Спосіб прогнозування рецидиву злоякісних епітеліальних пухлин шкіри повік з використанням моноклональних антитіл р53, bcl-2, cd95, іпо38

УКРАЇНА (19) UA (11) 96698 (13) U (51) МПК G01N 33/50 (2006.01) ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ (12) ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (21) Номер заявки: u 2014 10157 Дата подання заявки: 15.09.2014 (22) (24) Дата, з якої є чинними 10.02.2015 права на корисну модель: (46) Публікація відомостей 10.02.2015, Бюл.№ 3 про видачу патенту: (72) Винахідник(и): Сафроненкова Ірина Олексіївна (UA) (73) Власник(и): ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ОЧНИХ ХВОРОБ І ТКАНИННОЇ ТЕРАПІЇ ІМ. В.П. ФІЛАТОВА НАМН УКРАЇНИ", Французький б-р, 49/51, м. Одеса, 65061 (UA) (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ РЕЦИДИВУ ЗЛОЯКІСНИХ ЕПІТЕЛІАЛЬНИХ ПУХЛИН ШКІРИ ПОВІК З ВИКОРИСТАННЯМ МОНОКЛОНАЛЬНИХ АНТИТІЛ Р53, BCL-2, CD95, ІПО38 Спосіб прогнозування рецидиву злоякісних епітеліальних пухлин шкіри повік, за яким проводять імуноцитохімічний аналіз тканини пухлини з використанням моноклональних антитіл Р53, BCL2, CD95, ІПО38. Визначають відносні значення їх експресії - * Р53, * CD95, * Bсl-2, * ІРО38, за розробленою формулою УО = 7,7 * Р53 + 20,3 * CD95 + 64,7 * Bсl-2 + 3,8 * ІРО38. Визначають їх узагальнену скорингову оцінку (УО), і, якщо її значення вище порогового (>76,2 %), прогнозують можливість розвитку рецидиву злоякісних епітеліальних пухлин (ЗЕП) шкіри повік і визначають групу ризику хворих на можливість його розвитку. UA 96698 U (57) Реферат: UA 96698 U UA 96698 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до медицини, конкретно до офтальмоонкології, і може бути використана для підвищення ефективності лікування злоякісних епітеліальних пухлин шкіри повік. Про ефективність лікування злоякісних епітеліальних пухлин (ЗЕП) шкіри повік зазвичай судять по частоті рецидивів, які можуть бути нерідко більше первинних пухлин і протікають агресивно. Рецидивні пухлини важче піддаються лікуванню, ніж первинні і вимагають більш радикальних підходів до його призначення. Одним із шляхів оптимізації лікування ЗЕП шкіри повік є індивідуальний підхід до вибору тактики впливу на пухлину. Для його здійснення необхідно виявлення факторів прогнозу результату лікування ЗЕП шкіри повік. Суттєву допомогу в цьому може надати вивчення епітеліальних пухлин на імуногістохімічному рівні. Відомо, що патогенез неоплазій пов'язаний з нездатністю пухлинних клітин піддаватися апоптозу. Одним з механізмів порушення апоптозу є мутації в генах, контролюючих цей процес. Прикладами подібних аномалій є добре вивчені гіперекспресія гена Bсl-2, гальмуючого апоптоз, мутація в гені Р53, що перешкоджають функціонуванню кодованого їм білка як індуктора апоптозу і зменшення експресії CD95 [Заридзе Д. Г., Алев Г.И., Альтштейн А.Д., Белицкий Г.Α., 2004; Колесник А.П., Паламарчук И.Д., Сидоренко A.M., 2006]. В механізмі злоякісної трансформації клітин і в біологічному поведінці вже виниклих пухлин провідним фактором є проліферативна активність. Дослідження особливостей проліферації пухлинних клітин у хворих з різними новоутвореннями використовується для прогнозу перебігу захворювання та корекції схем лікування. Є роботи, результати яких свідчать про наявність кореляції між інтенсивністю проліферативного процесу та перебігом захворювання, а також ефективністю проведеної променевої терапії [Пожариський К.Μ., Леенман Ε.Ε., 2000; Barrett Τ.L., Smith K.J., Hodge J.J. et al., 1997; Rohbach J.M., Stiemer R., Mayer A.et al., 2001]. Однак узгодженої думки про прогностичне значення експресії онкобілків Р53 і Bсl-2 і антигенів CD95 і ІПО38 і поєднанні цих чинників при ЗЕП шкіри повік у доступних інформаційних джерелах авторами не знайдено. Авторами у доступних джерелах інформації не знайдено опису способу, схожого до запропонованого. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу прогнозування рецидиву злоякісних епітеліальних пухлин шкіри повік шляхом використання моноклональних антитіл (МкАТ) Р53, BCL-2, CD95, ІПО38, за рахунок чого стає можливим визначення відносних значень експресії Р53, CD95, Bcl-2, IPO38, що дозволить отримати значення скорингової оцінки, та прогнозувати рецидив злоякісних епітеліальних пухлин шкіри повік. Поставлена задача вирішується тим, що у способі прогнозування рецидиву злоякісних епітеліальних пухлин шкіри повік з використанням МкАТ Р53, BCL-2, CD95, ІПО38 стосовно корисної моделі проводять імуногістохімічне дослідження тканини пухлин з використанням МкАТ Р53, BCL-2, CD95, ІПО38, визначають відносні