Спосіб виділення амітриптиліну та інших ліпофільних речовин з біологічного матеріалу

Реферат: UA 95171 U UA 95171 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до аналітичної хімії, а саме до аналізу амітриптиліну та інших ліпофільних речовин в біологічних об'єктах, і може знайти застосування у хімікотоксикологічному аналізі при виділенні вказаних речовин з біологічного матеріалу. Загальноприйняті у хіміко-токсикологічному аналізі методи ізолювання лікарських речовин базуються на екстракції їх гідрофільними (підкислена вода, підкислений етанол) або амфіфільними розчинниками (ацетонітрил, ацетон) [Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия / Т.Х. Вергейчик. - М.: МЕДпресс-информ, 2009. - 400 с]. Ефективність виділення ліпофільних сполук з використанням вищезазначених методів звичайно є низькою, що пов'язано або з низьким ступенем екстракції ліпофільних речовин з біологічної тканини за допомогою гідрофільних розчинників або з втратою речовини, що вилучається, під час екстракційної очистки, яка є одним з найбільш поширених етапів пробопідготовки у сучасному хімікотоксикологічному аналізі, і звичайно проводиться в системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник. При цьому разом з жирами та ліпідами, які є складовою частиною ендогенних домішок, в органічну фазу, що відкидається, переходить і певна частина досліджуваної ліпофільної речовини. Відомий метод ізолювання пестицидів та лікарських речовин за допомогою елюювання їх хлороформом із гомогенізованого біологічного матеріалу [Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: справ. / М.А. Клисенко, А.А. Калинина, К.Ф. Новиков и др. - М.: Колос, 1992. - Т. 1. - С. 159; Маміна О.О. Пробопідготовка при ізолюванні отрут основного та кислотного характеру з тканини печінки трупа хлороформом / О.О. Маміна, В.В. Болотов // Запорожский мед. журн. - 2006. - № 5. - С. 38-41] також пов'язаний з необхідністю додаткової очистки отриманих елюатів. Використання для цієї мети екстракції у системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник, як вказувалось вище, приводить до втрати ліпофільних речовин під час їх виділення з біологічного матеріалу. Задача корисної моделі полягає у створенні способу виділення ліпофільних речовин з біологічного матеріалу, що передбачає використання ліпофільного розчинника хлороформа та проведення додаткової екстракційної очистки при таких умовах, коли мінімізується втрата досліджуваної речовини, що вилучається з біологічного об'єкту. Поставлена задача вирішується таким чином, що проводиться зневоднення біологічної тканини шляхом її розтирання з натрій сульфатом безводним, амітриптилін чи іншу ліпофільну речовину елюють з отриманої маси за допомогою хлороформу, який є гарним розчинником як для ліпофільних сполук, так і для жирів та ліпідів, в яких розчиняється певна кількість досліджуваної речовини; екстракційна очистка елюатів від ендогенних домішок, як передбачено корисною моделлю, проводиться в два етапи: підлуженою водою (рН 8), а потім за допомогою системи неводних розчинників н-гексан - ацетонітрил. Як показали модельні "холості" досліди з біологічним матеріалом, у підлужену воду переходять водорозчинні ендогенні домішки, так УФспектр водної підлуженої фази, що відкидалася, показав значне світлопоглинання з максимумом абсорбції в діапазоні довжин хвиль 240-280 нм, значення оптичної густини при цьому дорівнювали 0,05-0,23. Жири та ліпіди, а також розчинений в них амітриптилін (або інша ліпофільна речовина), розчиняються в н-гексані, з якого потім досліджувана речовина екстрагується ацетонітрилом. Триразова екстракція амітриптиліну та інших ліпофільних речовин з гексану ацетонітрилом в модельних дослідах показала, що вказані речовини повністю екстрагуються ацетонітрилом. Така операція дозволяє очистити амітриптилін та інші ліпофільні речовини від жирів та ліпідів. Заявлений спосіб здійснюють таким чином: наважку біологічної тканини (печінка) переносили до ступки, додавали потрійну кількість натрій сульфату безводного і розтирали до утворення однорідної сипкої маси. Отриманий об'єкт переносили до скляної колонки діаметром 20 мм, в нижню частину якої заздалегідь, перед заповненням, вміщували невеликий ватний тампон. Через відкритий кран колонку заповнювали хлороформом за допомогою гумової груші до утворення "дзеркала" над поверхнею об'єкту завтовшки до 2 см. Кран закривали і над колонкою встановлювали ділильну лійку з хлороформом (50 мл). Через колонку пропускали хлороформ зі швидкістю 60-80 крапель за хвилину. Отримані елюати переносили до ділильної лійки і додавали 50 