Спосіб визначення концентрації адреналіну

Реферат: Спосіб визначення концентрації адреналіну включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, розчинення, доведення рН аналізату до 8,28,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації. При пробопідготовці біологічний матеріал змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти, фільтрують через складчастий фільтр, змочений у 6 % розчині хлорної кислоти, додають 250 мг ЕДТО, аміачний розчин, промивають окис алюмінію у аміачній воді, 1,0 г окису алюмінію додають у суміш, змішують з 3,5 мл 0,25 II розчину оцтової кислоти, перемішують, струшують, центрифугують, здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 ммоль дигідрофасфату натрію рН 1,95 як елюенту, розміщують його у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр. Концентрацію адреналіну вимірюють за хроматограмою піка на довжині хвилі 265 нм. UA 96898 U (12) UA 96898 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до досліджень або аналізу матеріалів шляхом визначення їх хімічних або фізичних властивостей, з використанням сполук для спектрального аналізу та може бути використаною в аналітичній хімії, фізіо- або фармакології як засіб діагностування рівня адреналіну в організмі. З досліджуваного рівня техніки відомий спосіб визначення адреналіну (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. – М.: Медицина, 1987. - 368 с.), що включає відбір і адсорбцію проби біологічного матеріалу, її окислення фериціанідом при рН 6,2, світлове збудження та флюорометрію, у хвильових режимах 365 і 500-550 нм, відповідно. Недоліками відомого способу є використання великої кількості різних і дорогих реактивів (НСl, NaOH, NH4OH, окису алюмінію, фосфатних буферних розчинів, червоної кров'яної солі, етилендіамінтетраоцтової, оцтової та аскорбінової кислот тощо), деякі з яких, у відповідності до Закону України "Про наркотичні засоби, психотропні речовини і прекурсори", підпадають під спеціальний контроль, що на теперішній час потребує подальшої доробки та удосконалення. Більш наближеним до корисної моделі за кількістю істотних ознак є спосіб визначення концентрації адреналіну (Пат. Россії № 2174231, МПК G01 N33/52, G01 N33/74, заявл 19.10.00; опубл. 27.09.01), що включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, доведення рН розчиненого аналізату до 8,2-8,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації. Концентрацію визначають за інтенсивністю флюоресценції. До 0,4 мл кислотного екстракту біологічного матеріалу додають рівну кількість 5 % етилендіамінтетраацетату натрію, при адсорбції розчину доводять співвідношення висоти й діаметра стовпчика рідини до одиниці, за допомогою окису алюмінію, елюють аналізат з адсорбенту 1 мл 0,25 Η розчину оцтової кислоти, ділять цей об'єм розчину по 0,5 мл на експериментальну та контрольну проби, до 0,5 мл елюату додають 0,15 мл 5 % етилендіамінтетраацетату натрію й 0,12 мл фосфату натрію тризаміщеного 0,33 Μ до рН 6,06,5, окислювання норадреналіну, адреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну здійснюють 0,1 мол 0,1 н розчином йоду протягом 10 хв., нейтралізують розчин 0,1 мл лужного сульфіту, додають 0,05 мл 5 н оцтової кислоти, розміщують його на 5 хв. у киплячу водяну баню, прохолоджують, вимірюють інтенсивності флюоресценції експериментальної та контрольної проб на довжинах хвиль збудження λΒ й флюоресценції λФ, і порівнюють інтенсивності флюоресценції експериментальної проби стандартного розчину з контрольною. Технічним результатом, на досягнення якого націлений прототип, є підвищення чутливості та зниження трудомісткості шляхом одночасного елюювання та окислювання норадреналіну, адреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну, за рахунок аналізу проби з однієї пробірки. Проте чутливість відомого способу, як і трудомісткість процесу його виконання, на теперішній час є непридатними. Останнє пояснюється технологічною складністю, зв'язаною з необхідністю здійснення низки перехідних реакцій, у т.ч. й тих, які спрямовані на визначення концентрацій норадреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну. Натомість, використання агресивних хімічних сумішей, які містять концентрований гідрооксид натрію, що часто завдає шкірні опіки, значно ускладнює проведення аналізу. Відомому технічному рішенню бракує й економічності, з-поза необхідності використання надмірної кількості різних коштовних реактивів (НСl, NaOH, NH4OH, етилендіамінтетраоцтової та аскорбінової кислот, червоної кров'яної солі, фосфатних буферних розчинів тощо). Деякі з них вимагають проведення постійного наркологічного контролю. Поряд із цим, прототип є непродуктивним, бо визначення концентрації адреналіну, триває, включаючи пробопідготовку, декілька годин і може затягнутися майже на 2 доби, проводяться численні обчислювальні операції. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлена задача вдосконалення способу визначення концентрації адреналіну шляхом доопрацювання підготовчої та аналітичної фази процесу підвищенню чутливості, зниженню трудомісткості, у т.ч. покращенню економічності та продуктивності. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення концентрації адреналіну, що включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, розчинення, доведення рН аналізату до 8,2-8,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації, відповідно до корисної моделі, при пробопідготовці біологічний матеріал змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти, фільтрують через складчастий фільтр, змочений у 6 % розчині хлорної кислоти, додають 250 мг ЕДТО, аміачний розчин, промивають окис алюмінію у аміачній воді, 1,0 г окису алюмінію додають у суміш, змішують з 3,5 мл 0,25 Η розчину оцтової кислоти, перемішують, струшують, центрифугують, здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 ммоль дигідрофосфату натрію 0 UA 96898 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рН 1,95 як елюенту, розміщують його у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, а концентрацію адреналіну вимірюють за хроматограмою піку на довжині хвилі 265 нм. Спосіб характеризується модифікацією підготовчої та аналітичної стадій, зв'язаних з оцінюванням прямих вимірів концентрації адреналіну лінійним чином в умовах рідинної колонкової хроматографії. Перевершення вищезазначеного технічного результату ґрунтується на виділенні кислотного екстракту з біологічного матеріалу, з можливістю подальшого елюювання за реакцією з розчином дигідрофасфату натрію рН 1,95. Рухома фаза останнього забезпечує спорідненість визначуваної субстанції, оскільки утворює певні інтервали між періодами утримання елюйованих фракцій в умовах рідинної колонкової хроматографії. Змішування проби з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти передбачає денатурацію білків біологічної проби, запобігає руйнуванню та робить можливим подальше визначення адреналіну. Фільтрація суміші через складчастий фільтр є необхідною для видалення нерозчинених фракцій. Змочування фільтра у 6 % розчині хлорної кислоти необхідне для збереження об'єму +2 фільтрату. Додання до осаду 250 мг ЕДТО блокує Са , залежні ферменти і дозволяє зберігати вихідний рівень адреналіну. Додання до осаду 1,0 г окису алюмінію забезпечує можливість адсорбції адреналіну, що надає можливість кількісного визначення адреналіну в умовах хроматографії. Запропонована кількість окису (1,0 г) є оптимально, оскільки добавка меншої кількості стримує повноту адсорбції наявного адреналіну та обмежує вплив випадкових похибок на результати вимірів. Залучення більшої кількості окису алюмінію збільшує витрати реактивів, як і можливість втрат адреналіну при екстракції. Промивання окису алюмінію аміачною водою передбачає відновлення рН суспензії окису алюмінію та руйнує залишки хлорної кислоти, що важливе для посилення чутливості й досягнення лінійності спектрального діапазону. Додання до осаду 3,5 мл 0,25 Η розчину оцтової кислоти забезпечує остаточне вивільнення адреналіну із адсорбованого на окису алюмінію стану. При цьому залучення її більшої або меншої кількості призведе до змінення рН, що суттєво вплине на чутливість. Доведення розчину оцтової кислоти до 0,25 Η є оптимальним також, адже саме при такому значенні досягаються підвищення ефективності розділення проби, оптимальності виділення адреналіну, чутливості, економічності, продуктивності і зниження трудомісткості. Залучення саме 100 ммоль дигідрофосфату натрію рН 1,95 зв'язане з підтримкою процесу елююванням. Довжина хвилі 265 нм є оптимальною (фіг. 1, 2). Вимірювання концентрації адреналіну за хроматограмою піка, на довжині хвилі 265 нм запропоноване на основі усереднення чисельних експериментальних досліджень. Тож, завдяки доопрацюванню підготовчої та аналітичної стадій процесу, зв'язаних з кінцевою оцінкою результатів лінійних хроматографічних вимірювань у розширеному діапазоні хвиль аналізатора, досягають збільшення чутливості, виключають низку підготовчих перехідних реакцій, використання зайвих реактивів (у т.