Спосіб визначення концентрації норадреналіну

Реферат: Спосіб визначення концентрації норадреналіну включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, розчинення, доведення рН аналізату до 8,28,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації. При цьому при пробопідготовці біологічний матеріал змішують з 6 % розчином хлорної кислоти, фільтрують через складчастий фільтр, змочений у 6 % розчині хлорної кислоти, додають ЕДТО, аміачний розчин, промивають окис алюмінію у аміачній воді, додають у суміш окис алюмінію, змішують з розчином оцтової кислоти (0,25 Н), перемішують, струшують, центрифугують, здійснюють елюювання, додаючи до осаду дигідрофасфат натрію рН 1,95 як елюент. Розміщують його у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, а концентрацію норадреналіну вимірюють за хроматограмою піку на довжині хвилі 265 нм. UA 86098 U (12) UA 86098 U UA 86098 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до досліджень або аналізу матеріалів шляхом визначення їх хімічних або фізичних властивостей, з використанням сполук для спектрального аналізу, та може бути використаною в аналітичній хімії, фізіо- або фармакології, як засіб діагностування рівня норадреналіну в організмі. З досліджуваного рівня техніки відомий спосіб визначення норадреналіну, що включає відбір і адсорбцію проби біологічного матеріалу, її окислення фериціанідом при рН 6,2, світлове збудження та флюорометрію, у хвильових режимах 365 і 500-550 нм, відповідно [1]. Недоліками відомого способу є використання великої кількості різних і коштовних реактивів (НСl, NaOH, NH4OH, окису алюмінію, фосфатних буферних розчинів, червоної кров'яної солі, етилендіамінтетраоцтової, оцтової та аскорбінової кислот тощо), деякі з яких, у відповідності до Закону України "Про наркотичні засоби, психотропні речовини і прекурсори", підпадають під спеціальний контроль, що на теперішній час потребує подальшої доробки та удосконалення. Більш наближеним до корисної моделі за кількістю істотних ознак є спосіб визначення концентрації норадреналіну, адреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну в порції біологічного матеріалу, що включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, доведення рН розчиненого аналізату до 8,2-8,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації за інтенсивністю флюоресценції, у відповідності з яким до 0,4 мл кислотного екстракту біологічного матеріалу додають рівну кількість 5 % етилендіамінтетраацетату натрію, при адсорбції розчину доводять співвідношення висоти й діаметра стовпчика рідини до одиниці, за допомогою окису алюмінію елююють аналізат з адсорбенту 1 мл 0,25 Н розчину оцтової кислоти, ділять цей об'єм розчину по 0,5 мл на експериментальну та контрольну проби, до 0,5 мл елюату додають 0,15 мл 5 % етилендіамінтетраацетату натрію й 0,12 мл фосфату натрію тризаміщеного 0,33 М до рН 6,06,5, окислювання норадреналіну, адреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну здійснюють 0,1 мол 0,1 н розчином йоду протягом 10 хв., нейтралізують розчин 0,1 мл лужного сульфіту, додають 0,05 мл 5 н оцтової кислоти, поміщують його на 5 хв. у киплячу водяну баню, охолоджують, вимірюють інтенсивності флюоресценції експериментальної та контрольної проб на довжинах хвиль збудження В й флюоресценції Ф, і порівнюють інтенсивності флюоресценції експериментальної проби стандартного розчину з контрольною, при цьому кількість норадреналіну (СН) визначають при значеннях В і Ф, рівних 365 і 510 нм, відповідно, використовуючи тотожність: СН=Е3-Е4-СДА(ЕДА3-ЕДА4)/ЕН3-ЕН4, де Е3 - різниця інтенсивностей флюоресценції експериментальної та відповідної контрольної проби при В=365 нм і Ф=510 нм; Е4 - різниця інтенсивностей флюоресценції експериментальної та відповідної контрольної проби при В=436 нм і Ф=510 нм; ЕДА3 - різниця інтенсивностей флюоресценції стандартного розчину дофаміну та відповідної контрольної проби при В=365 нм і Ф=510 нм; ЕДА4 - різниця інтенсивностей флюоресценції стандартного розчину дофаміну та відповідної контрольної проби при В=436 нм і Ф=510 нм; ЕН3 - різниця інтенсивностей флюоресценції стандартного розчину норадреналіну й відповідної контрольної проби при В=365 нм, Ф=510 нм [2]. Технічним результатом, на досягнення якого націлений найближчий аналог, є підвищення чутливості та зниження трудомісткості шляхом одночасного елюювання та окислювання норадреналіну, адреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну, за рахунок аналізу проби з однієї пробірки. Проте чутливість методики, як і трудомісткість процесу, на теперішній час є непридатними. Останнє пояснюється технологічною складністю, зв'язаною з необхідністю здійснення низки перехідних реакцій, у т.