці. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб визначення кількості дезоксиніваленолу у плазмі крові птиці, що включає відбирання проб крові у птиці, отримання плазми крові, проведення екстракції, пропускання через картридж, елюювання та упарювання до сухого залишку, розчинення та утримання дезоксиніваленолу з використанням імуноафінної колонки, упарювання елюату екстракту і 2 UA 93016 U 5 відновлення в рухомій фазі, визначення дезоксиніваленолу за допомогою рідинного хроматографа, який відрізняється тим, що використовується 1 мл плазми крові, з якої дезоксиніваленол екстрагують 2 мл фосфатного буфера, для утримання використовується імуноафінна колонка, через яку пропускають розведений об'єм зразка, після чого - промивають 14 мл фосфатного буфера та 6 мл деіонізованої води, а елюювання проводять 4 мл метанолу, причому - елюат упарюють досуха та розводять 1 мл рухомої фази, аналіз проводять на рідинному хроматографі з діодно-матричним детектором та оберненофазовою хроматографічною колонкою із захисним картриджем з використанням рухомої фази ацетонітрил/вода/ метанол 3:94:3 (%). 10 Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3