Лікарський засіб, що містить комбінацію інгібітора кінази та анти-гліпікан 3-антитіла, для лікування раку печінки

Реферат: Винахід стосується фармацевтичної композиції для лікування або попередження раку печінки, що містить комбінацію інгібітора кінази та анти-гліпікан 3-антитіла; способу лікування або попередження раку печінки за допомогою вказаної композиції; способу посилення ефективності лікування раку печінки інгібітором кінази, що передбачає введення ефективної кількості антигліпікан 3-антитіла; способу зменшення втрати маси, що викликається лікуванням раку печінки інгібітором кінази, що передбачає введення ефективної кількості анти-гліпікан 3-антитіла. UA 103614 C2 (12) UA 103614 C2 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет відносно японської заявки 2008-98309, поданої 4 квітня 2008 року, і РСТ/JP2008/002690, поданої 26 вересня 2008 року, змісти яких включені тут як посилання. Галузь, до якої належить винахід Даний винахід належить до фармацевтичної композиції для ефективного лікування або попередження раку печінки, що містить комбінацію хіміотерапевтичного агента і анти-гліпікан 3антитіла, а також до способу лікування з використанням цієї фармацевтичної композиції. Рівень техніки Щорічна кількість смертей від печінково-клітинного раку (гепатоцелюлярної карциноми) дорівнює 600000, роблячи його п'ятою головною причиною смерті від раку по всьому світлу (Llovet, J.M., Burroughs, А., Bruix, J.: Lancet 362, 1907-17 (2003)). Більшість пацієнтів з печінковоклітинним раком (гепатоцелюлярною карциномою) вмирають в межах одного року після діагностики цього захворювання. На жаль, гепатоцелюлярна карцинома часто діагностується в пізній стадії, коли радикальне лікування є не дуже успішним. У випадку таких пацієнтів, способи лікування, які включають в себе хіміотерапію, хіміоемболізацію, каутеризацію або дистанційну променеву терапію, залишаються недостатніми. Більшість пацієнтів виявляють рецидив цього захворювання, васкулярною інфільтрацією, що супроводжується і множинними внутрішньопечінковими метастазами, який буде швидко прогресувати до запущеної стадії. П'ятирічний термін виживання рівний тільки 7 % (Bosch, F.X., Ribes, J., Cleries, R.: Gastroenterology 127, S5-16 (2004)). Пацієнти з гепатоцелюлярною карциномою, що піддаються хірургічній резекції локалізованих пухлин, мають відносно хороший прогноз, хоча п'ятирічний термін виживання все ще знаходиться між 15 % і 39 % (Takenaka, K., Kawahara, N., Yamamoto, K., Kajiyama, K., Maeda, Т., Itasaka, Н., Shirabe, K., Nishizaki, Т., Yanaga, K., Sugimachi, K.: Arch Surg. 131, 71-6 (1996)). Таким чином, в даній галузі існує потреба в новому способі лікування цього високо злоякісного захворювання. Як повідомлялося, гепатоцелюлярна карцинома є відповідальною за більш ніж 90 % первинних раків печінки в Японії. Способи лікування печінково-клітинного раку включають в себе черезкатетерну аретріальну катетеризацію на основі хіміотерапії (ТАЕ), де селективний некроз гепатоцелюлярної карциноми індукують інфузією суміші (рентгено)контрастної речовини (Lipiodol), канцеростатитичної і закупорювальної речовини (Gelfoam) в печінкову артерію (що служить як шлях доставки нутрієнтів до пухлини) і за допомогою цього блокують артерію, що подає нутрієнти. Крім того, клінічні дослідження проводяться на системній хіміотерапії з використанням таких хіміотерапевтичних агентів, як фторурацил (5-FU), урацил-тегафур (UFT), мітоміцин С (ММС), мітоксантрон (DHAD), адріаміцин (ADR), епірубіцин (EPI) і цисплатин (CDDR), або по окремості, або в комбінації з інтерфероном (IFN) (Yeo, W., Mok, T.S., Zee, В., Leung, T.W., Lai, P.B., Lau, W.Y., Koh, J., Mo, F.K., Yu, S.C., Chan, A.T., Hui, Р., Ma, В., Lam. K.C., Ho, W.M., Wjng, H.T., Tang, А., Johnson, P.J.: J. Natl. Cancer Inst. 97, 1532-8 (2005)). Однак, стандартна терапія для раку печінки ще не була встановлена (Furuse, J., Ishii, Н., Nakachi, K., Suzuki, Е., Xhimizu, S., Nakajima, K.: Cancer Sci., Oct. 22 (E-Pub) (2007)). Недавно ряд лікарських засобів, націлених на фактори росту, досліджувалися для лікування раку печінки. Ці дослідження передбачають, що рецептор епідермального фактора росту/епідермальний рецептор 1 людини (EGFR/HER1) експресується в активній формі в клітинах раку печінки людини. Ерлотиніб, інгібітор рецептора епідермального фактора росту/епідермального рецептора 1, і лапатиніб, інгібітор двох тирозинкіназ рецептора епідермального фактора росту/епідермального рецептора 1 людини і ErbB-2 (Her2/neu), досліджувалися в клінічних дослідженнях фази II. Рівень реакції у пацієнтів, що одержували ерлотиніб, дорівнював 4-9 %, час прогресування був такий, що дорівнює 2,1-3,2 місяців і період виживання дорівнював 5,8-13 місяців. Однак, рівень реакції у пацієнтів, що одержували лапатиніб, дорівнював 0 % і час прогресування дорівнював 1,8 місяців (Philip, P.A., Mahoney, M.R., Allmer, С., Thomas, J., Pitot, H.C., Kim, G., Donehower, R.C., Fitch, Т., Picus, J., Erlichman, З.: J. Clin. Oncol. 23, 6657-63 (2005). Перорально активна форма інгібітора кіназ Сорафенібу (Nexavar, BAY43-9006) інгібує трансдукцію сигналу Raf/MEK/ERK в стадії кінази Raf, блокуючи за допомогою цього зростання ракових клітин. Крім того, за допомогою дії на тирозинкіназу VEGFR-2, VEGFR-3 і PGHFR-β, Сорафеніб індукує антиангіогенний ефект, і, отже, виявлялися сприятливі ефекти в порівнянні з перерахованими вище хіміотерапевтичними агентами. У клінічному дослідженні фази II на пацієнтах, що не є японцями, і пацієнтах-японцях, час прогресування був такий, що дорівнює 4,2-4,9 місяців, рівень реакції дорівнював 2-4 % і період виживання без прогресування дорівнював 9,2-15,6 місяців (Thomas, M.B., Dutta, А., Brown, Т., Charnsangavej, С., Rashid, А., Hoff, P.M., Dancey, J., Abbruzzese, J.L.: J. Clin. Oncol., 2005 ASCO 1 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Annual Meetung Proceedings, 23, 16S (2005)). Сунітиніб (SU11248) є мультикіназним інгібітором, подібним Сорафенібу, який має активність інгібування двох або більше типів кіназ (Mendel DB, Laird AD, Xin X, Louie SG, Christensen JG, Li G, Schreck RE, Abrams TJ, Ngai TJ, Lee LB, Murray LJ, CarverJ, Chan Е, Moss RG, Haznedar JO, Sukbuntherng J, Blake RA, Sun L, Tang С, Miller Т, Shirazian S, McMahon G, Cherrington JM; Clin Cancer Res (2003), 9, 327-37) і знаходиться в клінічному дослідженні відносно лікування печінково-клітинного раку (гепатоцелюлярної карциноми). У клінічному дослідженні, в якому 34 пацієнта із запущеним печінково-клітинним раком одержували Сунітініб, 1 пацієнт мав часткову реакцію після 12 тижнів лікування і 17 пацієнтів досягали стабільного стану. Було продемонстровано, що середня загальна виживаність дорівнювала 9,8 місяців, середня виживаність без прогресування 3,9 місяців (довірчий інтервал 2,6-6,9), виживаність без прогресування при трьох місяцях дорівнювала 56 % і виживаність без прогресування при шести місяцях дорівнювала 32 %, що дозволяє передбачати, що Сунітініб виявляє протипухлинну активність проти печінково-клітинного раку (гепатоцелюлярної карциноми) (Zhu А, Sahani D, di Tomaso Е et al., 99th AACR annual meeting. San Diego, CA, USA 12-16 April (2008)). Зазвичай, при прогресуванні раку печінки спостерігаються різні симптоми, специфічні для раку печінки і асоційовані з дисфункцією печінки, такі як відсутність апетиту, втрата маси, загальне почуття втоми, пальпована маса в правій підреберній ділянці, біль в правій підреберній ділянці, відчуття збільшення живота, лихоманка і жовтяниця. Однак, хіміотерапевтичні агенти, такі як Сорафеніб і лапатиніб, зазвичай мають ряд ускладнень, що включають в себе побічні ефекти, такі як діарея або констипація (запор), анемія, супресія імунної системи (до такого ступеню, що вона провокує інфекції або сепсис летальної тяжкості), кровотеча, серцева токсичність, печінкова токсичність, ниркова токсичність, відсутність апетиту і втрата маси. Хоча конкретні симптоми ранньої стадії зазвичай не помічаються у випадку раку печінки, по мірі прогресування раку печінки спостерігаються різні симптоми, специфічні для раку печінки і асоційовані з дисфункцією печінки, що включають в себе втрату апетиту, втрату маси, загальне почуття втоми, пальповану маса в правій підреберній ділянці, біль в правій підреберній ділянці, відчуття збільшення живота, лихоманку і жовтяницу. Клінічно спостерігали, що такі симптоми посилюються при застосуванні вищезгаданих хіміотерапевтичних агентів. Наприклад, відсутність апетиту у пацієнта, у якого був виявлений печінково-клітинний рак, і такі симптоми, як втрата маси, які асоційовані з відсутністю апетиту або незалежні від відсутності апетиту, іноді посилюються введенням хіміотерапевтичних агентів цьому пацієнту. При розвитку таких симптомів, іноді необхідне припинення застосування хіміотерапевтичних агентів. Таким чином, експансія вищезгаданих симптомів є фактором, який перешкоджає лікуванню хіміотерапевтичними агентами. Таким чином, існує потреба в забезпеченні кращих способів лікування в плані посилення терапевтичних ефектів і поліпшення якості життя пацієнта, що одержує лікування. Суть винаходу Таким чином, предметом даного винаходу є забезпечення лікарського засобу для лікування