значення їх експресії, за розробленою формулою: УО = 7,7 * Р53+20,3 * CD95+64,7 * Bсl-2+3,8 * ІРО38 визначають їх узагальнену скорингову оцінку (УО), і якщо її значення вище порогового (>76,2 %), прогнозують можливість розвитку рецидиву ЗЕП шкіри повік і визначають групу ризику хворих на можливість його розвитку. Причинно-наслідкові зв'язки: Причина Наслідок дозволяє при значеннях сумарної скорингової оцінки відносних значень експресії Р53, Bcl-2, Визначення відносних значень експресії Р53, CD95 і ІПО38 у тканинах пухлини у хворих ЗЕП Bcl-2, CD95 і ІПО38 у тканинах пухлини у шкіри повік вище порогової (>76,2 %), можливо хворих ЗЕП шкіри повік прогнозувати розвиток рецидиву ЗЕП шкіри повік і виділити цих хворих у групу ризику можливого розвитку рецидиву пухлини 45 50 Пропонований спосіб полягає в тому, що знайдені порогові відносні значення експресії молекулярних маркерів в тканини пухлини, при яких підвищується ймовірність рецидивного перебігу ЗЕО шкіри повік. На основі знайдених порогових значень чотирьох маркерів Р53, BCL2, CD95, ІПО38 розроблена імовірнісна модель прогнозу рецидивів ЗЕП шкіри повік, чутливість якої становить 97,1 %, специфічність - 85,0 %. Технічний результат, який може бути отриманий при реалізації корисної моделі, складається з того, як що сумарна скорингова оцінка відносних значень експресії Р53, Bcl-2, CD95 і ІПО38 в тканинах пухлини вище порогової (>76,2 %), то можливо прогнозувати розвиток рецидиву ЗЕП 1 UA 96698 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шкіри повік. Відмінності середніх значень скорингової оцінки у хворих без рецидиву і з рецидивом пухлини - статистично значущі (р=0,000). Практична реалізація цього способу можлива в умовах як стаціонару, так і амбулаторно. Переваги розробленого способу прогнозування можливості розвитку рецидиву ЗЕП шкіри повік складаються з того, що досягається можливість на ранньому етапі лікування виділити хворих у групу ризику можливого розвитку рецидиву пухлини і вибрати адекватну тактику лікування, що дозволяє зменшити кількість рецидивів пухлини, тим самим підвищити ефективність лікування хворих на ЗЕП шкіри повік і вплинути на кінцевий результат пухлинного процесу. Опис способу. Дослідження проведені з МКАТ Cytokeratin (clon MNF116), Bсl-2 (clon 124), p53 (clon DO-7), CD95/Fas (clon XD2) фірми Dako Cytomation, Данія і ІПО-38 (ДУ Інститут патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАМИ України). Для імуногістологічного дослідження використовувалися парафінові зрізи біоптатів ЗЕП шкіри повік. Матеріал фіксували 10 % формаліном. Парафінові зрізи товщиною 4-6 мкм монтувалися на скла, покриті полі-L-лізин або на скла Super Frost Plus (Німеччина) і поміщалися в термостат при температурі 30 °C на добу або при 60 °C - на 30 хвилин (у разі використання скла з адгезивними властивостями). Потім зрізи депарафінізувались і зневоднювались. Для оптимального імунопероксидазного фарбування проводилося демаскування антигенів шляхом обробки зрізів 0,06 % розчином трипсину протягом 10 хвилин при температурі 37 °C або розчином цитратного буфера (рН=6,0) в мікрохвильовій печі. Всі інкубаційні цикли проводились у вологій камері при кімнатній температурі. Для зменшення неспецифічного фарбування на зрізи наносився 1 % розчин BSA і проводилась інкубація в оптимальному розведенні з моноклональними антитілами протягом години. Потім зрізи промивалися 3 рази забуференим фізіологічним розчином (PBS) і наносилася кроляча сироватка проти імуноглобулінів миші в надмірному титрі на 1 годину. Після цього, скла зі зрізами знову відмивалися в PBS і інкубувались з РАР-комплексом впродовж 45 хвилин. Після відмивання РАР-комплексу проводилося визначення активності пероксидази. Для візуалізації комплексу антиген-антитіло використовувався непрямий імунопероксидазний метод, де активність пероксидази визначалася за допомогою 3.3-діамінобешідін тетрахлориду (ДАБ) (Фірма DACO, Данія). Зрізи тканини пухлини дофарбовували гематоксиліном (2-3 хвилини), поміщали в бальзам і досліджували під світловим мікроскопом. Як негативний контроль використовувався фізіологічний розчин, в якості позитивного - Cytokeratin. Позитивним результатом вважалося наявність специфічного коричневого фарбування цитоплазми при виявленні експресії Cytokeratin і Bсl-2, ядра - при експресії р53 і ІПО38, поверхневої мембрани і цитоплазми - при CD95/Fas. Ступінь експресії МКАТ оцінювали напівкількісним способом, враховуючи частку забарвлених клітин і інтенсивність фарбування. Результати інтерпретували за наступними критеріями: (-) - реакція відсутня (