Спосіб прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей

Реферат: Спосіб прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей включає оцінку впливу стромальних фібробластів кісткового мозку на процеси функціонування еритроїдних елементів кісткового мозку. За відсотком еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі хворих на гостру лімфобластну лейкемію в періоді ремісії судять про концентрацію проліну в стромальних фібробластах кісткового мозку: якщо відсоток еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі вищий за 30 %, то концентрація проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку нормативна, якщо відсоток еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі нижчий за 30 %, то відповідно концентрація проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку знижена. UA 94268 U (12) UA 94268 U UA 94268 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини і може бути застосована для прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей за відсотком еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі, визначених в період ремісії захворювання. Відомий спосіб оцінки впливу мезенхімальних елементів, в тому числі стромальних фібробластів кісткового мозку, на процеси функціонування гемопоетичних стовбурових клітин. Проліферація і диференціювання кістковомозкових клітин досліджувалась з використанням матриці кісткових структур та вивчалась in vitro на довгострокових культурах тварин. Стовбурові клітини ідентифікувались за допомогою імунофенотипування. При дослідженні взаємодії між стромальними та гемопоетичними елементами в кістковому мозку використовувались мікрокапсули колагену стромальних клітин миші для відновлення кістковомозкової ніши для гемопоетичних стовбурових клітин. Матрицею слугувала кістка миші, яку заповнювали флуоресцентно міченими стромальними та гемопоетичними клітинами людини. Внаслідок взаємодії між стромальними та гемопоетичними елементами число гемопоетичних клітин на одиницю площі було значно більшим, ніж в чисто колагенових структурах [1]. Недоліком цього способу є відсутність інформації щодо активності процесів проліферації і диференціювання клітини-попередників та функціонального стану окремих ланок гемопоезу, зокрема еритроїдної. Не вивчалась функція стромальних фібробластів, як одних з елементів стромального мікрооточення, та концентрація їх амінокислотного складу. Не розглядалось питання відсоткового внеску еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі. Найбільш близьким аналогом по суті є спосіб оцінки стану процесів проліферації та диференціювання гемопоетичних клітин-попередників, включаючи стромальні кістковомозкові елементи, в тому числі фібробласти, та функціональних властивостей еритроїдних гемопоетичних клітин-попередників. Доведено, що стромальне мікрооточення, яке складається з тісно пов'язаних фібробластів, макрофагів і ендотеліальних клітин, є фізіологічною нішею для оптимального функціонування елементів еритроїдної ланки гемопоезу, починаючи з ранніх їх етапів. Дослідження стану стромальних кістковомозкових елементів, зокрема фібробластів, та клітин еритроїдної ланки системи кровотворення базуються на використанні поживних середовищ із додаванням цитокінів, які регулюють дозрівання еритроїдних клітин-попередників та впливають на стромальні фібробласти кісткового мочку, а також необхідності застосування моноклональних антитіл для їх ідентифікації [2]. Недоліком цього способу є відсутність інформації щодо парціального внеску еритроїдних клітин-попередників у складі кісткового мозку. Немає даних про амінокислотний склад фібробластів, зокрема концентрації проліну. Методика виконання є трудомісткою, багатоетапною, що потребує коштовної апаратури, реагентів та спеціально підготовленого персоналу. В основу корисної моделі поставлена задача визначення відсотку еритроїдних клітинпопередників в мієлограмі хворих на гостру лімфобластну лейкемію в період ремісії. Кістковий мозок отримується з грудини при проведені стернальної пункції, наноситься на предметні скельця, фарбується за Романовським-Гімзою та вивчається у світловому мікроскопі (збільшення n х 900). Підрахунок кількості еритроїдних клітин-попередників (еритробластів, пронормоцитів, нормоцитів) в мієлограмі представляється у відсотках. Поставлена задача прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей вирішується тим, що визначається процент еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі (еритробластів, пронормоцитів, нормоцитів) у дітей в період ремісії гострої лімфобластної лейкемії. В нормі відсоток еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі дітей становить від 16 % до 30 %. Стромальні фібробласти є компонентами позаклітинного матриксу. Вони відтворюють процеси колагеноутворення, підтримують структурну цілісність сполучної тканини та відповідають за гемопоетичне мікрооточення. Склад амінокислот та їх концентрація в стромальних фібробластах впливає на процеси утворення, відновлення та функціональні властивості колагену. Амінокислота пролін приймає участь у формуванні колагену. За наявністю дефіциту амінокислот, що формують колаген, в тому числі і проліну, виникають зміни в структурі колагену, дисбаланс елементів гемопоетичного мікрооточення, розвиток проявів мієлодисплазії, тривале відновлення кістковомозкового кровотворення та період мієлосупресії після цитостатичної терапії, що призводить до несприятливого перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей (розвиток рецидивів захворювання, скорочення медіани виживаності хворих). Представлений спосіб прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей досягається за рахунок спрощення методики роботи з фібробластами кісткового мозку. Методика дослідження концентрації проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку є багатоетапною. Першим етапом є процес вирощування колонієутворюючих одиниць фібробластів кісткового мозку (КУОф) за методом О.