раку печінки, у пацієнтів, у яких спостерігається наявність симптомів, характерних для раку печінки, таких як втрата маси, асоційована з прогресуванням раку, здатний зменшувати побічні ефекти, характерні для хіміотерапевтичних агентів, такі як діарея або констипація (запор), анемія, супресія імунної системи (до такого ступеню, що вона провокує інфекції або сепсис летальної тяжкості), кровотеча, серцева токсичність, печінкова токсичність, ниркова токсичність, відсутність апетиту і втрата маси, які виникають з введенням хіміотерапевтичних агентів, таких як інгібітори кіназ, і який, крім того, здатний посилювати терапевтичні дії проти раку печінки. Автори цього винаходу виявили, що комбінуванням терапевтичного антитіла, яке зв'язує білок, який у високій мірі експресується в клітинах раку печінки і має здатність індукування цитотоксичності проти таких клітин, з лікарським засобом проти раку печінки, що містить як активний інгредієнт хіміотерапевтичний агент, ефективний проти клітин раку печінки, можуть бути досягнуті кращі терапевтичні ефекти у пацієнта з раком печінки, ніж у випадку, коли такий хіміотерапевтичний агент використовується окремо. Крім того, автори цього винаходу виявили також, що лікарський засіб даного винаходу, нарівні з викликанням вищезгаданих бажаних ефектів, значно зменшує побічні ефекти, характерні для хіміотерапевтичних агентів, такі як діарея або констипація (запор), анемія, супресія імунної системи (до такого ступеню, що вона провокує інфекції або сепсис летальної тяжкості), кровотеча, серцева токсичність, печінкова токсичність, ниркова токсичність, відсутність апетиту і втрата маси, виявляючи за допомогою цього хороші терапевтичні ефекти. 2 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, як показано в прикладах нижче, при використанні моделі раку печінки тварини не людини, імплантованого HepG2, як модель таких симптомів, як відсутність апетиту і втрата маси, асоційована з прогресуванням раку печінки, така втрата маси додатково посилювалася введенням хіміотерапевтичного агента, зокрема, Сорафенібу, в той час як втрата маси пригнічувалася введенням лікарського засобу відповідно до цього винаходу. Даним винаходом забезпечені: [1] Фармацевтична композиція для лікування або попередження раку печінки, що містить комбінацію хіміотерапевтичного агента і анти-гліпікан 3-антитіла; [2] Фармацевтична композиція за [1], де ця фармацевтична композиція є комбінованим препаратом; [3] Фармацевтична композиція за [1], де цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3антитіло вводять спільно; [4] Фармацевтична композиція за [3], де цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3антитіло вводять одночасно або послідовно; [5] Фармацевтична композиція за [3], де цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3антитіло вводять роздільно; [6] Фармацевтична композиція для лікування або попередження раку печінки для застосування в комбінації з хіміотерапевтичним агентом, причому вказана композиція містить анти-гліпікан 3-антитіло як активний інгредієнт; [7] Фармацевтична композиція за [6], де це анти-гліпікан 3-антитіло вводять одночасно з хіміотерапевтичним агентом; [8] Фармацевтична композиція за [6], де це анти-гліпікан 3-антитіло вводять до або після хіміотерапевтичного агента; [9] Фармацевтична композиція для лікування або попередження раку печінки для застосування в комбінації з анти-гліпікан 3-антитілом, причому вказана композиція містить хіміотерапевтичний агент як активний інгредієнт; [10] Фармацевтична композиція за [9], де цей хіміотерапевтичний агент вводять одночасно з анти-гліпікан 3-антитілом; [11] Фармацевтична композиція за [9], де цей хіміотерапевтичний агент вводять до або після введення анти-гліпікан 3-антитіла; [12] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1]-[11], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор кінази; [13] Фармацевтична композиція за [12], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор мультикіназ; [14] Фармацевтична композиція за [12] або [13], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сорафеніб (BAY43-9006); [15] Фармацевтична композиція за [12] або [13], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сунітініб; [16] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1]-[15], де анти-гліпікан 3-антитіло має цитотоксичність; [17] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1]-[16], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [18] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1]-[17], де це анти-гліпікан 3-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися друге антитіло, де вказане друге антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, який містить CDR1, 3 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, 6 і 7, відповідно, і варіабельну ділянку L-ланцюга, який містить CDR1, 3 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, 24 і 25, відповідно; [19] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1]-[16] або [18], де це анти-гліпікан 3антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: 3 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [20] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1] [16] або [18], де це анти-гліпікан-3антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [21] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1] [16] або [18], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [22] Фармацевтична композиція за будь-яким з [1]-[21], де це анти-гліпікан 3-антитіло є гуманізованим антитілом; [23] Фармацевтична композиція за [22], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:4; [24] Фармацевтична композиція за [22], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, в якій 34-ий Gly SEQ ID NO:4 замінений іншим амінокислотним залишком; [25] Фармацевтична композиція за [22], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:27; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:29; [26] Фармацевтична композиція за [22], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:31; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:33; [27] Агент для зменшення побічного ефекту, що викликається лікуванням раку печінки хіміотерапевтичним агентом, причому вказаний агент містить терапевтичне антитіло як активний інгредієнт; [28] Зменшуючий побічний ефект агент за [27], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор кінази; [29] Зменшуючий побічний ефект агент за [27], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор мультикіназ; [30] Зменшуючий побічний ефект агент за [28] або [29], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сорафеніб (BAY43-9006); [31] Зменшуючий побічний ефект агент за [28] або [29], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сунітініб; 4 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [32] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [27]-[31], де цим побічним ефектом є втрата маси; [33] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [27]-[32], де цим терапевтичним антитілом є анти-гліпікан 3-антитіло; [34] Зменшуючий побічний ефект агент за [33], де це анти-гліпікан 3-антитіло має цитотоксичність; [35] Зменшуючий побічний ефект агент за [33] або [34], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:8, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [36] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [33]-[35], де це анти-гліпікан 3антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися друге антитіло, де вказане друге антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 3 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, 6 і 7, відповідно, і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 3 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, 24 і 25, відповідно; [37] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [33], [34] або [36], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [38] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [33], [34] або [36], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [39] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [33], [34] або [36], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [40] Зменшуючий побічний ефект агент за будь-яким з [33]-[39], де це анти-гліпікан 3антитіло є гуманізованим антитілом; [41] Зменшуючий побічний ефект агент за [40], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:4; 5 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [42] Зменшуючий побічний ефект агент за [40], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, в якій 34-ий Gly SEQ ID NO:4 замінений іншим амінокислотним залишком; [43] Зменшуючий побічний ефект агент за [40], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:27; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:29; [44] Зменшуючий побічний ефект агент за [40], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:31; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:33; [45] Фармацевтична композиція для посилення ефективності лікування раку печінки хіміотерапевтичним агентом, причому вказана композиція містить анти-гліпікан 3-антитіло; [46] Фармацевтична композиція за [45], де це анти-гліпікан 3-антитіло вводять одночасно