Спосіб хроматографічного визначення сумарного жирнокислотного складу біологічних рідин

Спосіб хроматографічного визначення сумарного жирнокислотного складу біологічних рідин, який включає відділення ліпідів від матричного матеріалу, який відрізняється тим, що рідкий зра C2 2 (11) 1 3 В даний час дослідження жирнокислотного складу біологічних об'єктів у всіх випадках починається з екстракційного вилучення суми ліпідів та концентрування екстракту. Сучасні варіанти цього способу (наприклад, екстракція вуглекислотою в надкритичних умовах [1]) представляють безсумнівний інтерес для хімічної технології та біотехнології, однак як спосіб лабораторного дослідження вважаються малоперспективними. В ході лабораторних досліджень відділення ліпідів від матричного матеріалу в усіх випадках, що нам відомі, проводиться за способом Фолча. Отже, саме цей спосіб слід вважати прототипом за відсутністю спрощених безекстракційних варіантів. Суть загальновідомого і надзвичайно популярного способа Фолча полягає в дворазовій екстракції рідкого зразка або гомогенізату великими (зазвичай 6- або 10-кратними) обсягами суміші хлороформу з метанолом, 2:1, і промиванням об'єднаних екстрактів ізотонічним розчином хлоридів натрію або калію [2]. Інколи зустрічаються посилання на можливість використання суміші спирту з вуглеводнем [3]. Даний спосіб має ряд суттєвих недоліків: вихід ліпідів при їх екстракції за способом Фолча в оптимальних умовах складає 90-95 %, однак величина ступеня вилучення відчутно залежить, наприклад, від ефективності гомогенізації вихідного матеріалу. Фрагменти жирних кислот, що хімічно іммобілізовані на клітинних мембранах або ковалентно зв'язані в молекулах гліколіпідів і ліпопротеїдів, не можуть бути вилучені в ході екстракції за Фолчем; зрозуміло, що переведенню в метилові ефіри вони вже не піддаються і не можуть бути визначені за допомогою газової хроматографії. Також, як правило, трифазні суміші "водний метанол - хлороформ - дрібнодисперсний твердий матеріал" після екстракції зразка за Фолчем розшаровуються дуже погано, потребують тривалого (іноді багатогодинного) настоювання, фільтрування або ефективного центрифугування. Такі процедури є вкрай трудомісткими й тривалими, і до того ж не піддаються автоматизації чи суттєвому спрощенню. Операції з великими обсягами розбавлених розчинів ліпідів в органічних розчинниках завжди супроводжуються частковим окисленням і фотодеструкцією поліненасичених сполук. Використання ж низьких температур, інертних атмосфер і попередньо дегазованих розчинників надзвичайно ускладнює препаративні роботи. В основу винаходу поставлена задача створити варіант хроматографічного визначення сумарного жирнокислотного складу зразка, що був би вільний від перерахованих вище недоліків прототипу (крайня трудомісткість, необхідність тривалих маніпуляцій з розбавленими розчинами, неповнота екстракції ліпідів). Отже, запропоновано спосіб хроматографічного визначення сумарного жирнокислотного складу біологічних рідин, який включає відділення ліпідів від матричного матеріалу, який відрізняється тим, що рідкий зразок біологічного матеріалу, а саме кров, сироватка, суспензія клітин, гомогенізат тка 94373 4 нини, сушать для одержання зразка безводного біологічного матеріалу в апараті сублімаційного сушіння або в ротаційному вакуумному концентраторі типу "Savant SpeedVac", при цьому аліквоту зразка досліджуваного рідкого біологічного матеріалу в кількості 20-500 мкл зневоднюють безпосередньо в пробірці для дериватизації, а ліпіди