Спосіб виявлення рнк вірусу чуми м’ясоїдних за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Спосіб виявлення РНК вірусу чуми м'ясоїдних за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції(ЗТ-ПЛР). Для проведення ЗТ-ПЛР використовують розроблені, штучно синтезовані, олігонуклеотидні праймери. UA 94267 U (12) UA 94267 U UA 94267 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, зокрема до лабораторної діагностики, призначена для виявлення специфічних фрагментів нуклеїнових кислот (РНК) вірусу чуми м'ясоїдних (Canine Distemper Virus), може бути використана для проведення діагностики чуми м'ясоїдних, в науково-дослідних роботах, в біотехнологічному виробництві вакцин, в навчальних процесах. Чума м'ясоїдних (Pestis carnivorum, Feebris catarrhal infeciosa canum, хвороба Карре) - гостра висококонтагіозна хвороба м'ясоїдних вірусної етіології, що характеризується лихоманкою, запаленням слизистих оболонок, пневмонією, шкірною екзантемою, кон'юктивітом, катаральним запаленням шлунково-кишкового тракту та ураженням нервової системи (1) Хворіють тварини всіх вікових груп, особливо молодняк. Захворювання реєструють в будь-яку пору року, проте восени та навесні найчастіше протікає в формі епізоотії. Летальність коливається від 60 до 90 %. Чума відома ще з часів одомашнення тварин, та вже зараз широкий спектр ураження вірусу охоплює не лише собак, але й інших хижаків. В природних умовах 8 из 11 сімейств загону Хижаки чутливі до інфекції чумою. Вірус чуми м'ясоїдних стійкий до дії різних фізичних та хімічних факторів (2). Вірус знаходиться в спорідненості з вірусом кору людини, а також має односторонній антигенний зв'язок з вірусом чуми великої рогатої худоби (3). В імунологічному відношенні різні штами вірусу чуми, виділені від хворих собак в різних географічних зонах, однорідні та різняться лише вірулентністю (4). На сьогоднішній день дрібні домашні тварини посіли не аби яку роль в нашому житті, вони стали нашими компаньйонами, які існують пліч-о-пліч з людиною. Тому захворювання домашніх улюбленців спричиняють великі незручності власникам, а особливо, якщо захворювання пов'язано з вірусною інфекцією. Актуальної задачею ветеринарних спеціалістів є пошук нових методів лікування та профілактики чуми м'ясоїдних, та велику роль в дієвому лікуванні грає й своєчасна діагностика захворювання. Діагноз чуми м'ясоїдних ставлять з урахуванням епізоотичних даних, клінічних ознак, патолого-анатомічних змін, а також результатів лабораторних досліджень (5). Для встановлення діагнозу чуми м'ясоїдних використовують лабораторну діагностику, проведення якої сприяє виявленню антигенів збудника та антитіл. (6). Існуючі серологічні методики (РДЗК, РПГА и др.) не дають стабільних результатів при діагностиці чуми м'ясоїдних (7). Окрім того останнім часом встановлення діагнозу дещо ускладнене, так як активна імунізація тварин сприяла стиранню картини деяких характерних ознак захворювання. Саме тому перед нами була поставлена задача розробити новий експресметод діагностики чуми м'ясоїдних. Правильний вибір олігонуклеотидних праймерів визначає ефективність і відтворюваність ЗТ-ПЛР. Задача корисної моделі розробити діагностичну тест-систему на основі ЗТ-ПЛР для виявлення та ідентифікації вірусу чуми м'ясоїдних в біологічному матеріалі різного походження. