Спосіб визначення імуногенної активності інактивованих антирабічних вакцин з використанням калібрувальної кривої

Реферат: Спосіб визначення імуногенної активності інактивованих антирабічних вакцин з використанням калібрувальної кривої включає однократне інтраперитоніальне введення білим мишам п'яти розведень референтної вакцини та дослідних вакцин, відбір крові та отримання сироваток крові на 14 добу після імунізації, дослідження у сироватках крові титрів антирабічних антитіл методом ТФ-ІФА, побудову калібрувальної кривої за показниками індексів імуногенності розведень референс-вакцини та відповідних титрів антирабічних антитіл, отриманих при дослідженні сироваток крові вакцинованих референтною вакциною мишей, проекцію значень титрів антирабічних антитіл, отриманих при дослідженні сироваток крові мишей, вакцинованих дослідними вакцинами, у калібрувальну криву, порівняння значень та визначення імуногенної активності дослідних вакцин. Визначення імуногенної активності здійснюють шляхом порівняння поствакцинальних титрів антирабічних антитіл, отриманих після введення п'яти розведень референс-вакцини та дослідної вакцини з використанням розробленого шаблону. UA 99046 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ІМУНОГЕННОЇ АКТИВНОСТІ ІНАКТИВОВАНИХ АНТИРАБІЧНИХ ВАКЦИН З ВИКОРИСТАННЯМ КАЛІБРУВАЛЬНОЇ КРИВОЇ UA 99046 U UA 99046 U 5 10 15 20 25 30 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, а саме до ветеринарної вірусології, імунології, епізоотології та біотехнології, і може бути використана при виробництві біопрепаратів проти сказу людей та тварин. Найближчим аналогом корисної моделі є спосіб визначення імуногенної активності антирабічних вакцин (Патент № 47782, опубл. 25.02.2010, Бюл. № 4), що полягає в однократній внутрішньо-м'язовій вакцинації мишей п'ятикратними розведеннями дослідної і стандартної вакцини (1:5, 1:25, 1:125, 1:625) та контрольним внутрішньошкірним зараженням на 21 добу тест-штамом CVS вірусу сказу. Недоліками даного способу є те, що він потребує значних затрат на облаштування необхідних умов для роботи з живим вірусом, та тривале утримання значної кількості піддослідних тварин (168 голів), також існує певний ризик для персоналу при роботі з інфекційним вірусом сказу. Задачею корисної моделі є необхідність спрощення способу визначення імуногенної активності антирабічних вакцин, а саме - зменшення кількості задіяних тварин, скорочення строків проведення дослідження та повне виключення з досліду контрольного зараження для зменшення фізичного страждання тварин та зменшення ризиків інфікування для персоналу. Поставлена задача вирішується тим, що проводиться однократна імунізація мишей та подальше визначення титрів специфічних антирабічних антитіл в сироватках крові тварин методом ТФ-ІФА. Спосіб включає наступні суттєві ознаки: 3 3 приготування розведень референтної вакцини (IWS) до імуногенності: 1 МО/см , 2 МО/см та 3 3 3 2,8 МО/см , 3,9 МО/см , 5,59 МО/см ; інтраперитоніальне введення усіх зразків референтної вакцини в розведенні 1:5 білим 3 мишам, масою 13-15 г, в об'ємі - 0,5 см (10 голів на кожну вакцину); проведення, на 14 -й день після імунізації, забору крові в усіх тварин та дослідження у сироватці крові титрів специфічних антирабічних антитіл методом ТФ-ІФА; обрахунок титрів антирабічних антитіл за показниками оптичної густини результатів та 3 вираження їх в міжнародних одиницях (МО/см ); побудова регресійної кривої за показниками титрів антирабічних антитіл в сироватках крові мишей та індексу імуногенності розведень референтної вакцини. Відповідь