висушеного зразка біологічного матеріалу у цій же пробірці перетворюють у відповідні метилові ефіри нагріванням з розчином 0,5 N метилату натрію в метанолі з розрахунку 150 мкл розчину метилату натрію на 100 мкл крові або 15 % гомогенізату, а присутні вільні жирні кислоти нагрівають з 10 % метанольним розчином трифтористого бору з розрахунку 0,8-1,0 мл на 100 мкл крові або 15 % гомогенізату, причому після закінчення метилювання спиртовий розчин зразка біологічного матеріалу розбавляють дистильованою водою вдвічі, після чого екстрагують одержані метилові ефіри жирних кислот в гептанову неполярну фазу, при цьому дещо уповільнене розшарування водно-спиртової та неполярної гептанової фази на стадії екстракції ефірів з реакційної суміші прискорюють додаванням краплі пропілового спирту або короткочасним (1-2 хв.) центрифугуванням в низькооборотній центрифузі, після чого екстраговані в гептанову фазу метилові ефіри жирних кислот визначають кількісно способом капілярної газової хроматографії на колонці з полярною іммобілізованою рідкою фазою. Основна перевага пропонованого нами способу полягає в принциповому спрощенні та прискоренні підготовки біологічного зразка для хроматографічного аналізу. Продуктивність сушильних установок типу "SpeedVac" дуже висока і визначається тільки числом гнізд в каруселі центрифуги (те ж саме справедливо стосовно препаративних приладів для сублімаційного сушіння); таким чином, кілька десятків зразків можуть бути висушені, прометильовані і повністю підготовлені до аналізу протягом порівняно короткого часу (2,5-3 години). Здається істотною і та обставина, що процес підготовки зразка за цим способом полягає у виконанні послідовності нескладних операцій, що не вимагають високої кваліфікації персоналу та легко автоматизуються - на відміну від повсюдно використовуваної в даний час схеми "дворазова екстракція за Фолчем - промивання - концентрування дериватизація". Одже, як бачимо, даний спосіб може бути використаний у великомасштабних дослідженнях та є зручним для використання. Зразки цільної крові, плазми, еритроцитарної маси надані Серпуховською станцією переливання крові. Гомогенізати (м'язової і печінкової тканини) отримані за допомогою стандартного поршневого гомогенізатора. Спосіб здійснюється наступним чином. Приклад У скляні пробірки для роботи під тиском вміщують по 100 мкл досліджуваних зразків рідких біологічних матеріалів, додають по 100 мкл розчину внутрішнього стандарту в метанолі (маргаринова кислота, 200-600 мкг/мл), поміщають пробірки до гнізд карусельної центрифуги установки "Savant SpeedVac" і сушать зразки у вакуумі при кімнатній 5 температурі до повітряно-сухого стану (30-60 хв.). До ідентичного результату приводить використання сублімаційноі сушарки «Іней 3-2» (у цьому випадку спиртовий розчин внутрішнього стандарту додавався до зразка вже після її ліофілізації). Дериватизацію проводять відповідно до рекомендацій [3]. До висушеного залишку біологічного матеріалу додають 150 мкл 0,5 N розчину метилату натрію в метанолі і нагрівають 2-3 хв. в настільному термоблоці при температурі 60-65 ºС, після чого додають 1,0 мл 10 % метанольного розчину трифториду бору, щільно загвинчують кришку пробірки і нагрівають суміш протягом 40 хв. при 75ºС. До ідентичного результату приводить сапоніфікація сухого зразка дією 150 мкл 0,5 N розчину їдкого натру (замість метилату натрію) у метанолі і подальше нагрівання з 1 мл суміші «2N метанольний розчин сухого хлористого водню - бензол - 2,2диметоксипропан», із співвідношенням 