з хіміотерапевтичним агентом; [47] Фармацевтична композиція за [45], де це анти-гліпікан 3-антитіло вводять до або після введення хіміотерапевтичного агента; [48] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[47], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор кінази; [49] Фармацевтична композиція за [48], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор мультикіназ; [50] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[49], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сорафеніб (BAY43-9006); [51] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[49], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сунітініб; [52] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[51], де анти-гліпікан 3-антитіло має цитотоксичність; [53] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[52], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [54] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[53], де це анти-гліпікан 3-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися друге антитіло, де вказане друге антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 3 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, 6 і 7, відповідно, і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 3 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, 24 і 25, відповідно; [55] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[52] або [54], де це анти-гліпікан 3антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [56] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[52] або [54], де це анти-гліпікан 3антитіло містить: 6 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [57] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]- [52] або [54], де це анти-гліпікан 3антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [58] Фармацевтична композиція за будь-яким з [45]-[57], де це анти-гліпікан 3-антитіло є гуманізованим антитілом; [59] Фармацевтична композиція за [58], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:4; [60] Фармацевтична композиція за [58], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, в якій 34-ий Gly SEQ ID NO:4 замінений іншим амінокислотним залишком; [61] Фармацевтична композиція за [58], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:27; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:29; [62] Фармацевтична композиція за [58], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:31; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:33; [63] Спосіб лікування або попередження раку печінки у суб'єкта, що передбачає введення цьому суб'єкту комбінації ефективної кількості хіміотерапевтичного агента і анти-гліпікан 3антитіла; [64] Спосіб за [63], де цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3-антитіло вводять одночасно або послідовно; [65] Спосіб за [63], де цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3-антитіло вводять роздільно; [66] Спосіб за будь-яким з [63]-[65], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор кінази; [67] Спосіб за [66], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор мультикіназ; [68] Спосіб за [66] або [67], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сорафеніб (BAY43-9006); [69] Спосіб за [66] або [67], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сунітініб; [70] Спосіб за будь-яким з [63]-[69], де це анти-гліпікан 3-антитіло має цитотоксичність; [71] Спосіб за будь-яким з [63]-[70], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:8, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і 7 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [72] Спосіб за будь-яким з [63]-[71], де це анти-гліпікан 3-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися друге антитіло, де вказане друге антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, 6 і 7, відповідно, і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, 24 і 25, відповідно; [73] Спосіб за будь-яким з [63], [70] або [72], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [74] Спосіб за будь-яким з [63], [70] або [72], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [75] Спосіб за будь-яким з [63], [70] або [72], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [76] Спосіб за будь-яким з [63]-[75], де це анти-гліпікан 3-антитіло є гуманізованим антитілом; [77] Спосіб за [76], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:4; [78] Спосіб за [76], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, в якій 34-ий Gly SEQ ID NO:4 замінений іншим амінокислотним залишком; [79] Спосіб за [76], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:27; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:29; [80] Спосіб за [76], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:31; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:33; [81] Спосіб зменшення побічного ефекту, що викликається лікуванням раку печінки хіміотерапевтичним агентом у суб'єкта, що передбачає введення цьому суб'єкту ефективної кількості терапевтичного антитіла; [82] Спосіб за [81], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор кінази; 8 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [83] Спосіб за [81] або [82], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор мультикіназ; [84] Спосіб за [82] або [83], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сорафеніб (BAY43-9006); [85] Спосіб за [82] або [83], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сунітініб; [86] Спосіб за будь-яким з [81]-[85], де цим побічним ефектом є втрата маси; [87] Спосіб за будь-яким з [81]-[86], де цим терапевтичним антитілом є анти-гліпікан 3антитіло; [88] Спосіб за [87], де це анти-гліпікан 3-антитіло має цитотоксичність; [89] Спосіб за [87] або [88], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:8, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [90] Спосіб за будь-яким з [87]-[89], де це анти-гліпікан 3-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися друге антитіло, де вказане друге антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, 6 і 7, відповідно, і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, 24 і 25, відповідно; [91] Спосіб за будь-яким з [87], [88] або [90], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [92] Спосіб за будь-яким з [87], [88] або [89], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [93] Спосіб за будь-яким з [87], [88] або [90], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [94] Спосіб за будь-яким з [87]-[93], де це анти-гліпікан 3-антитіло є гуманізованим антитілом; [95] Спосіб за [94], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:4; [96] Спосіб за [94], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і 9 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, в якій 34-ий Gly SEQ ID NO:4 замінений іншим амінокислотним залишком; [97] Спосіб за [94], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:27; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:29; [98] Спосіб за [94], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:31; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:33; [99] Спосіб для посилення ефективності лікування раку печінки хіміотерапевтичним агентом у суб'єкта, що передбачає введення цьому суб'єкту ефективної кількості анти-гліпікан 3антитіла. [100] Спосіб за [99], де це анти-гліпікан 3-антитіло вводять одночасно з хіміотерапевтичним агентом; [101] Спосіб за [99], де це анти-гліпікан 3-антитіло вводять до або після хіміотерапевтичного агента; [102] Спосіб за будь-яким з [99]-[101], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор кінази; [103] Спосіб за [102], де цим хіміотерапевтичним агентом є інгібітор мультикіназ; [104] Спосіб за будь-яким з [99]-[103], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сорафеніб (BAY43-9006); [105] Спосіб за будь-яким з [99]-[103], де цим хіміотерапевтичним агентом є Сунітініб; [106] Спосіб за будь-яким з [99]-[103], де анти-гліпікан 3-антитіло має цитотоксичність; [107] Спосіб за [99]-[106], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:8, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [108] Спосіб за будь-яким з [99]-[107], де це анти-гліпікан 3-антитіло здатне зв'язуватися з епітопом, з яким може зв'язуватися друге антитіло, де вказане друге антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, 6 і 7, відповідно, і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3, що містять амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:8, 24 і 25, відповідно; [109] Спосіб за будь-яким з [99]-[106] або [108], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [110] Спосіб за будь-яким з [99]-[106] або [108], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [111] Спосіб за будь-яким з [99]-[106] або [108], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: 10 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; [112] Спосіб за будь-яким з [99]-[111], де це анти-гліпікан 3-антитіло є гуманізованим антитілом; [113] Спосіб за [112], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:4; [114] Спосіб за [112], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:3; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, в якій 34-ий Gly SEQ ID NO:4 