ч. й тих, які спрямовані на визначення концентрацій адреналіну, дофаміну та діоксифенілаланіну. Натомість використання агресивних хімічних сумішей, які містять концентрований гідрооксид натрію, що часто призводить до опіків шкіри, значно ускладнює проведення аналізу. Відомому технічному рішенню бракує й економічності, через необхідність використання надмірної кількості різних коштовних реактивів (НСl, NaOH, NH 4OH, етилендіамінтетраоцтової та аскорбінової кислот, червоної кров'яної солі, фосфатних буферних розчинів тощо). Деякі з них вимагають проведення постійного наркологічного контролю. Поряд із цим, найближчий аналог є не продуктивним, бо визначення концентрації норадреналіну триває, включаючи пробопідготовку, декілька годин, і може затягнутися майже на 2 доби, проводяться численні обчислювальні операції. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлена задача розробити такий спосіб визначення концентрації норадреналіну, застосування котрого сприяло б, шляхом 1 UA 86098 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доопрацювання підготовчої та аналітичної фаз процесу, підвищенню чутливості, зниженню трудомісткості, у т.ч. покращенню економічності та продуктивності. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі визначення концентрації норадреналіну, що включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, розчинення, доведення рН аналізату до 8,2-8,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації, згідно з корисною моделлю, при пробопідготовці біологічний матеріал змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти, фільтрують через складчастий фільтр, змочений у 6 % розчині хлорної кислоти, додають 250 мг ЕДТО, аміачний розчин, промивають окис алюмінію у аміачній воді, 1,0 г окису алюмінію додають у суміш, змішують з 3,5 мл 0,25 Н розчину оцтової кислоти, перемішують, струшують, центрифугують, здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 мМ дигідрофасфату натрію рН 1,95 як елюенту, розміщують його у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, а концентрацію норадреналіну вимірюють за хроматограмою піку на довжині хвилі 265 нм. Причинно-наслідковий зв'язок сукупності ознак заявлюваної корисної моделі з вищезазначеним технічним результатом полягає в наступному. Спосіб характеризується модифікацією підготовчої та аналітичної стадій, зв'язаних з оцінюванням прямих вимірів концентрації норадреналіну лінійним чином в умовах рідинної колоночної хроматографії. Перевершення вищезазначеного технічного результату ґрунтується на виділенні кислотного екстракту з біологічного матеріалу, з можливістю подальшого елюювання за реакцією з розчином дигідрофасфату натрію рН 1,95. Рухома фаза останнього забезпечує спорідненість визначаємої субстанції, оскільки утворює певні інтервали між періодами утримання елюйованих фракцій в умовах рідинної колоночної хроматографії. Змішування проби з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти передбачає денатурацію білків біологічної проби, запобігає руйнування та робить можливим подальше визначення норадреналіну. Фільтрація суміші через складчастий фільтр є необхідною для видалення нерозчинених фракцій. Змочування фільтра у 6 % розчині хлорної кислоти необхідне для +2 збереження об'єму фільтрату. Додання до осаду 250 мг ЕДТО блокує Са , залежні ферменти і дозволяє зберігати вихідний рівень норадреналіну. Додання до осаду 1,0 г окису алюмінію забезпечує можливість адсорбції норадреналіну, що надає можливість кількісного визначення норадреналіну в умовах хроматографії. Запропонована 1,0 г кількість окису є оптимальною, оскільки добавка меншої кількості стримує повноту адсорбції наявного норадреналіну та обмежує вплив випадкових похибок на результати вимірів. Залучення більшої кількості окису алюмінію збільшує витрати реактивів, як і можливість втрат норадреналіну при екстракції. Промивання окису алюмінію аміачною водою передбачає відновлення рН суспензії окису алюмінію та руйнує залишки хлорної кислоти, що важливе для посилення чутливості й досягнення лінійності спектрального діапазону. Додання до осаду 3,5 мл 0,25 Н розчину оцтової кислоти забезпечує остаточне вивільнення норадреналіну із адсорбованого на окису алюмінію стану. При цьому залучення її більшої або меншої кількості призведе до змінення рН, що суттєво вплине на чутливість. Доведення розчину оцтової кислоти до 0,25 Н є оптимальним також, адже саме при такому значенні досягаються підвищення ефективності розділення проби, оптимальності виділення норадреналіну, чутливості, економічності, продуктивності і зниження трудомісткості. Залучення саме 100 мМ дигідрофасфату натрію рН 1,95 зв'язане з підтримкою процесу елююванням. Довжина хвилі 265 нм є оптимальною (фіг. 1, 2). Вимірювання концентрації норадреналіну за хроматограмою піку, на довжині хвилі 265 нм, запропоноване на основі усереднення чисельних експериментальних досліджень. Тож, завдяки доопрацюванню підготовчої та аналітичної стадій процесу, зв'язаних з кінцевою оцінкою результатів лінійних хроматографічних вимірювань у розширеному діапазоні хвиль аналізатора, досягають збільшення чутливості, виключають низку підготовчих перехідних реакцій, використання зайвих реактивів (у т.