100:20:5. Температурні умови лужної сапоніфікації і кислого метилювання в цьому випадку ідентичні наведеним вище. Після закінчення метилювання в охолоджені пробірки вносять по 1,0 мл чистого нгептану, 1,0 мл води, екстрагують метилові ефіри в вуглеводневу фазу. До верхньої фази додають 10 мкл н-пропанолу і домагаються повного розшарування емульсії з використанням низькооборотної центрифуги установки "Savant SpeedVac" (1-2 хв.). Екстраговані в гептанову фазу метилові ефіри визначають способом газової хроматографії. Умови хроматографування Використовують аналітичний газовий хроматограф «Варіан 3900» (США) і кварцову капілярну колонку з іммобілізованою нерухомою фазою «Супелковакс-10» (15 м  0,25 мм  0,3 мкм) виробництва «СУПЕЛКО», Швейцарія. Введення зразка (2 мкл) - без поділу потоку газу-носія (гелій), перехід до режиму поділу потоку - через 12-30 секунд, залежно від концентрації досліджуваних речовин. Температурна програма аналізу - від 90 ºС (0,5хв.) 94373 6 до 240 ºС (5 хв.) зі швидкістю 6 С/хв.. Детектор полум'яно-іонізаційний (260 ºС), реєстрація сигналу - комп'ютерна програма «Мультіхром-1, 5х» виробництва ЗАТ «Амперсенд», РФ. Кількісне визначення - за способом внутрішнього стандарту (з попереднім обчисленням відповідних калібрувальних коефіцієнтів з хроматограми модельної суміші жирних кислот з стандартною маргариновою кислотою). Результати Дослідники рідко використовують абсолютні значення концентрацій певних ЖК у медикодіагностичних цілях: величини абсолютних концентрацій сильно залежать від ступеня розбавлення зразка крові консервантом і антикоагулянтом, від величин препаративних втрат зразка на різних стадіях роботи, від похибок при відборі аліквот, визначенні калібрувальних коефіцієнтів та інших факторів . Крім того, в ході фракціонування біоматеріалу (наприклад, отримання еритроцитарної або тромбоцитарної маси, ліпопротеїнів високої та низької щільності і т.д.) визначення сухої ваги фракцій, як правило, виявляється вельми скрутним. З наведених причин для побудови біомедичних кореляцій частіше використовуються відносні величини: відносини концентрацій суми насичених кислот до суми поліненасичених, відносини сумарних концентрацій ώ3- і ώ6-кислот, відношення концентрацій кислот C20:4ώ6 / C20:5ώ3 та ін. Подібний підхід дозволяє звести до мінімуму похибки препаративних та аналітичних маніпуляцій, забезпечує значно кращу міжлабораторну відтворюваність результатів. Тому для порівняльної оцінки метрологічних характеристик двох обговорюваних аналітичних способів в таблиці наведено величини середніх значень і довірчих інтервалів (при 95 % надійності) ряду безрозмірних відносин концентрацій індивідуальних жирних кислот у біологічних зразках різної природи. 7 94373 8 Таблиця Середні значення співвідношень вагових концентрацій індивідуальних жирних кислот у біологічних об'єктах (і довірчі інтервали середніх значень), визначені: (1) прямим метилюванням сухої біомаси (спосіб описаний вище); (2) метилюванням ліпідів, попередньо екстрагованих за Фолчем (класичний спосіб [2]); (3) метилюванням ліпідів, екстрагованих сумішшю гексану з ізопропанолом (однократна екстракція відповідно до [3, с 155]). Об’єкт цільна кров n=6 цільна кров n=6 цільна кров n=1 Кров цільна, попередньо екстрагована за Фолчем1, n=1 Плазма, n=5 Плазма, n=5 Плазма, n=1 Плазма, попередньо екстрагована за Фолчем2, n=1 Еритроцитарна маса, n=5 Еритроцитарна маса, n=5 Еритроцитарна маса, попередньо екстрагована за Фолчем3, n=1 Гомогенізат тканини бичачої печінки, n=4 