Я. Фріденштейна в модифікації В.А. 1 UA 94268 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Астахової, 2001, а саме з кісткового мозку, отриманого при стернальній пункції у хворого, і поживного середовища 199 виготовляють суспензію кістковомозкових клітин. Підраховують загальну кількість ядровмісних клітин. Суспензію клітин поміщають у чашки Петрі з розрахунку 3 2 5×10 на 1 см дна чашки. Культивування проводять у поживному середовищі 199 з 20 % вмістом сироватки крові людини, у газовій суміші з 5 % рівнем СО2 в атмосферному повітрі при 37 °C, протягом 14 діб без зміни культурального середовища. Через 14 діб фіксують колонії КУОф кісткового мозку етанолом 96°, фарбують за Романовським-Гімзою і підраховують кількість колоній, що виросли у кожній чашці. На другому етапі роботи змивають КУОф з культурального середовища, лізують клітини шляхом заморозки i відтаювання, відокремлюють строму клітин від внутрішньоклітинного вмісту шляхом центрифугування та отримують надосадову субстанцію, тобто суміш вільних амінокислот. Визначають концентрацію проліну в стромальних фібробластах кісткового мозку на амінокислотному аналізаторі типу Т-339. Встановлений зв'язок між концентрацією проліну в стромальних фібробластах кісткового мозку in vitro та відсотком еритроїдних клітин-попередників у кістковому мозку хворих на гостру лімфобластну лейкемію в періоді ремісії (rs=+0,46). Приклади здійснення способу. Приклад 1. Хвора М.О., 6 років (історія хвороби № 336, 2012 рік), обстежена в період ремісії гострої лімфобластної лейкемії. Відсоток еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі становив 8,2 %, концентрація проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку, вирощених in vitro, дорівнювала 0,84 мкмоль/л. Тобто, зниження відсотку еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі відповідало низькій концентрації проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку. Приклад 2. Хвора Л.Н., 7 років (історія хвороби № 801, 2012 рік), обстежена в період ремісії гострої лімфобластної лейкемії. Відсоток еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі становив 38,0 %, концентрація проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку, вирощених in vitro, дорівнювала 2,71 мкмоль/л. Тобто, підвищення відсотку еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі відповідало більш високій концентрації проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку. Дослідження відсотку еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі у дітей в період ремісії гострої лімфобластної лейкемії відповідало певній концентрації проліну у фібробластах кісткового мозку та перебігу захворювання. Нормативний відсоток еритроїдних клітинпопередників в мієлограмі у дітей відповідав сприятливому перебігу гострої лімфобластної лейкемії. Запропонований спосіб прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей за відсотком еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі, визначених в період ремісії захворювання, може бути застосований у гематологічних відділеннях обласних лікарень України та онкогематологічних диспансерах, де лікуються діти із зазначеною патологією. Список використаних джерел: 1. W.Lai, Y.Li, S.Mak, et al. Reconstitution of bone-like matrix in osteogenically differentiated mesenchymal stem cell-collagen constructs: A three-dimensional in vitro model to study hematopoietic stem cell niche. J Tissue Eng. 2013; 4: 2041731413508668. 2. Marshall A. Lichtman, Williams Manual of Hematology, Eighth Edition, 2010, 756 p. The McGraw Hill Companies Inc.: 16. Hematopoietic Stem Cells, Progenitors and Cytokines. Kenneth Kaushansky, pp. 231-250. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб прогнозу перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей, що включає оцінку впливу стромальних фібробластів кісткового мозку на процеси функціонування еритроїдних елементів кісткового мозку, який відрізняється тим, що за відсотком еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі хворих на гостру лімфобластну лейкемію в періоді ремісії судять про концентрацію проліну в стромальних фібробластах кісткового мозку: якщо відсоток еритроїдних клітинпопередників в мієлограмі вищий за 30 %, то концентрація проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку нормативна, якщо відсоток еритроїдних клітин-попередників в мієлограмі нижчий за 30 %, то відповідно концентрація проліну у стромальних фібробластах кісткового мозку знижена. 2 UA 94268 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3