Спосіб одержання імунобіологічного препарату для попередження та лікування кандидозної інфекції

Реферат: Спосіб одержання імунобіологічного препарату для попередження та лікування кандидозної інфекції на основі С. albicans та С. tropicalis, при якому антигени вивільнені дією на клітини ультразвуковою дезінтеграцією при довжині хвилі 20-24 кГц та інтенсивності 5-20 Вт/см протягом 15-60 хв. при температурі 25-30 °C, з подальшим розділенням рідкої та твердої фаз переважно центрифугуванням при швидкості обертання 3000-5000 об./хв, з подальшою попередньою та стерилізуючою фільтрацією, ультрафільтрацією та виділенням цільового продукту у діапазоні 1-50 кДа, з подальшим концентруванням білка 1-10 мг/мл у розчинах одержаних антигенів грибів С. albicans та С. tropicalis та їх змішуванням. UA 94138 U (12) UA 94138 U UA 94138 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до фармації, медицини та ветеринарії, а саме імунобіологічних препаратів для попередження та лікування кандидозної інфекції. За останні роки різко зросла кількість хворих на кандидоз серед людей та тварин, який викликається дріжджоподібними грибами роду Candida. Зростання захворюваності на кандидоз пов'язане з нераціональним використанням антибіотиків, гормонів, стероїдних препаратів, імунодепресантів та інших препаратів, а також посиленням патогенності самих дріжджоподібних грибів роду Candida. Кандидоз проявляється у різних формах, з яких найбільшу небезпеку представляють системний та вісцеральний кандидоз. Вони характеризуються тривалим протіканням хвороби, мають різноманітні клінічні прояви та часті рецидиви. Такі форми кандидозу важко піддаються лікуванню сучасними медикаментозними засобами, у тому числі і протигрибковими антибіотиками. У зв'язку з цим, для терапії кандидозних захворювань рекомендується використання специфічної стимуляції захисних механізмів. Для цього використовуються вакцини на основі грибів роду Candida. Відомий спосіб одержання вакцини проти кандидозу сільськогосподарських тварин, який полягає у культивуванні штаму гриба С. albicans № 253 у матрацах протягом 10 діб та подальшому виділенні за допомогою ультразвуку розчинного антигену зі штаму гриба С. . 8 . 8 3 albicans № 253 з активністю спор 4,5 10 -5,5 10 в 1 см та індексом агломерації 6-10 %, котрий уявляє собою цитоплазматичну фракцію гриба та ад'ювант [1]. Недоліком наведеного способу є довготривале культивування штаму грибів, що призводить до старіння культури та втрати активності, а також відсутність методів очищення та стандартизації препарату. Відомий спосіб одержання вакцини проти кандидозу людини, який полягає у культивуванні штаму гриба С. albicans № 253 протягом 28-36 годин та подальшому виділенні за допомогою ультразвуку розчинного антигену зі штаму гриба С. albicans № 253 з концентрацією клітин грибів . 8 . 8 1,85 10 -2,5 10 в 1 см дистильованої води, індексом імуногенності 6-9 % та вмістом ліпідів - до 0,2 %, полісахаридів - 50-76 %, пептидів з м.м. менше 10 Кд - 80-87 %, засіб містить як інактиватор - формалін, а як розчинник дистильовану воду [2]. Недоліком наведеного способу є нераціональне використання ресурсів тому, що одержана вакцина має недостатньо високу активність, забезпечує формування імунітету тільки проти гриба С. albicans і не може бути використана для лікування, а використовується тільки для попередження кандидозів. Відомий спосіб одержання вакцини проти вісцеральних мікозів кроликів, який полягає у культивуванні штаму гриба Mucor racemosus 195 та С. albicans № 253 і подальшому виділенні складових антигенів за допомогою ультразвуку зі штаму гриба Mucor racemosus 195 та штаму гриба С. albicans № 253, які культивували зі швидкістю культивування 28-36 годин та 88 3 3 концентрацією клітин гриба 1,85-10 2,5-10 в 1 см в 1 см дистильованої води [3]. Недоліком наведеного способу є нераціональне використання ресурсів тому, що одержана вакцина має недостатньо високу активність та забезпечує формування імунітету тільки проти гриба С. albicans і не може бути використана для лікування кандидозів. За прототип вибрано відомий спосіб одержання асоційованої вакцини проти кандидозу тварин, яка як антигени містить інактивовані бластоспори штамів С. albicans № 95 и С. tropicalis 3 № 87, взяті у рівних співвідношеннях по 10-40 млн бластоспор в 1 см 0,8-1 % розчину сірчанокислого натрію [4]. Недоліком наведеного способу є нераціональне використання ресурсів тому, що одержана вакцина має недостатньо високу активність. Задачею корисної моделі є розробка ефективного способу одержання імунобіологічного препарату для попередження та лікування кандидозної інфекції, який має протективні властивості та діє одночасно у відношенні кандидозних захворюваннях, викликаних різними видами грибів роду Candida. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб одержання імунобіологічного препарату для попередження та лікування кандидозної інфекції на основі С. albicans та С. tropicalis, згідно з корисною моделлю, здійснюється дією на клітини ультразвуковою дезінтеграцією при довжині хвилі 20-24 кГц та інтенсивності 5-20 Вт/см протягом 15-60 хв при температурі 25-30 °C, з подальшим розділенням рідкої та твердої фаз переважно центрифугуванням при швидкості обертання 3000-5000 об/хв, з подальшою попередньою та стерилізуючою фільтрацією, ультрафільтрацією та виділенням цільового продукту у діапазоні 150 кДа, з подальшим концентруванням білка 1-10 мг/мл у розчинах одержаних антигенів грибів С. albicans та С. tropicalis та їх змішуванням. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином. Культури дріжджоподібного гриба роду С. albicans та С. tropicalis окремо висівають у пробірки з агаром Сабуро та культивують у 1 UA 94138 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 термостаті протягом 2-х діб. Одержані культури окремо висівають у матраци з агаром Сабуро. Далі проводять культивування у термостаті протягом 4-12 діб. Клітини грибів С. albicans та С. tropicalis окремо руйнують ультразвуковою дезінтеграцією з подальшим розділенням рідкої та твердої фаз центрифугуванням, далі проводять попередню, стерилізуючу фільтрацію та ультрафільтрацією, здійснюють змішування одержаних антигенів грибів С. albicans та С tropicalis. Одержаний препарат стандартизують за вмістом білка. Імунобіологічний препарат для попередження та лікування кандидозної інфекції, отриманий за заявленим способом, містить суміш білків та полісахаридів. Полісахариди представлені моносахаридними елементами: манозою, у меншій кількості глюкозою. Новий імунобіологічний препарат для попередження та лікування кандидозної інфекції може бути використаний безпосередньо або у ліофілізованій формі. Усі параметри заявленого способу визначенні експериментальним шляхом, спосіб може бути здійснений за допомогою стандартного обладнання. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. Культури дріжджоподібного гриба роду С. albicans штам ССМ 335-867 та С tropicalis штам АТТС 20336 окремо висівають у пробірки з агаром Сабуро та культивують у термостаті при температурі 25±2 °C протягом 2-х діб. Одержану культуру змивають розчином ізотонічного стерильного 0,9 % натрію хлориду та окремо висівають у матраци з агаром Сабуро. Далі проводять культивування у термостаті при температурі 25±2 °C протягом 4-12 діб. Кожні 2 доби культуру з кожного матраца перевіряють на мікробіологічну чистоту шляхом мікроскопування. Одержану культури окремо змивають розчином ізотонічного стерильного 0,9 % натрію хлориду. Проводять окремо руйнування клітин грибів С. albicans та С. tropicalis ультразвуковою 2 дезінтеграцією при довженні хвилі 20-24 кГц та інтенсивності 5-20 Вт/см протягом 15-60 хвилин при температурі 25-30 °C, з подальшим розділенням рідкої та твердої фаз переважно центрифугуванням при швидкості обертання 3000-5000 об/хв. протягом 10-20 хв, проводять попередню та стерилізуючу фільтрацію на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,45 мкм та 0,22 мкм, проводять ультрафільтрацією та виділяють цільовий продукт у діапазоні 10 кДа, стандартизують розчини антигенів за вмістом білку С. albicans з концентрацією 3 мг/мл та С. tropicalis з концентрацією 5 мг/мл, змішують одержані антигени грибів С. albicans та С. tropicalis у співвідношенні 1:1 за допомогою електромішалки при швидкості обертання 100 об/хв., у випадку багатодозових контейнерів додають консервант. Приклад 2. Визначення протективної дії заявленого препарату проводили на білих мишах. Для оцінки здатності заявленого імунобіологічного препарату викликати протективні реакції проводили дослідження на здорових білих мишах двохмісячного віку масою 18-22 г по 6 тварин у контрольних та дослідних групах, які