замінений іншим амінокислотним залишком; [115] Спосіб за [112], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:27; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:29; [116] Спосіб за [112], де це анти-гліпікан 3-антитіло містить: варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:31; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:33. Короткий опис фігур Фіг. 1 є графіком, що показує переважні зростання ефекти на клітинах раку печінки за допомогою об'єднаного введення доксорубіцину (DOX) або мітоксантрону (МХ) і антитіла GC33; Фіг. 2 є графіком, що показує протипухлинні ефекти, на основі зміни обсягу пухлини, антитіла hGC33 і Сорафенібу в мишачій моделі, імплантованій клітинами клітинної лінії Huh-7 раку печінки людини; Фіг. 3 є графіком, що показує протипухлинні ефекти, на основі зміни обсягу пухлини, антитіла hGC33 і Сорафенібу в мишачій моделі, імплантованій клітинами клітинної лінії HepG-2 раку печінки людини; і Фіг. 4 є графіком, що показує протипухлинні ефекти антитіла hGC33 і Сорафенібу на втраті маси мишачої моделі, імплантованій клітинами клітинної лінії HepG2 раку печінки людини, на основі змін маси цієї моделі. Фіг. 5 є графіком, що показує протипухлинні ефекти антитіла pH7L16 і Сорафенібу на мишачій моделі, імплантованій клітинною лінією HepG2 раку печінки людини, виражені у вигляді зміни обсягу пухлини. Фіг. 6 є графіком, що показує ефекти антитіла pH7L16 і Сорафенібу на втраті маси в мишачій моделі, імплантованій клітинною лінією HepG2 раку печінки людини, виражені у вигляді зміни маси тіла. Фіг. 7 є графіком, що показує протипухлинні ефекти антитіла hGC33 і Сорафенібу на втраті маси мишачої моделі, імплантованій клітинною лінією HepG2 раку печінки людини, виражені у вигляді зміни обсягу пухлини (середнє (SD).) Фіг. 8 показує амінокислотну послідовність варіабельних ділянок Н-ланцюга і L-ланцюга гуманізованих антитіл, що переважно використовуються в даному винаході. Фіг. 9 показує амінокислотну послідовність CDR варіабельних ділянок Н-ланцюга і L-ланцюга гуманізованих антитіл, що переважно використовуються в даному винаході. Опис переважних варіантів здійснення Даний винахід забезпечує фармацевтичну композицію для лікування або попередження раку печінки, що містить комбінацію хіміотерапевтичного агента і анти-гліпікан 3-антитіла. У даному контексті, фраза "фармацевтична композиція для лікування або попередження раку печінки, що містить комбінацію хіміотерапевтичного агента і анти-гліпікан 3-антитіла" належить до фармацевтичної композиції, в якій хіміотерапевтичний агент і анти-гліпікан 3 11 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло об'єднані для спільного, роздільного або послідовного введення в лікуванні або попередженні раку печінки. Ця фармацевтична композиція може бути забезпечена в формі об'єднаного препарату, який містить як хіміотерапевтичний агент, так і анти-гліпікан 3-антитіло. Альтернативно, лікарський засіб, що містить хіміотерапевтичний агент, і лікарський засіб, що містить анти-гліпікан 3-антитіло, може бути забезпечені окремо і використовуватися спільно, роздільно або послідовно. Може бути також забезпечений набір, що складається з лікарського засобу, що містить хіміотерапевтичний агент, і лікарського засобу, що містить анти-гліпікан 3антитіло. У вищезгаданій фармацевтичній композиції, коли цей хіміотерапевтичний агент і це антигліпікан 3-антитіло забезпечені в роздільних лікарських засобах, ці лікарські засоби можуть мати однакову лікарську форму або різні лікарські форми. Наприклад, обидва можуть бути взаємно відмінними формами лікарського засобу, вибраними з парентеральних лікарських засобів, ін'єкційних розчинів, крапель і внутрішньовенних рідин, або обидва можуть бути однаковими лікарськими формами, вибраними з парентеральних лікарських засобів, ін'єкційних розчинів, крапель і внутрішньовенних рідин. Крім того, один або декілька інших типів лікарського засобу можуть також об'єднуватися у вищезгаданій фармацевтичній композиції. В іншому аспекті, цей винахід забезпечує фармацевтичну композицію, що містить антигліпікан 3-антитіло як активний інгредієнт, для застосування в комбінації з хіміотерапевтичним агентом для лікування або попередження раку печінки. При застосуванні фармацевтичної композиції, що містить анти-гліпікан 3-антитіло як активний інгредієнт, в комбінації з хіміотерапевтичним агентом, вона може вводитися одночасно з цим хіміотерапевтичним агентом або може вводитися до або після цього хіміотерапевтичного агента. При введенні антигліпікан 3-антитіла до або після хіміотерапевтичного агента, період введення доз може бути оптимізований вимірюванням залишкової концентрації хіміотерапевтичного агента в цьому суб'єктові. Ця концентрація може бути визначена піддаванням проб, взятих у цього суб'єкта, способу аналізу, відомому особам із звичайною кваліфікацією в даній галузі, з використанням окремого приладу, такого як різні типи хроматографів. У наступному аспекті, цей винахід забезпечує фармацевтичну композицію, що містить хіміотерапевтичний агент як активний інгредієнт, для застосування в комбінації з анти-гліпікан 3антитілом для лікування або попередження раку печінки. При використанні цієї фармацевтичної композиції, що містить хіміотерапевтичний агент як активний інгредієнт, разом з анти-гліпікан 3антитілом, вона може вводитися одночасно з анти-гліпікан 3-антитілом або може вводитися до або після анти-гліпікан 3-антитіла. При введенні хіміотерапевтичного агента до або після антигліпікан 3-антитіла, період введення доз може бути оптимізований вимірюванням залишкової концентрації анти-гліпікан 3-антитіла у цього суб'єкта. Ця концентрація може бути визначена піддаванням проб, взятих у цього суб'єкта, імунологічному вимірюванню, відомому особам із звичайною кваліфікацією в даній галузі, такому як описаний нижче спосіб ELISA. Хіміотерапевтичний агент Хіміотерапевтичний агент, що використовується в цьому винаході, включає в себе всі хіміотерапевтичні агенти, які використовуються або які вважаються корисними в хіміотерапії раку. Цей хіміотерапевтичний лікарський засіб може ін'єктуватися локально або може вводитися системно. При локальній ін'єкції лікарського засобу, ін'єкція може виконуватися способом, відомим кваліфікованим в даній галузі фахівцям. Наприклад, в черезкатетерній артеріальній емболізації (ТАЕ), селективний некроз гепатоцелюлярної карциноми індукують інфузією суміші контрастної речовини на основі масла (Ліпіодола), канцеростатичної і закупорювальної речовини (желатинової губки, що розсмоктується, Gelfoam) в печінкову артерію, що служить як шлях доставки нутрієнтів до пухлини, і закупорюють за допомогою цього живильну аретрію. З іншого боку, в системній хіміотерапії, лікарські засоби, такі як фторурацил (5-FU), урацилтегафур (UFT), мітоміцин С (ММС), мітоксатрон (DHAD), адріаміцин (ADR) (іншою назвою для якого є доксорубіцин (DXR)), епірубіцин (EPI) або цисплатин (CDDR), використовують по окремості або в комбінації з інтерфероном (IFN). Крім того, хіміотерапевтичні агенти, такі як лапатиніб, що мають механізм дії, який включає в себе інгібування кіназ, також використовують переважно як хіміотерапевтичний агент в даному винаході. Сорафеніб, який має механізм дії, що включає в себе інгібування кіназ, також переважно використовують як хіміотерапевтичний агент в даному винаході. Незалежно від механізму дії, хіміотерапевтичний агент, що вигідним чином використовується в даному винаході, може включати в себе хіміотерапевтичні агенти, які викликають побічні ефекти, характерні для хіміотерапевтичних агентів при введенні суб'єкту, що має рак печінки, такі як діарея або констипація (запор), анемія, супресія імунної системи (до такого ступеню, що вона провокує інфекції або сепсис летальної тяжкості), кровотеча, серцева токсичність, печінкова токсичність, ниркова токсичність, відсутність апетиту і втрата маси. 12 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сорафеніб (4-[4-[[4-хлор-3-(трифторметил)феніл]карбамоїламіно]фенокси]-N-метилпіридин2-карбоксіамід) є перорально активною, низькомолекулярною сполукою, яка має молекулярну масу 464,7. Тозилат Сорафенібу (BAY 43-9006), його тозилова (толуолсульфонатна) сіль, був схвалений в Європі і Сполучених Штатах як терапевтичний агент для застосування в системній хіміотерапії для раку печінки. Крім Сорафенібу, Сунатініб (SU11248), який, як було показано, має протипухлинну активність проти раку печінки в клінічному дослідженні на пацієнтах з гепатоцелюлярним раком, може також використовуватися як хіміотерапевтичний агент в даному винаході. Сорафеніб або Сунітініб можуть бути також переважно використовуватися у вигляді їх фармацевтично прийнятних солей. Відповідні приклади таких солей включають в себе неорганічні солі, такі як гідрохлорид, гідробромід, гідройодид, сульфат або фосфат; солі сульфонових кислот, такі як метансульфанат, бензолсульфонат і толуолсульфонат; солі карбонових кислот, такі як форміат, ацетат, оксалат, малеат, фумарат, цитрат, малат, сукцинат, малонат, глюконат, манделат, бензоат, саліцилат, фторацетат, трифторацетат, тартрат, пропіонат і глутарат; солі лужних металів, такі як сіль літію, сіль натрію, сіль калію, сіль