Гомогенізат тканини бичачої печінки , n=4 Гомогенізат тканини бичачої печінки, попередньо екстрагована за Фолчем4, n=1 Гомогенізат тканини грудного м'яза курки, n=5 Гомогенізат тканини грудного м'яза курки, n=5 Гомогенізат тканини грудного м'яза курки, попередньо екстрагована за Фолчем5, n=1 Співвідношення концентрацій (± довірчий інтервал, Р = 0,95, n=4-6) 16:0/1 8:0 18:0/18:2 18:2/20:4 18:2/22:5 18:2/22:6 20:4/20:3 2,23± 0,18 0,45±0,02 2,07±0,07 34,0±2,8 6,43±0,40 5,72±0,07 2,26± 0,14 0,43±0,04 2,18±0,09 37,5±2,8 6,97±0,27 5,65±0,08 5,7 0,22 4,2 51 20 4,3 1,3 0,86 1,85 36 8,6 6,65 3,09± 0,04 3,14± 0,08 4,1 0,89 0,212±0,005 0,214±0,003 0,48 1,38 3,71±0,15 3,70±0,21 2,06 3,25 116±16 124±21 34,2 10,1 19,4±2,7 17,4±2,0 6,83 >130 4,42±0,11 4,40±0,11 5,75 1,51 1,98± 0,29 0,60±0,20 2,00±0,13 18,3±4,4 4,29±0,94 8,8±1,5 1,98± 0,19 0,66±0,07 1,99±0,19 16,5±2,4 3,97±0,48 7,9±1,6 1,16 1,40 1,57 36,2 4,36 7,2 0,478 ±0,014 2,38±0,06 1,42±0,06 1,89±0,20 4,70±0,43 1,382±0,013 0,468 ±0,024 2,39±0,05 1,39±0,05 1,75±0,19 4,32±0,46 1,386±0,023 1,288 2,54 29,6 50 50 12 1,540 ±0,072 0,502±0,012 3,45±0,17 35,4±3,2 26,2±2,2 6,03±0,14 1,619 ±0,105 0,58 5±0,051 3,44 ±0,18 34,2±2,5 25,3± 2,7 6,18 ±0,16 4,5 80 54 40 1,600 0,94 1 Залишок ліпідів, не екстрагуються за Фолчем, - 3,6 відн. %. Залишок ліпідів, не екстрагуються за Фолчем, - 3,5 відн. %. 3 Залишок ліпідів, не екстрагуються за Фолчем, - 18 відн. %. 4 Залишок ліпідів, не екстрагуються за Фолчем, - 1,5 відн. %. 5 Залишок ліпідів, не екстрагуються за Фолчем, - 6,5 відн. %. 2 Аналіз наведених експериментальних даних дозволяє зробити деякі практично важливі висновки. - Пропонований нами спосіб прямого метилювання висушеної біомаси призводить до результа тів, що статистично не відрізняються від отримуваних при використанні класичного способу Фолча. Близькість величин довірчих інтервалів в обох способах свідчить про те, що розкид параметрів обумовлений швидше причинами хроматографіч 9 94373 ної природи (дискримінація компонентів у випарнику, неточності інтегрування малих піків та інше), ніж факторами, пов'язаними з особливостями хімічної підготовки зразків. - Ліпіди, що екстрагуються за Фолчем, характеризуються істотно іншим жирнокислотним складом у порівнянні з ліпідами того самого зразка, що за Фолчем, однак, не екстрагуються. Це слід враховувати при плануванні тонких ліпідних досліджень: «ідентичність» результатів (табл.), отриманих способами 1 і 2, обумовлена лише порівняльно незначним вмістом (кілька відсотків від суми ліпідів) не виділеного залишку. - Одноразова екстракція біологічного матеріалу сумішшю спирту з вуглеводнем (спосіб 3) не може бути рекомендована для визначення жирнокислотного складу зразків. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 10 Винахід може бути використаний для масштабних скринінгових досліджень жирнокислотного спектру біологічних субстратів у клінічних та біохімічних лабораторіях, що значно спрощує підготовку зразка до проведення аналізів і сприятиме оптимізації лабораторної діагностики. Джерела інформації: 1. Под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А. Практикум по биохимии. Изд. 2, издательство Московского Университета, 1989. С. 68-70. 2. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissues. J.Biol.Chem. 1957, 226:497-509. - прототип. 3. Knapp D.R. Handbook of analytical derivatization reactions. A Wiley-Interscience Publication, John Wiley&Sons Inc. New York, 1979. P. 154, с. 155, 164-167. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601