ч. й шкідливого концентрованого гідрооксиду натрію), також обчислення виміряних параметрів, досягається істотне спрощення трудомісткості, поліпшення економічності та продуктивності процесу. Запропоноване вирішення задачі дозволяє покращити експлуатаційні зручності, зменшити рівень виробничого травматизму, завдяки відмові від використання концентрованого гідроксиду натрію, виключити необхідність застосування ретельного наркологічного контролю. Спосіб ілюструється хроматограмою піку норадреналіну в діапазоні хвиль 210-280 нм (фіг. 1), залежністю сигналу детектора від довжини хвилі під час визначення рівня норадреналіну (фіг. 2) і технічною характеристикою (табл.). Суть. Для здійснення способу визначення концентрації норадреналіну залучають хроматографічну систему "Shimadzu LC-20AD" (Японія), що складається з діодно-матричного 2 UA 86098 U 5 10 15 20 25 детектора "Shimadzu SPD-M20A", дегазатора "Shimadzu DGU-20A", двох плунжерних насосів "Shimadzu LC-20AD", які забезпечують швидкість потоку елюенту 0,1-1,0 мл/хв, системи градієнту високого тиску і колонок "Nicleodur C18 Gravity" (Японія), діаметром 2,0 мм і довжиною 125 мм. Для їх роботи застосовують необернено-фазовий сорбент С-18, у вигляді гранул габаритами ~ 0,5 мкм, передколонки 10 мм довжини й термостат "Shimadzu CTO-20A". Для забезпечення детекції застосовують спектрометричний діодно-матричний детектор "Shimadzu SPD-M20A", що працює в діапазоні хвиль 190-800 нм, та елюент, виготовлений на основі 100 мМ дигідрофосфату натрію рН 1,95. Як пробу біологічного матеріалу залучають сироватку крові експериментальних тварин. Відібрану пробу змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти та фільтрують через складчастий фільтр, змочений в тім же розчині. Додають 250 мг ЕДТО, концентрований аміак, доводячи рН осаду до 8,2-8,5. У аміачній воді промивають окис алюмінію та у кількості 1,0 г додають його у суміш. Компоненти змішують з 3,5 мл розчину 0,25 Н оцтової кислоти, струшують, центрифугують. Здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 мМ дигідрофасфату натрію рН 1,95. Наприкінці суміш розміщують у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, на довжині хвилі 265 нм за хроматограмою піку вимірюють концентрацію норадреналіну. Форма спектру норадреналіну дозволяє відрізняти його від інших біогенних моноамінів (фіг. 1, 2). Ідентифікацію хроматографічного піку норадреналіну здійснюють за часом його утримання та спектром поглинання на довжинах хвиль 210-285 нм. Вирішення поставленої задачі бути використаним в аналітичній хімії, фізіо- або фармакології, а за спрощенням пробопідготовчої фази, виключенням з використання зайвих реактивів, збільшенням ступеня елюювання, можливістю візуалізації хроматографічного розділення норадреналіну у розширеному спектрі, заявлений спосіб у 1,5-2,0 рази точніший, менш трудомісткий, більш економічний і продуктивний в порівнянні з найближчим аналогом. За технічною характеристикою його чутливість сягає 0,01 мг/мл, лінійність діапазону вимірів - 0,011,00 мг/мл, тривалість процесу - 80-100 хв., вартість 1-го дослідження - 14-20 грн. (див. табл.). Перевершення технічного результату досягнуте на основі залучення та поєднання з вирішенням поставленої задачі різних засобів, що є загальновідомими. 30 Технічна характеристика способу Показники та од. вимірювання Чутливість, мг/мл Лінійність діапазону, мг/мл Тривалість процесу, хв. Вартість дослідження проби, грн. На довжині хвилі 265 нм 0,01 0,01-1,00 80-100 14-20 35 Джерела інформації: 1. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. - М.: Медицина, 1987. - 368 с. 2. Способ определения концентрации норадреналина, адреналина, дофамина и диоксифенилаланина в порции биологического материала: Пат. 2174231 России, МПК G01N 33/52, G01N 33/74 / Подковкин В.Г., Панина М.И. (Россия). - № 2000126400/14; заявл 19.10.00; опубл. 27.09.01. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб визначення концентрації норадреналіну, що включає відбір проби біологічного матеріалу, пробопідготовку з використанням окису алюмінію, розчинення, доведення рН аналізату до 8,2-8,5 за допомого аміачного розчину, його елюювання, окислювання та визначення концентрації, який відрізняється тим, що при пробопідготовці біологічний матеріал змішують з 9 мл 6 % розчину хлорної кислоти, фільтрують через складчастий фільтр, змочений у 6 % розчині хлорної кислоти, додають 250 мг ЕДТО, аміачний розчин, промивають окис алюмінію у аміачній воді, 1,0 г окису алюмінію додають у суміш, змішують з 3,5 мл 0,25 Н розчину оцтової кислоти, перемішують, струшують, центрифугують, здійснюють елюювання, додаючи до осаду 100 мМ дигідрофасфату натрію рН 1,95 як елюент, розміщують його у хроматографі, де в діапазоні хвиль аналізатора 210-285 нм фіксують спектр, а концентрацію норадреналіну вимірюють за хроматограмою піку на довжині хвилі 265 нм. 3 UA 86098 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4