цезію і сіль рубідію; солі лужно-земельних металів, такі як сіль магнію і сіль кальцію; і солі амонію, такі як сіль амонію, солі алкіламонію, солі діалкіламонію, солі триалкіламонію і солі тетраалкіламонію. З них, особливо переважним є застосування BAY 43-9006, який є тозиловою сіллю (сіллю толуолсульфонової кислоти). У хіміотерапії може переважно використовуватися або пероральний, або парентеральний спосіб введення, хоча переважним є пероральне введення. Лікарська форма, що використовується для перорального введення, може бути відповідним чином вибрана з будьяких лікарських форм, таких як рідкі препарати, порошки, гранули, таблетки, препарати і капсули, що мають ентеросолюбільне покриття. Хіміотерапевтичні агенти, що мають ці лікарські форми, готують способом, відомим особам із звичайною кваліфікацією в даній галузі. Наприклад, приготування може проводитися відповідним об'єднанням з фармацевтично прийнятним носієм або розчинником, таким як стерилізована вода або фізіологічний розчин, рослинна олія, емульгуючий агент, суспендуючий агент, поверхнево-активна речовина, стабілізатор, ароматичний агент, ексципієнт, носій, консервант і зв'язуючий агент, і тонким змішуванням в форму уніфікованої (стандартної) дози, необхідної для загальноприйнятої фармацевтичної практики, з подальшими ліофілізацією, таблетуванням і іншими утворюючими препарат операціями. Хіміотерапевтичний агент може також використовуватися парентерально в формі ін'єкційного розчину, такого як стерильний розчин або суспензія у воді або деякій іншій фармакологічно прийнятній рідині. Кількість активного інгредієнта в цих препаратах вибирають відповідним чином, так щоб дозволити введення відповідної дози в межах вказаного діапазону. Стерильні композиції для ін'єкції можуть бути приготовані відповідно до загальноприйнятої фармацевтичної практики з використанням такого носія, як дистильована вода для ін'єкції. Приклади водних розчинів для ін'єкції включають в себе фізіологічний розчин і ізотонічні розчини, що містять глюкозу і іншу ад'юванти, такі як D-сорбіт, D-маноза, D-маніт і хлорид натрію; спільно можуть бути використані відповідні розчинні ад'юванти, такі як спирти (наприклад, етанол, поліолі, такі як пропіленгліколь і поліетиленгліколь, і неіоногенні тм поверхнево-активні речовини, такі як Полісорбат 80 і HCO-50. Приклади рідин на основі масла включають в себе кунжутну олію і соєву олію; спільно можуть бути використані розчинні ад'юванти, такі як бензилбензоат і бензиловий спирт. Крім того, можливе відповідне приготування з буферними агентами (наприклад, фосфатними буферами, натрій-ацетатними буферами), заспокійливими агентами (наприклад, бензиловим спиртом, фенолом) і антиоксидантами. Терапевтичне антитіло Будь-яке антитіло, яке зв'язується з білками, що експресуються в клітинах раку печінки, і здатне викликати цитотоксичність проти таких клітин, може бути відповідним чином використане як терапевтичне антитіло в фармацевтичній композиції даного винаходу. Білками, які є переважними як молекули-мішені для цього антитіла, є білки, які експресуються на поверхні клітин раку печінки. З точки зору одержання ефектів лікування антитілами, переважно, щоб більш висока кількість молекул-мішеней експресувалася на клітинній поверхні, хоча такі ефекти необов'язково залежать від кількості молекул. Бажано вибирати як мішень молекулу, яка специфічно експресується в клітинах раку в порівнянні з експресією в нормальних клітинах. Переважним прикладом такого білка є гліпікан 3. Гліпікан 3 є одним з сімейства протеогліканів гепарансульфатів, присутніх на поверхні клітин. Передбачалося, що гліпікан 3 може брати участь в клітинному діленні під час розвитку і в проліферації ракових клітин, хоча його функція ще добре не вивчена. Було виявлено, що деякі 13 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 типи антитіл, які зв'язуються з гліпіканом 3, виявляють пригнічуючу ріст клітин дію внаслідок антигензалежної клітинної цитотоксичності (що скорочується нижче як "ADCC-активність") і комплементзалежної клітинної цитотоксичності (що скорочується нижче як "CDC-активність") (див. WO 2003/000883). Крім того, відомо, що антитіло GC33, яке зв'язується зі специфічним епітопом, виявляє більш високу активність ADCC і CDC проти клітин раку печінки (див. WO 2006/006693). Переважно, анти-гліпікан 3-антитіла можуть бути використані в лікарському засобі для раку печінки даного винаходу. Прикладом такого переважного анти-гліпікан 3-антитіла є антитіло GC33 (WO 2006/006693). Амінокислотні послідовності варіабельних ділянок Н-ланцюгів і L-ланцюгів в антитілі GC33 показані в SEQ ID NO:1 і 2, відповідно. Анти-гліпікан 3-антитіло може бути одержане з гібридоми на основі відомого способу (див. WO 2006/006693). Альтернативно, анти-гліпікан 3-антитіло може бути створене генною інженерією. Наприклад, рекомбінантне антитіло може бути одержане з використанням способу генетичної рекомбінації, яка включає в себе клонування гена цього антитіла з гібридоми, вбудовуванням цього гена у відповідний вектор і введенням цього вектора в хазяїна (наприклад, див. Vandamme, A.M. et al.: Eur. J. Biochem. 192, 767-75 (1990)). Конкретно, мРНК, що кодує варіабельну (V) ділянку анти-гліпікан 3-антитіла, виділяють з гібридоми, яка продукує антигліпікан 3-антитіло. Виділення мРНК проводять одержанням з гібридомних клітин з використанням відомого способу, такого як гуанідин-центрифугування (Chirgiwin, J.M. et al.: Biochemie 18, 5294-5299 (1979)) або спосіб AGPC (Chomczynski, Р. et al.: Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)), з подальшим одержанням мРНК-мішені з використанням, наприклад, набору для очищення мРНК (доступного з Pharmacia). Альтернативно, мРНК може бути одержана безпосередньо з гібридоми з використанням набору для очищення мРНК QuickPrep (Pharmacia). З використанням зворотної транскриптази, кДНК для V-ділянки цього антитіла синтезують з одержаним таким чином мРНК. Синтез кДНК може проводитися з використанням, наприклад, набору AMV для синтезу першого ланцюга кДНК зворотною транскриптазою (доступного з Seikagaku Corporation). Альтернативно, переважно використовують набір 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) і спосіб 5'-RACE (Frohman, M.A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002 (1988); Belyavsky, А. et al.: Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932 (1989)), який використовує полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) для синтезу і ампліфікації кДНК. У ході такого синтезу кДНК вводять відповідні сайти рестрикційних ферментів в обидва кінці цієї кДНК, як описано більш детально нижче. Одержану послідовність кДНК підтверджують, потім кДНК, що кодує V-ділянку антигліпікан 3-антитіла-мішені, вбудовують в експресуючий вектор, що несе константну ділянку (Сділянку) бажаного антитіла, для злиття в рамці зчитування з ДНК, що кодує цю С-ділянку. Для одержання анти-гліпікан 3-антитіла, що використовується в даному винаході, ділянку, яка регулює експресію цього гена антитіла, вводять в експресуючий вектор таким чином, що експресія відбувається під контролем, наприклад, енхансерів і промоторів. Потім цю клітинухазяїна трансформують експресуючим вектором для одержання рекомбінантної клітини, яка експресує ДНК, що кодує анти-гліпікан 3-антитіло. Експресію гена антитіла можна провести окремою інтеграцією ДНК, що кодує важкі ланцюги (Н-ланцюги) або легкі ланцюги (L-ланцюги), в що експресують вектори і котрансформацією цієї клітини-хазяїна, або інтеграцією ДНК, що кодує Н-ланцюги і L-ланцюги, в єдиний експресуючий вектор і трансформацією цією клітини-хазяїна (див. WO 1994/011523). У випадках, коли ген антитіла виділяють і вводять у відповідний хазяїн для одержання цього антитіла, переважно може бути використана комбінація відповідного хазяїна і експресуючого вектора. При використанні еукаріотичної клітини як хазяїна переважним є застосування клітини тварини, клітини рослини або грибної клітини. Ілюстративні приклади клітин тварин включають в себе (1) клітини ссавців, такі як СНО, COS, клітини мієломи, клітини золотистого (сирійського) хом'ячка (ВНК), HeLa і VERO; (2) клітини земноводних, такі як ооцити Африканської шпорцевої жаби (Xenopus); і (3) клітини комах, такі як sf9, sf21 і Tn5. Ілюстративні приклади клітин рослин включають в себе клітини, одержані з роду Nicotiana, наприклад, Nicotiana tabacum, які є клітинами, наприклад, що культивуються у вигляді калусу. Ілюстративні грибні клітини включають в себе дріжджі, такі як дріжджі роду Saccharomyces (наприклад, Saccharomyces cerevisiae); і міцеліальні гриби, такі як гриби роду Aspergillus (наприклад, Aspergillus niger). При застосуванні прокаріотичної клітини переважним є застосування продукційної системи, яка використовує бактеріальні клітини. Ілюстративні приклади відповідних бактеріальних клітин включають в себе Escherichia coli і Bacillus subtilis. Експресуючий вектор, що містить ген антитіла-мішені, вводять в ці клітини трансформацією і трансформовані клітини культивують in vitro. Бажане антитіло може бути одержане з культури трансформованих клітин. Одержання рекомбінантних антитіл не обмежується тільки вищеописаними клітинамихазяїнами, але