мл води, підлуженої 25 % розчином амоній гідроксиду до рН 8 і збовтували протягом 5 хвилин. Після цього воронку залишали на 5 хвилин для розділення фаз, хлороформний шар відокремлювали, пропускаючи його через паперовий фільтр, який вміщував 1,0 г безводного натрію сульфату. Елюати збирали у порцелянові чашки і випарювали на водяній бані при температурі не вище, ніж 40 °C або під струмом азоту до видалення органічного розчинника. Сухий залишок розчиняли в 10 мл н-гексану та проводили триразову екстракцію амітриптиліну (або іншої ліпофільної речовини) ацетонітрилом по 5 мл кожного разу. Ацетонітрил випарювали на водяній бані при температурі не вище, ніж 40 °C або під струмом 1 UA 95171 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 азоту до видалення органічного розчинника, сухий залишок розчиняли в 5 мл хлороформа та кількісно переносили до мірної колби на 10 мл і доводили до позначки зазначеним розчинником. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1 Амітриптилін є ліпофільною речовиною, про що свідчать високі значення його коефіцієнту ліпофільності (log Р(октанол/вода)=4,94), а також об'єму розподілу (V d=15л/кг) [Clark's analysis of Drugs and Poisons: Third edition [Електронний ресурс] / Ed. Laurent Υ Galichet. - London: Pharmaceutical Press, 2005.-1 електрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см. - Систем. Вимоги: Pentium; 128 Mb RAM; CD-ROM Windows XP / Vista. -Назва з титул, екрану]. До модельних проб печінки (5 г) додавали водні розчини амітриптиліну гідрохлориду, що у перерахунку містили 500 мкг амітриптиліну-основи. Об'єкти залишали на добу при кімнатній температурі, а потім виділяли амітриптилін за запропонованим способом. Аналіз амітриптиліну в отриманому хлороформному екстракті проводили методом ВЕРХ з мультихвильовим УФдетектуванням. Ідентифікацію амітриптиліну здійснювали за часом утримування (t R = 22,80±0,02 хв., RSD=0,03 %,  = 0,09 %, Р=95 %, =2), кількісне визначення - за залежністю площі піку від концентрації (мкг/мл) при max=240 нм. Ступінь виділення амітриптиліну з біологічного матеріалу за заявленим способом складав 42,0±4 %. Згідно з результатами наших попередніх дослідів, ступінь ізолювання водою, підкисленою кислотою оксалатною (метод Васильєвої А.О.) складав 16±1 %, етанолом, підкисленим кислотою оксалатною (метод Стаса-Отто) - 11±1 %, водою, підкисленою кислотою сульфатною (метод Крамаренка В.П.) - 9±1 %, підкисленим ацетонітрилом (метод Сшедзінські) - 30±2 %, ацетоном (метод Карташова В.А.) - 34±3 %, хлороформом з гомогенізованої біологічної тканини з наступною екстракційною очисткою в системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник - 13±1 %. Приклад 2 Венлафаксин є ліпофільною речовиною, про що свідчить високе значення його об'єму розподілу (Vd = 4-12 л/кг) [Clark's analysis of Drugs and Poisons: Third edition [Електронний ресурс] / Ed. Laurent Υ Galichet. - London: Pharmaceutical Press, 2005.-1 електрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см. -Систем. Вимоги: Pentium; 128 Mb RAM; CD-ROM Windows XP / Vista. - Назва з титул, екрану]. До модельних проб печінки (5 г) додавали водні розчини венлафаксину гідрохлориду, що у перерахунку містили 500 мкг венлафаксину-основи. Об'єкти залишали на добу при кімнатній температурі, а потім виділяли венлафаксин за запропонованим способом. Аналіз венлафаксину в отриманому хлороформному екстракті проводили методом ВЕРХ з мультихвильовим УФдетектуванням. Ідентифікацію венлафаксину здійснювали за часом утримування (tR = 17,81±0,08 хв., RSD=0,20 %, =0,51 %, Р=95 %, =2), кількісне визначення - за залежністю площі піку від концентрації (мкг/мл) при max=280 нм. Ступінь виділення венлафаксину з біологічного матеріалу за заявленим способом складав 51±3 %. Згідно з результатами наших попередніх дослідів, ступінь ізолювання водою, підкисленою кислотою оксалатною (метод Васильєвої А.О.), складав 44±2 %, етанолом, підкисленим кислотою оксалатною (метод Стаса-Отто) - 36±3 %, водою, підкисленою кислотою сульфатною (метод Крамаренка В.П.) - 28±3 %, підкисленим ацетонітрилом (метод Сшедзінські) - 43±3 %, ацетоном (метод Карташова В.А.) - 25±2 %, хлороформом з гомогенізованої біологічної тканини з наступною екстракційною очисткою в системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник - 35±2 %. Приклад 3 Циталопрам є ліпофільною речовиною, про що свідчать високі значення його коефіцієнту ліпофільності (log Р(октанол/вода)=3,71), а також об'єму розподілу (V d=12-16 л/кг) [Clark's analysis of Drugs and Poisons: Third edition [Електронний ресурс] / Ed. Laurent Υ Galichet. London: Pharmaceutical Press, 2005.