утримувалися в однакових умовах на стандартному раціоні. Перед дослідженнями тварини проходили акліматизацію в умовах експериментальної кімнати. Мишам внутрішньом'язово у верхню частину задньої правої лапи вводили одержаний імунобіологічний препарат у об'ємі по 0,2 мл. Через 14 днів, повторно, в верхню частину задньої лівої лапи вводили одержаний імунобіологічний препарат у об'ємі по 0,2 мл. Тваринам у контрольній групі вводили фізіологічний розчин. Через 1 місяць після імунізації проводили внутрішньочеревне зараження дослідних тварин. Для цього використовували суспензію грибів С. albicans штам ССМ 335-867 у кількості 20 млн. клітин та С. tropicalis штам АТТС20336 у кількості 60 млн. клітин в об'ємі 1 мл. Результати проб ураховували за кількістю різних проявів хвороби та оцінювали за наступною системою: (-) - відсутність проявів захворювання; слабка форма захворювання (+) неохайний вигляд, відмова від їжі, падіння ваги тіла, порушення функції вивідних органів; середня форма захворювання (+ +) - адинамія, неохайний вигляд, відмова від їжі, падіння ваги тіла, контрактури шийних м'язів, бокове розташування тіла, порушення функції вивідних органів, під час розтину при дослідженні слизових оболонок природних отворів були виявлені ознаки патологічних процесів, висівання грибів з фекалій тварин; розвинута форма захворювання (+ + +) - адинамія, неохайний вигляд, відмова від їжі, падіння ваги тіла, контрактури шийних м'язів, параліч кінцівок, судоми, бокове розташування тіла, порушення функції вивідних органів, при дослідженні слизових оболонок природних отворів, внутрішніх органів тварин були виявлені ознаки патологічних процесів: мікроабсцеси у корковому шарі нирок, у легенях, селезінці, печені та інших, виділення ретрокультур грибів з органів тварин (табл. 1). 2 UA 94138 U Таблиця 1 Протективна дія імунобіологічного препарату Препарати 15 20 ++ + Імунобіологічний препарат Фізіологічний розчин 10 ++ ++ Дослідні тварини 3 4 5 Результати через 1 місяць 2 Імунобіологічний препарат Фізіологічний розчин 5 1 ++ + ++ +++ ++ Результати через 3 місяці +++ ++ + ++ 6 ++ + ++ + В результаті проведених досліджень встановлено, що одержаний імунобіологічний препарат забезпечує 100 % тварин, протективні властивості протягом 3 місяців. Таким чином, одержаний препарат може використовуватися для попередження та лікування різних форм кандидозу, у тому числі вісцеральної форми, яка важко піддається діагностиці та лікуванню. Джерела інформації: 7 1. 1. Пат. 2217163 Российская Федерация, МПК А 61 К 39/00, C12N1/14. Вакцина против кандидоза сельскохозяйственных животных / Агольцов В. А., Ласкавый В.Н. (РФ). 2002104050/13; заяв. 19.02.2002; опубл. 27.11.2003. 7 2. Пат. 2281110 Российская Федерация, МПК А 61 К 36/06. Лекарственное средство против кандидоза человека для инъекций / Ласкавый В. Н., Шуманов В. М. (РФ). - 2005103460/15; заяв. 10.02.2005; опубл. 10.08.2006. 7 3. Пат. 2352355 Российская Федерация, МПК А 61 К 39/00, А 61 Р 31/00. Ассоциированная вакцина против висцеральных микозов кроликов / Ласкавый В. Н., Панфёров В. И., Малахова Е. А. (РФ). - 2007139596/13; заяв. 25.10.2007; опубл. 25.10.2007. 7 4. Пат. 2445109 Российская Федерация, МПК А 61 К 36/062, А 61 К 47/02, С 12 N 1/14. Ассоциированная вакцина против кожного кандидоза плотоядных, способ изготовления ассоциированной вакцины против кожного кандидоза плотоядных, способ профилактики и терапии кожного кандидоза плотоядных / Литвинов А. М., Апанасенко Н. А. (РФ). 2010127796/10; заяв. 07.07.2010; опубл. 07.07.2010. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб одержання імунобіологічного препарату для попередження та лікування кандидозної інфекції на основі С. albicans та С. tropicalis, який відрізняється тим, що антигени вивільнені дією на клітини ультразвуковою дезінтеграцією при довжині хвилі 20-24 кГц та інтенсивності 520 Вт/см протягом 15-60 хв. при температурі 25-30 °C, з подальшим розділенням рідкої та твердої фаз переважно центрифугуванням при швидкості обертання 3000-5000 об./хв, з подальшою попередньою та стерилізуючою фільтрацією, ультрафільтрацією та виділенням цільового продукту у діапазоні 1-50 кДа, з подальшим концентруванням білка 1-10 мг/мл у розчинах одержаних антигенів грибів С. albicans та С. tropicalis та їх змішуванням. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3