можуть бути переважно використані також трансгенні тварини. Наприклад, ген 14 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла може бути сконструйований у вигляді злитого гена інсертуванням його в рамці зчитування в ген, що кодує білок, первинно продукований в молоці (наприклад, ген β-казеїну кози). ДНК-фрагменти, що містять цей злитий ген, в якому вбудований ген антитіла, вводять в зародки кози і одержані зародки імплантують в самицю кози. Бажані антитіла можуть бути одержані з молока, що виробляється трансгенними козами, народженими козами, які одержували ці зародки, або з потомства цих трансгенних кіз. Для збільшення кількості молока, що містить бажане антитіло, яке продукується трансгенними козами, в цих трансгенних козах можуть бути відповідним чином використані гормони (Ebert, K.M., et al.: Bio/Technology 12, 699702 (1994)). У даному винаході, можуть бути використані генетично рекомбінантні антитіла, які були штучно модифіковані, наприклад, для зниження гетероантигенності відносно людини, такі як химерні антитіла і гуманізовані антитіла. Ці модифіковані антитіла можуть бути одержані з використанням відомого способу. Химерним антитілом є антитіло, що складається з варіабельних ділянок важкого ланцюга і легкого ланцюга, наприклад, антитіла миші, і константних ділянок важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіла людини. Таке химерне антитіло може бути одержане лігуванням ДНК, що кодує ці варіабельні ділянки мишачого антитіла, з ДНК, що кодує константні ділянки антитіла людини, і експресією цього антитіла у відповідному хазяїні. Переважним прикладом гуманізованого антитіла є антитіло hGC33 (WO 2006/006693). Амінокислотна послідовність варіабельних ділянок Н-ланцюга і L-ланцюга антитіла hGC33 показані в SEQ ID NO:3 і 4, відповідно. С-ділянки антитіл людини використовуються в константних ділянках химерних антитіл і гуманізованих антитіл. Наприклад, Сγ1, Сγ2, Сγ3 і Сγ4 можуть бути використані як Н-ланцюги і Сκ і Сλ можуть бути використані як L-ланцюги. Послідовності цих ділянок відомі. Для поліпшення цього антитіла або його продукційної стабільності С-ділянки антитіла людини можуть бути модифіковані. Химерні антитіла складаються з V-ділянок з антитіла ссавця не людини і С-ділянок з антитіла людини. Гуманізовані антитіла складаються з визначальних комплементарність ділянок (CDR) з антитіла ссавця не людини, каркасних ділянок (FR) з антитіла людини і Сділянок з антитіла людини. Оскільки гуманізовані антитіла будуть мати більш низьку антигенність в тілі людини, вони застосовні як активний інгредієнт в лікарському засобі цього винаходу. Гуманізовані антитіла, які також називають реконструйованими антитілами людини, одержують, наприклад, заміною CDR антитіла миші CDR антитіла людини. Загальні способи генетичної рекомбінації для виконання такої заміни відомі. Конкретно, ДНК-послідовність конструюють таким чином, що CDR антитіла миші і FR антитіла людини зливають в рамці зчитування і синтезують за допомогою ПЛР-способу з використанням як праймерів множини олігонуклеотидів, сконструйованих таким чином, що вони мають частини, які перекриваються в їх кінцях. Гуманізоване антитіло може бути одержане інсертуванням в експресуючий вектор ДНК, одержаної, як описано вище, і ДНК, що кодує С-ділянку антитіла людини, так що вони зливаються в рамці зчитування, і експресією одержаної ДНК у відповідній клітині-хазяїні (див. Європейський патент № 239400 і WO 96/003576). Вироблені з антитіла людини FR-ділянки, що використовуються в одержанні гуманізованого антитіла, вибирають таким чином, що CDR будуть утворювати хороший антигензв'язувальний сайт при лігуванні з цим FR. Зв'язувальну активність одержаного таким чином гуманізованого антитіла вимірюють якісно і кількісно, і FR цього антитіла людини може бути відповідним чином вибраний на основі цієї зв'язувальної активності. Якщо необхідно, амінокислоти цього FR в Vділянці цього антитіла можуть бути замінені таким чином, що CDR реконструйованого антитіла людини утворює відповідний антигензв'язувальний сайт. Вищезгадані амінокислотні заміни вводять легко загальноприйнятим ПЛР-способом. За допомогою вимірювання і оцінювання зв'язувальної активності варіантного антитіла, що має таку амінокислотну заміну, відбирають модифіковану FR-послідовність, що має бажані якості (Sato, K. et al.: Cancer Res. 53, 851-856 (1993)). Спосіб одержання антитіл людини також відомі. Наприклад, бажане антитіло людини, що має антигензв'язувальну активність, може бути одержане сенсибілізацією лімфоцитів людини in vitro бажаним антигеном або клітинами, які експресують бажаний антиген, потім злиттям цих сенсибілізованих лімфоцитів з клітинами мієломи людини, такими як U266 (див. Публікацію патенту Японії № Н1-59878). Альтернативно, бажані антитіла людини можуть бути одержані імунізацією трансгенної тварини, що має повний репертуар (спектр) генів антитіл людини, бажаним антигеном (див. Міжнародні Публікації WO 1993/012337, WO 1992/03918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096 і WO 1996/033735). Крім того, відомий також 15 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 спосіб одержання антитіл людини за допомогою пенінгу проти бібліотеки антитіл людини. Наприклад, можна експресувати V-ділянку антитіла людини у вигляді одноланцюжкового антитіла (scFv) на поверхні фагів з використанням способів фагового дисплею і відібрати фаги, які зв'язуються з цим антигеном. ДНК-послідовність, що кодує V-ділянку антитіла людини, яке зв'язується з цим антигеном, може бути визначена аналізом генів відібраних фагів. ДНКпослідовність scFv, яка зв'язується з цим антигеном, визначають і зливають в рамці зчитування з послідовністю для С-ділянки бажаного антитіла людини. Цей злитий білок може бути експресований у відповідній клітині з одержанням антитіла людини. Такі способи вже відомі в даній галузі і можуть практикуватися з посиланням на Міжнародні Публікації WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438 і WO 1995/015388. Ген антитіла, сконструйований, як описано вище, може бути експресований і виділений відомими способами. При використанні клітини ссавця, цей ген антитіла може бути експресований функціональною сполукою зазвичай використовуваного промотору, гена антитіла, що підлягає експресії, і полі А-сигналу на 3'-кінці (праворуч). Переважним прикладом промотору/енхансера є негайно ранній промотор/енхансер цитомегаловірусу людини. Інші застосовні промотори/енхансери включають в себе промотор/енхансери ретровірусів, поліомавірусів, аденовірусів і вірусу 40 мавпи (SV40); і промотор/енхансери, вироблені з клітин ссавців, такі як фактор елонгації 1α людини (HEF1α). При використанні промотору/енхансера SV40, експресія гена може легко проводитися за способом Milligan et al. (Nature 277, 108 (1979)). При використанні промотору/енхансера HEF1α, експресія гена може легко проводитися за способом Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990)). При використанні Е. coli, цей ген антитіла може бути експресований функціональною сполукою зазвичай промотору, що використовується, сигнальної послідовності для секреції антитіла і гена антитіла, який повинен бути експресований. Переважні приклади цього промотору включають в себе промотор lacZ і промотор araB. При використанні промотору lacZ цей ген експресують за способом Ward et al. (Nature 341, 544-546 (1989); FASEB J. 2422-2427 (1992)). При використанні промотору araB, цей ген експресують за способом Better et al. (Science 240. 1041-1043 (1998)). При одержанні цього антитіла в периплазмі Е. coli, як сигнальна послідовність для секреції антитіла може бути використана сигнальна послідовність pe1B (Lei, S.P. et al.: J. Bacteriol. 169, 4379 (1987)). Після виділення антитіла, продукованого в периплазмі, структура цього антитіла може бути повторно укладена з використанням агента денатурації, такого як сечовина або гідрохлорид гуанідину, так що це антитіло має бажану зв'язувальну активність. Сайт ініціації реплікації, який повинен бути інсертований в цей експресуючий вектор, переважно вибирають, наприклад, з SV40, поліомавірусів, аденовірусів і бичачих папіломавірусів (BPV). Крім того, для ампліфікації кількості піків генів в системі клітини-хазяїна, як селектований маркер в цей експресуючий вектор може бути інсертований ген аміноглікозидтрансферази (APH), ген тимідинкінази (ТК), ген ксантин-гуанінфосфорибозилтрансферази Escherichia coli (Ecogpt) або ген дигідрофолатредуктази (dhfr). Для одержання антитіла даного винаходу, може бути використана будь-яка експресійна система, така як еукаріотична клітина або прокаріотична клітина. Переважні приклади еукаріотичних клітин включають в себе клітини тварин, такі як встановлені лінії клітин ссавців, і лінії клітин комах, а також міцеліальних грибних клітин і дріжджових клітин. Переважні приклади прокаріотичних клітин включають в себе бактеріальні клітини, такі як клітини Е. coli. Антитіло, що використовується в даному винаході, переважно експресують з використанням клітин ссавців, таких як СНО, COS, клітини мієломи, ВНК, клітини Vero або HeLa. Потім, трансформовану клітину-хазяїна культивують in vitro або in vivo з одержанням антитіла-мішені. Культивування клітини-хазяїна проводять відповідно до відомого способу, з використанням як культурального середовища, наприклад, DMEM МЕМ, RPMI640 або IMDM. Комплемент сироватки, такий як фетальна теляча сироватка (ФТС), може бути використаний разом з цим культуральним середовищем. Антитіло, експресоване і одержане, як описано вище, може бути очищене з використанням одного відомого способу або комбінації відомих способів, що зазвичай використовується в очищенні білків. Наприклад, це антитіло може бути виділене і очищене за допомогою вибору і об'єднання відповідним чином афінної колонки, такої як Білок А-колонка, ультрафільтрації, висолювання, діалізу і т.