-1 електрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см. - Систем. Вимоги: Pentium; 128 Mb RAM; CD-ROM Windows XP / Vista. - Назва з титул, екрану]. До модельних проб печінки (5 г) додавали водні розчини циталопраму гідроброміду, що у перерахунку містили 500 мкг циталопраму-основи. Об'єкти залишали на добу при кімнатній температурі, а потім виділяли циталопрам за запропонованим способом. Аналіз циталопраму в отриманому хлороформному екстракті проводили методом ВЕРХ з мультихвильовим УФдетектуванням. Ідентифікацію циталопраму здійснювали за часом утримування (t R = 19,95±0,09 хв., RSD=0,17 %,  = 0,43 %, Ρ=95 %,  = 2), кількісне визначення - за залежністю площі піку від концентрації (мкг/мл) при mах=240 нм. Ступінь виділення циталопраму з біологічного матеріалу за заявленим способом складав 60±4 %. Згідно з результатами наших попередніх дослідів, ступінь ізолювання водою, підкисленою кислотою оксалатною (метод Васильєвої А.О.) складав 22±2 %, етанолом, підкисленим кислотою оксалатною (метод Стаса-Отто) - 10±1 %, водою, підкисленою кислотою сульфатною (метод Крамаренка В.П.) - 15±1 %, підкисленим 2 UA 95171 U 5 10 15 20 25 30 ацетонітрилом (метод Сшедзінські) - 35±2 %, ацетоном (метод Карташова В.А.) - 15±1 %, хлороформом з гомогенізованої біологічної тканини з наступною екстракційною очисткою в системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник - 22±1 %. Приклад 4 Сертралін є ліпофільною речовиною, про що свідчать високі значення його коефіцієнту ліпофільності (log Р(октанол/вода)=5,29), а також об'єму розподілу (V d=20 л/кг) [Clark's analysis of Drugs and Poisons: Third edition [Електронний ресурс] / Ed. Laurent Υ Galichet. - London: Pharmaceutical Press, 2005. - 1 електрон, опт. диск (CD-ROM); 12 см. -Систем. Вимоги: Pentium; 128 Mb RAM; CD-ROM Windows XP / Vista. - Назва з титул, екрану]. До модельних проб печінки (5 г) додавали водні розчини сертраліну гідрохлориду, що містили у перерахунку 500 мкг сертраліну-основи. Об'єкти залишали на добу при кімнатній температурі, а потім виділяли сертралін за запропонованим способом. Аналіз сертраліну в отриманому хлороформному екстракті проводили методом ВЕРХ з мультихвильовим УФдетектуванням. Ідентифікацію сертраліну здійснювали за часом утримування (tR=23,32±0,01 хв., RSD=0,02 %,  = 0,05 %, Ρ=95 %,  = 2), кількісне визначення - за залежністю площі піку від концентрації (мкг/мл) при max=280 нм. Ступінь виділення сертраліну з біологічного матеріалу за заявленим способом складав 62±5 %. Згідно з результатами наших попередніх дослідів, ступінь ізолювання водою, підкисленою кислотою оксалатною (метод Васильєвої А.О.) складав 21±2 %, етанолом, підкисленим кислотою оксалатною (метод Стаса-Отто) - 15±2 %, водою, підкисленою кислотою сульфатною (метод Крамаренка В.П.) - 11±1 %, підкисленим ацетонітрилом (метод Сшедзінські) - 39±3 %, ацетоном (метод Карташова В.А.) - 8±1 %, хлороформом з гомогенізованої біологічної тканини з наступною екстракційною очисткою в системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник -15±2 %. Таким чином, використання ліпофільного екстрагенту хлороформу при ізолюванні ліпофільних речовин із зневодненого біологічного матеріалу, а також екстракційної очистки отриманих елюатів в системі неводних розчинників н-гексан - ацетонітрил, робить зазначений спосіб виділення ліпофільних речовин більш ефективним, ніж запропоновані раніше методи з використанням гідрофільних та амфіфільних розчинників. Таким чином, заявлено новий спосіб виділення ліпофільних речовин з біологічного матеріалу, який дає можливість ефективно вилучити їх з зазначеного об'єкту при хімікотоксикологічних дослідженнях. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб виділення амітриптиліну та інших ліпофільних речовин з біологічного матеріалу, що базується на елююванні їх ліпофільним розчинником хлороформом із зневодненої біологічної тканини з наступною екстракційною очисткою елюату в системі водна фаза (підкислена чи підлужена) - органічний розчинник, який відрізняється тим, що хлороформний елюат очищують від ендогенних домішок, екстрагуючи їх спочатку підлуженою водою, а потім використовуючи систему неводних розчинників н-гексан - ацетонітрил, для чого хлороформний елюат випаровують до видалення органічного розчинника, сухий залишок розчиняють у нгексані та проводять триразову екстракцію досліджуваної речовини ацетонітрилом, відокремлюють ацетонітрильний шар, який досліджують на наявність амітриптиліну або іншої ліпофільної речовини. 45 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3