гуморальної ланки імунітету на введення антирабічної референс-вакцини в серологічному тесті з визначення імуногенної активності наведені в Таблиці 1. Таблиця 1 Результати дослідження серологічної відповіді у мишей (на 14 добу) після щеплення їх антирабічною референс-вакциною (М±m, n=10) № п/п 1 2 3 4 5 35 40 45 Групи тварин (IWS) - 1 (IWS) - 2 (IWS) - 3 (IWS) - 4 (IWS) - 5 Індекс імуногенності розведень референс-вакцини (МО/доза) 1 2 2,8 3,9 5,59 Середнє значення титру 3 антитіл (МО/см ) 0,7±0,01 1,0±0,03 1,31±0,02 1,52±0,01 1,84±0,02 З використанням отриманих середніх (М) результатів усіх досліджень створено калібрувальну криву, в основу якої було покладено залежність титрів антирабічних антитіл (вісь X) від імуногенної активності вакцин (вісь Y). Візуально калібрувальна крива продемонстрована на графіку. Як видно із лінії, представленої на графіку, рівень специфічних антирабічних антитіл залежить від того, з якою імуногенною активністю використовували вакцину для імунізації тварин. Розроблену криву, використовували в подальшому як шаблон для визначення імуногенної активності дослідних серій інактивованих антирабічних вакцин. Приклад: Для демонстрації методики використання вищенаведеного шаблону, були проведені дослідження різних інактивованих антирабічних вакцин. Постановка досліду включала наступні етапи: приготування розведень 1:5 дослідної вакцини; інтраперитоніальне введенням дослідної вакцини білим мишам, масою 13-15 г, в об'ємі - 0,5 3 см (10 голів на кожну серію вакцини); 1 UA 99046 U 5 10 проведення на 14-й день після імунізації забору крові в усіх тварин та дослідження у сироватці крові титрів специфічних антирабічних антитіл методом ТФ-ІФА, обрахунок оптичної 3 щільності та вираження результатів титрів антирабічних антитіл в МО/см ; внесення значень титрів антирабічних антитіл, отриманих при дослідженні сироваток крові мишей, вакцинованих дослідними вакцинами, у калібрувальну криву, порівняння значення та визначення імуногенної активності дослідної вакцини. За показниками серологічного дослідження нами було визначено імуногенну активність 3-х серій вакцин. Для моделювання умов оцінки низькоактивних серій вакцин (які не мають бути ліцензовані та застосовані для тварин) ми приготували розведення однієї із серій вакцини до імуногенності 0,7 МО/дозі (Табл. 2). Таблиця 2 Результати визначення імуногенної активності інактивованих антирабічних вакцин серологічним тестом і методом NIH (M±m, n=10) № п/п 1 2 3 4 15 20 Групи тварин Дослідна Вакцина 1 Дослідна Вакцина 2 Дослідна Вакцина 3 Дослідна Вакцина 4 Середнє значення 3 титру антитіл, МО/см Індекс імуногенності за калібрувальною кривою, МО/доза Індекс імуногенності в тесті NIH, МО/доза 1,62±0,05 4,4 4,4 2,25±0,02 5,59 7,2 3,15±0,10 5,59 9,1 0,25 1 МО/доза). Щодо четвертої дослідної вакцини, її імуногенна активність становить менше 1 МО/доза (імуногенність визначена класичним методом NIH-0,7 МО/доза), тому така вакцина не придатна до застосування. Після цього, проведено порівняння та визначено кореляційну залежність між розробленим "серологічним" методом з використанням калібрувальної кривої та тестом, який було взято за найближчий аналог (Патент № 47782, "Спосіб визначення імуногенної активності антирабічних вакцин") (Табл. 3). Таблиця 3 Результати порівняльної оцінки аналога і запропонованого серологічного тесту Серія вакцини Дослідна вакцина 1 Дослідна вакцина 2 Дослідна вакцина 3 Дослідна вакцина 4 Індекс імуногенності, МО/доза* "периферичний" тест тест з використанням (найближчий аналог) калібрувальної кривої 4,0 4,4 5,9 5,59 6,2 5,59 0,5