п. (Antibodies: А Labaratory Manual; Ed Harlow, David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)). 16 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла, що мають модифіковані цукрові ланцюги, також можуть переважно використовуватися в цьому винаході. Відомо, що ADCC-активність антитіла може бути посилена модифікацією цукрового ланцюга цього антитіла, яка буде описана детально нижче. У випадках, коли експресія в клітинах раку легень антигену, з яким зв'язується це антитіло, є недостатньо високою для можливості сильного прояву ADCC-активності, використовують переважно антитіло, що має модифікований цукровий ланцюг. Відомі антитіла, в яких цукровий ланцюг був модифікований, включають в себе, наприклад, антитіла з модифікованим глікозилуванням (наприклад, WO 1999/54342), антитіла, з недостатністю фукози, доданою до цього цукрового ланцюга (наприклад, WO 2000/061739, WO 2002/031140), і антитіла, що мають цукровий ланцюг з GlcNAc (N-ацетилглюкозаміном), що ділить навпіл (наприклад, WO 2002/079255). Зв'язування антитіла з його мішенню (тобто антигеном) може бути відповідним чином оцінене з використанням відомого способу. Конкретно, зв'язувальна активність антитіла з клітинами, що експресують антиген, може бути виміряна способами, описаними на сторінках 359-420 Antibodies: А Labaratory Manual; Ed Harlow, David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), на основі ELISA і FACS (активованого флуоресценцією сортингу клітин), з використанням цих клітин як антигену. У форматі ELISA, зв'язувальну активність антитіла відносно клітини кількісно визначають порівнянням рівнів сигналу, що генерується ферментною реакцією. Конкретно, антитіло, що тестується, додають в планшет ELISA, на якому були іммобілізовані антигенекспресуючі клітини, і антитіло, зв'язане з цими клітинами, детектують з використанням міченого ферментом вторинного антитіла, здатного впізнавати антитіло, що тестується. Альтернативно, зв'язувальна активність антитіла відносно клітини може порівнюватися в FACS, де готують серію розведення антитіла, що тестується, і визначають титр зв'язування антитіла з антигенекспресуючими клітинами. У форматі FACS, зв'язування між антитілом і антигеном, що експресується на поверхні клітин, вимірюють в суспензії, замість використання клітин, зв'язаних з носієм, таким як планшет ELISA. Проточні цитометри, що використовуються в форматі FACS, включають в себе FACSCanto II, FACSAria, FACSArray, FACSVantage SE і FACSCalibur (всі вони доступні з BD Biosciences); а також EPICS ALTRA HyPErSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICS XL ADC і Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (всі вони доступні з Beckman Coulter). В одному переважному способі вимірювання зв'язувальної активності тест-антитіла з антигеном, тест-антитіло реагує з антигенекспресуючими клітинами, забарвленими FITCміченим вторинним антитілом, здатним впізнавати це тест-антитіло, і потім зв'язувальну активність вимірюють за допомогою FACSCalibur (BD) і інтенсивність флуоресценції аналізують з використанням програмного забезпечення CELL QUEST Software (BD). Цей спосіб дозволяє оцінювати зв'язувальну активність тест-антитіла порівнянням величини геометричного середнього, одержаного з використанням тест-антитіла (тест-величини Geo-Mean), з контрольною величиною GeoMean, одержаною з використанням контрольного антитіла. Формула для розрахунку цієї величини Geo-Mean (геометричного середнього) описана в CELL QUEST Software User's Guide (BD Biosciences). Антитіло, здатне зв'язуватися з епітопом, з яким здатне зв'язуватися антитіло GC33, може бути вигідним чином використане як антитіло в даному винаході. Зв'язувальна здатність антитіла цього винаходу відносно цього епітопу може бути тестована вищезазначеним способом FACS або ELISA. Для тестування, чи зв'язується це тест-антитіло з тим самим епітопом, що і епітоп, з яким зв'язується антитіло GC33, тобто чи має воно загальний епітоп з антитілом GC33, може бути аналізована конкуренція між цими двома антитілами за один і той самий епітоп. У даному винаході, конкуренція між антитілами може бути визначена, наприклад, за допомогою FACS або аналізу перехресного блокування. У FACS, спочатку антитіло GC33 зв'язують з GPC3-експресуючими клітинами і вимірюють сигнал флуоресценції. Потім, взаємодіє кандидатне конкуруюче антитіло, потім антитіло GC33 взаємодіє з тими самими клітинами і сигнал аналізують схожим чином за допомогою FACS. Альтернативно, антитіло GC33 і конкуруюче антитіло, що підлягає тестуванню, може конкурентно реагувати з одними і тими клітинами. Якщо картина FACS-аналізу на антитіло GC33 змінюється в присутності конкуруючого антитіла, вважається, що це конкуруюче антитіло впізнає той самий епітоп, що і антитіло GC33. Аналіз перехресного блокування може проводитися згідно зі способом, описаним конкретно тут, або способом, відомим в даній галузі, наприклад, описаним в "Antibodies: А Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow and David Lane (1988). Наприклад, конкурентний ELISA-аналіз є переважно аналізом перехресного блокування. В аналізі перехресного блокування, клітини, що експресують білок GC33, іммобілізують на ямку мікропланшета, передінкубують в присутності або за відсутності кандидатного конкуруючого 17 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла, потім до ямКі додають антитіло GC33. Кількість антитіла GC33, яка зв'язується з експресуючими білок GC33 клітинами в цій ямці, зворотно корелює зі зв'язуючою здатністю кандидатного конкуруючого антитіла (тест-антитіла), яке конкурує за зв'язування з тим самим епітопом. Тобто, чим більше афінність антитіла, що тестується відносно того ж самого епітопу, тим нижча кількість антитіла GC33, яке зв'язується з ямками, в яких іммобілізовані експресуючі білок GPC3 клітини. Або, навпаки, чим більше афінність антитіла, що тестується відносно того ж самого епітопу, тим вища кількість тесту-антитіла, яке зв'язується з ямками, в яких іммобілізовані експресуючі білок GPC3 клітини. Кількість антитіла, яке зв'язується з ямками, може бути легко виміряна за допомогою попереднього мічення цього антитіла. Наприклад, біотин-мічене антитіло може бути виміряне з використанням кон'югату авідин-пероксидаза і відповідного субстрату. Зокрема, аналізи перехресного блокування, які використовують мічення ферменту пероксидазою або т.п., називають "конкурентними аналізами ELISA". Це антитіло може бути відповідним чином помічене іншою речовиною, що мітить, яка може бути детектована або виміряна, наприклад, радіоактивним міченням і флуоресцентним міченням. Крім того, у випадках, коли тест-антитіло має константну ділянку, що походить з іншого виду, ніж антитіло GC33, антитіло, зв'язане з ямками, може бути виміряне з використанням міченого антитіла, що специфічно впізнає константну ділянку, що походить з цього виду. Коли цим антитілом є антитіло, що походить з того самого виду, але з іншого класу, антитіло, зв'язане з ямками, може бути придатним чином виміряне з використанням міченого антитіла, що специфічно розрізняє ці відповідні класи. При порівнянні зі зв'язувальною активністю, одержаною в контрольному тесті, проведеному під час відсутності кандидатного конкуруючого антитіла, коли це кандидатне антитіло здатне блокувати щонайменше 20 %, переважно щонайменше 20-50 % і більш переважно щонайменше 50 %, зв'язування антитілом GC33, це кандидатне конкуруюче антитіло є антитілом, що зв'язується власне кажучи з тим самим епітопом, що й антитіло GC33, або конкурує за зв'язування з тим самим епітопом. Антитіло, що зв'язується власне кажучи з тим самим епітопом, що й антитіло GC33, може бути відібране загальноприйнятим способом за допомогою аналізу перехресного блокування, як описано вище, або за допомогою інших способів. Переважні приклади можуть містити в собі, але не обмежуються ними: антитіло, яке містить варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:6, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в будь-якій з SEQ ID NO:9-23, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; антитіло, що містить варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:26, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:28, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25; і антитіло, що містить варіабельну ділянку Н-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:5, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:30, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:7; і варіабельну ділянку L-ланцюга, що містить