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виявлення РНК вірусу чуми м'ясоїдних за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (РНК) за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР), згідно з корисною моделлю, для проведення ЗТ-ПЛР використовують розроблені, штучно синтезовані, олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: CDV F5-5'-AGGAGCAAGTTTGGATTCTGAGG-3' CDV R6-5'-GACACTAGCTGAGCCTCTTCC-3'. В досліджуваних зразках виявляють специфічні фрагменти нуклеїнових кислот (РНК) за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) ферментативної реакції і двох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки кДНК інфекційного агента при температурних і часових параметрах та кількості циклів: № циклу 1 2 3 4 Температура 95 °C 95 °C 58 °C 72 °C 72 °C 10 °C Час 4 хв 0,5 хв 0,5 хв 0,5 хв 4 хв Зберігання 1 Кількість циклів 1 30 1 UA 94267 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Використовують два штучно синтезовані олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: CDV F5-5'-AGGAGCAAGTTTGGATTCTGAGG-3' CDV R6-5'-GACACTAGCTGAGCCTCTTCC-3'. Розроблені праймери CDV F5 та CDV R6 специфічні консервативній ділянці гена нуклеопротеїну (N) вірусу ("conserved region of the nucleocapsid protein N gene") РНК вірусу CDV і забезпечують синтез фрагмента ДНК розміром 827 н.з. при температурі відпалу 58 °C. Приклад: пробу (гомогенат патологічного матеріалу, тощо) (1 г) поміщають у пластикову 3 3 пробірку ємністю 1,5 см і додають 0,5 см деіонізованої води. Суміш струшують і центрифугують, після чого проводять виділення РНК набором реагентів для виділення РНК. З виділеної РНК за допомогою реакції зворотної транскрипції синтезують кДНК. Отриману кДНК 3 3 3 (0,003-0,005 см ) поміщають у пробірку ємністю 0,5 см і додають 0,02 см (5Х) ПЛР-буфера, 3 3 3 0,001 см dNTP, по 0,00015 см кожного з праймерів, 0,0005 см Taq-полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад "Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму. Аналіз результату ЗТ-ПЛР проводять в 1,5 % гелі агарози з барвником - бромистим етидієм. 3 В лунки агарозного гелю вносять 0,010-0,012 см ампліфікованої суміші. Результати оцінюють при перегляді гелю після елекрофорезу на трансілюмінаторі під УФсвітлом по наявності (чи відсутності) червоно-помаранчевих фрагментів нуклеїнової кислоти певного розміру (827 н.з.). Специфічність ампліфікованого фрагмента нуклеїнової кислоти визначали його положенням (розміром) відносно фрагментів стандартних маркерів. Джерела інформації: 1. Сюрін В.Н., Белоусов Р.В., Фоміна Н.В. Діагностика вірусних хвороб тварин. - М: Агропромвидат, 1991. - с. 228-237. 2. Шуст Д.Ф., Носкова А.Д., Третяк Т.В. Довідник собаківника-любителя. Київ.: ПТОО "А.С.До", 1993. - с. 90. 3. Слугін B.C. Чума м'ясоїдних. // Епізоотологія і інфекційні хвороби. Під ред. Конопаткіна А.А. - 2-е перераб. і доп. видавництво - М.: Колос, 1993. - с. 620-623. 4. Бєлов А.Д., Данилов Е.П. та iн. Хвороби собак, - М: " Колос", 1995. - с. 259-270. 5. Гертман М.И. Чума м'ясоїдних. / Діагностика, лікування і профілактика інфекційних хвороб собак. Укладач Гизатуллина Ф.Г. - Челябінськ: Челябінський Будинок друку, 1998. - с. 17-23. 6. Притулін П.І., Привалова Н.В. Експрес-імунологічні методи при індикації і діагностиці інфекційних хвороб тварин // Сб. науч. тр. / ВИЭВ. - 1984: Актуальні проблеми ветеринарії в промисловому тваринництві. - Т. 60. - с. 35-41. 7. Ігнатов П.Е. та інш. Нариси про інфекційні хвороби у собак. - М.: Валта. - 1995. - с. 13-41. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб виявлення РНК вірусу чуми м'ясоїдних за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнової кислоти (РНК) за допомогою зворотно-транскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР), який відрізняється тим, що для проведення ЗТ-ПЛР використовують розроблені, штучно синтезовані, олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: CDV F5 - 5'-AGGAGCAAGTTTGGATTCTGAGG-3' CDV R6 - 5'-GACACTAGCTGAGCCTCTTCC-3'. 50 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2