ч. й шкідливого концентрованого гідрооксиду натрію), також обчислення виміряних параметрів, досягається істотне спрощення трудомісткості, поліпшення економічності та продуктивності процесу. Таким чином пропонований спосіб дозволяє покращити експлуатаційні зручності, зменшити рівень виробничого травматизму, завдяки відмові від використання концентрованого гідроксиду натрію, виключити необхідність застосування ретельного наркологічного контролю. Суть способу пояснюється графічним матеріалом. Фігура 1 - ілюстрація хроматограми піка адреналіну в діапазоні хвиль 210-280 нм. Фігура 2 - ілюстрація залежності сигналу детектора від довжини хвилі під час визначення рівня адреналіну (при адреналіні - 225 нм, час виходу - 2 хв.). Спосіб визначення концентрації адреналіну виконується наступним чином. Для визначення концентрації адреналіну залучають хроматографічну систему "Shimadzu LC-20AD" (Японія), що складається з діодно-матричного детектора "Shimadzu SPD-M20A", дегазатора "Shimadzu DGU20A", двох плунжерних насосів "Shimadzu LC-20AD", які забезпечують швидкість потоку елюенту 0,1-1,0 мл/хв., системи градієнту високого тиску і колонок "Nicleodur C18 Gravity" (Японія), діаметром 2,0 мм і довжиною 125 мм. Для їх роботи застосовують обернено-фазовий сорбент С-18, у вигляді гранул габаритами ~ 0,5 мкм, передколонки 10 мм довжини й термостат "Shimadzu CTO-20A". Для забезпечення детекції застосовують спектрометричний діодноматричний детектор "Shimadzu SPD-M20A", працюючий в діапазоні хвиль 190-800 нм, та елюент, виготовлений на основі 100 ммоль дигідрофосфату натрію рН 1,95. Як пробу біологічного матеріалу залучають сироватку крові експериментальних тварин. Відібрану пробу змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти та фільтрують через складчастий фільтр, змочений в тому ж розчині. Додають 250 мг ЕДТО, концентрований аміак, доводячи рН осаду до 8,2-8,5. У аміачній воді промивають окис алюмінію та у кількості 1,0 г додають його у суміш. Компоненти змішують з 3,5 мл розчину 0,25 Η оцтової кислоти, струшують, центрифугують. 1 UA 96898 U 5 10 15 Здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 ммоль дигідрофосфату натрію рН 1,95. Наприкінці суміш розміщують у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, на довжині хвилі 265 нм за хроматограмою піка вимірюють концентрацію адреналіну. Форма спектра адреналіну дозволяє відрізняти його від інших біогенних моноамінів (фіг. 1, 2). Ідентифікацію хроматографічного піка адреналіну здійснюють за часом його утримання та спектром поглинання на довжинах хвиль 210-285 нм. Пропонований спосіб визначення концентрації адреналіну може бути використаним в аналітичній хімії, фізіо- або фармакології, а за спрощенням пробопідготовчої фази, виключенням з використання зайвих реактивів, збільшенням ступеня елюювання, можливістю візуалізації хроматографічного розділення адреналіну у розширеному спектрі, заявлений спосіб у 1,5-2,0 рази точніший, менш трудомісткий, більш економічний і продуктивний за прототип. За технічною характеристикою його чутливість сягає 0,01 мг/мл, лінійність діапазону вимірів - 0,011,00 мг/мл, тривалість процесу - 80-100 хв., вартість 1-го дослідження - 14-20 грн. (див. Таблицю 1). Таблиця 1 Технічна характеристика способу Показники та одиниці вимірювання Чутливість, мг/мл Лінійність діапазону, мг/мл Тривалість процесу, хв Вартість дослідження проби, грн На довжині хвилі 265 нм 0,01 0,01-1,00 80-100 14-20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб визначення концентрації адреналіну, що включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, розчинення, доведення рН аналізату до 8,28,5 за допомогою аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації, який відрізняється тим, що при пробопідготовці біологічний матеріал змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти, фільтрують через складчастий фільтр, змочений у 6 % розчині хлорної кислоти, додають 250 мг ЕДТО, аміачний розчин, промивають окис алюмінію у аміачній воді, 1,0 г окису алюмінію додають у суміш, змішують з 3,5 мл 0,25 II розчину оцтової кислоти, перемішують, струшують, центрифугують, здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 ммоль дигідрофасфату натрію рН 1,95 як елюенту, розміщують його у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, а концентрацію адреналіну вимірюють за хроматограмою піка на довжині хвилі 265 нм. 2 UA 96898 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3