CDR1, 2 і 3 з: CDR1, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:32, CDR2, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:24, і CDR3, що містить амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO:25. Фіг. 8 і 9 показують амінокислотну послідовність варіабельних ділянок Н-ланцюга і L-ланцюга і CDR зразкових гуманізованих антитіл, що можуть бути переважно використані в даному винаході. Антитіло, використовуване в даному винаході, має цитотоксичність. У даному контексті, "цитотоксичність" означає, що це антитіло має активність, що викликає пошкодження клітинмішеней, що експресують відповідний антиген. Коли комплекс антиген-антитіло не інтерналізується в межах клітини внаслідок природи цього антигену, переважні приклади цитотоксичності, що виявляється цим антитілом, містять у собі антитілозалежну клітинну цитотоксичність ("ADCC-активність") і комплементзалежну клітинну цитотоксичність ("CDC 18 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активність). З іншого боку, коли комплекс антиген-антитіло інтерналізується в межах клітини внаслідок природи цього антигену, можуть бути переважно використані кон'юговане антитіло, що складається з антитіла і хіміотерапевтичного агента, радіоізотопу або токсичної речовини, приєднаної до цього антитіла. У такому випадку цитотоксичність цього антитіла вироблена з цитотоксичності, що виявляється цим хіміотерапевтичним агентом, приєднаним до цього кон'югованого антитіла. Можуть бути використані відомі способи для вимірювання, чи виявляє антитіло, використовуване в цьому винаході, ADCC-активність і чи виявляє воно CDC-активність (наприклад, Curerent Protocols in Immunology, Chapter 7: Immunologic studies in humans; ed., John E. Coligan et al. (John Wiley & Sons, Inc.; 1993)). Спочатку, проводять одержання ефекторних клітин, розчину комплементу і клітин-мішеней згідно з наступними процедурами. (1) Одержання ефекторних клітин Селезінку витягають з мишей CBA/N і клітини селезінки виділяють у середовищі RPMI1640 (Invitrogen). Ефекторні клітини можуть бути одержані промиванням виділених клітин селезінки в тому самому середовищі, що містить 10 % фетальну телячу сироватку (ФТС; HyClone), і 6 доведенням концентрації цих клітин до 510 /мл. (2) Одержання розчину комплементу Розчин комплементу може бути одержаний 10-кратним розведенням кролячого комплементу (Baby Rabbit Complement) (CEDARPLANE) середовищем (Invitrogen), що містить 10 % ФТС. (3) Одержання клітин-мішеней 51 Антигенекспресуючі клітини інкубують протягом 1 години при 37С в 0,2 мКі Cr-хроматі натрію (GE Healthcare Bio-Science) і середовищі DMEM, що містить 10 % ФТС, для радіоактивного мічення цих клітин-мішеней. Переважні приклади антигенекспресуючих клітин, що можуть бути використані в цьому винаході, містять у собі клітини, трансформовані геном, що кодує цей антиген, клітини первинного гепатоцелюлярного раку і клітини метастатичного гепатоцелюлярного раку. Після радіоактивного мічення, ці клітини промивають три рази 5 середовищем RPMI1640, що містить 10 % ФТС, і концентрацію цих клітин доводять до 210 клітин/мл для одержання клітин-мішеней. ADCC-активність і CDC-активність можуть бути вимірювані описаними нижче способами. При вимірюванні ADCC-активності клітини-мішені й антитіло за цим винаходом додають у 96ямковий U-донний планшет (Becton Dickinson) у кількості 50 мкл на кожну ямку, потім вони взаємодіють протягом 15 хвилин на льоді. Потім у ямку додають 100 мкл ефекторних клітин. Цей планшет інкубують протягом 4 годин у термостаті з діоксидом вуглецю. Кінцеву концентрацію антитіла встановлюють на 0 або 10 мкг/мл, хоча ця концентрація доводиться придатним чином на основі активності цього антитіла. Після інкубації, беруть 100 мкл супернатанту на ямку і радіоактивність вимірюють гамма-лічильником (COBRAII AUTO-GAMMA, Model D5005; Packard Instrument Company). Одержані величини радіоактивності можуть бути використані для розрахунку цитотоксичності (%) відповідно до формули (А-С)/(В-С)100, де А представляє радіоактивність (імп/хв) проби, В представляє радіоактивність (імп/хв) проби, до якої був доданий 1 % NP-40 (Nakalai Tesque), і С представляє радіоактивність (імп/хв) проби, що містить тільки клітини-мішені. При вимірюванні CDC-активності, клітини-мішені й антитіло за цим винаходом додають у 96ямковий плоскодонний планшет (Becton Dickinson) у кількостях 50 мкл кожного компонента на ямку, потім дають їм взаємодіяти протягом 15 хвилин на льоді. Потім у кожну ямку додають 100 мкл розчину комплементу. Планшет інкубують протягом 4 годин у термостаті з діоксидом вуглецю. Кінцеву концентрацію антитіла встановлюють на 0 або 3 мкг/мл, хоча ця концентрація доводиться придатним чином на основі активності цього антитіла. Після інкубації, беруть 100 мкл супернатанту на ямку і радіоактивність вимірюють гамма-лічильником. Цитотоксичність може бути розрахована таким саме способом, який використовується для вимірювання ADCCактивності. Цитотоксичність, що виявляється кон'югованим антитілом, може переважно оцінюватися вимірюванням цитотоксичності, що виявляється хіміотерапевтичним агентом, радіоізотопом або токсичною речовиною, приєднаними до цього кон'югата антитіла. При вимірюванні цитотоксичності, що виявляється хіміотерапевтичним агентом, радіоізотопом або токсичною речовиною, приєднаними до цього кон'югата антитіла, клітина-мішень і кон'юговане антитіло за даним винаходом додають у 96-ямковий плоскодонний планшет (Becton Dickinson) у кількості 50 мкл кожного на ямку і дають взаємодіяти протягом періоду 15 хвилин на льоді. Потім цей планшет інкубують протягом періоду 1-4 годин у термостаті з діоксидом вуглецю. Кінцеву 19 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 концентрацію антитіла встановлюють на 0 або 3 мкг/мл, хоча ця концентрація доводиться придатним чином на основі активності цього антитіла. Після інкубації, беруть 100 мкл супернатанту на ямку і радіоактивність вимірюють гамма-лічильником. Цитотоксичність може бути розрахована таким же способом, який використовується для вимірювання ADCCактивності. Ілюстративні приклади хіміотерапевтичних агентів, що можуть бути кон'юговані з антитілом цього винаходу і мають цитотоксичну дію, містять у собі: азарибін, анастрозол, азацитидин, блеоміцин, бортезомід, бріостатин-1, бусульфан, камптотецин, 10-гідроксикамптотецин, кармустин, целебрекс, хлорамбцил, цисплатин, іринотекан, карбоплатин, кладрибін, циклофосфамід, цитарабін, дакарбазин, доцетаксел, дактиноміцин, дауноміцину глюкуронід, даунорубіцин, дексаметазон, діетилстильбестрол, доксорубіцин, доксорубіцину глюкуронід, епірубіцин, етинилестрадіол, естрамустин, етопозид, етопозиду глюкуронід, флоксуридин, флударабін, флутамід, фторурацил, флуоксиместерон, гемцитабін, гідроксипрогестерону капроат, гідроксисечовину, ідарубіцин, іфосфамід, лейковорин, ломустин, меклоретамін, медроксипрогестерону ацетат, мегестролу ацетат, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, мітоксантрон, мітраміцин, мітоміцин, мітотан, фенілбутират, преднізон, прокарбазин, паклітаксел, пентостатин, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, таксани, таксол, тестостерону пропіонат, талідомід, тіогуанін, тіотепа, теніпозид, топотекан, урацилдихлордіетилсульфід (урациліприт), вінбластин, вінорелбін і вінкристин. У даному винаході, переважними хіміотерапевтичними агентами є низькомолекулярні хіміотерапевтичні агенти. Низькомолекулярні хіміотерапевтичні агенти все ще мають низьку імовірність втручання у функцію антитіла після кон'югації з цим антитілом. У даному винаході, цей низькомолекулярний хіміотерапевтичний агент зазвичай має молекулярну масу від 100 до 2000 і переважно від 200 до 1000. Вищезгадані хіміотерапевтичні агенти, усі, є низькомолекулярними хіміотерапевтичними агентами. Хіміотерапевтичні агенти, використовувані в даному винаході, містять у собі проліки, що перетворюються в тілі на активні хіміотерапевтичні агенти. Проліки можуть бути переважно активовані ферментативним перетворенням або неферментативним перетворенням. Крім того, це антитіло може бути переважно модифіковане з використанням токсинних пептидів, таких як рицин, абрин, рибонуклеаза, онконаза, ДНКаза I, ентеротоксин-А стафілокока, антивірусний білок фітолаки американської, гелонін, дифтерійний токсин, екзотоксин Pseudomonas, L-аспарагіназа і L-аспарагіназа ПЕГ. В іншому аспекті, один або два або більше низькомолекулярних хіміотерапевтичних агентів і токсичний пептид можуть бути об'єднані і використані для модифікації цього антитіла. Антитіло цього винаходу може бути кон'юговане з вищевказаним низькомолекулярним хіміотерапевтичним агентом за допомогою ковалентного зв'язку або нековалентного зв'язку. Способи одержання антитіл, кон'югованих з хіміотерапевтичним агентом, відомі в даній галузі. Крім того, білковий лікарський засіб або токсин може бути переважно кон'югований з цим антитілом способом генетичної інженерії. Конкретно, це може бути виконано злиттям ДНК, що кодує вищезгаданий токсичний пептид, із ДНК, що кодує антитіло цього винаходу, і експресією цієї злитої ДНК у придатній клітині-хазяїні. Антитіло, кон'юговане з токсичним пептидом, може бути переважно одержане у вигляді злитого білка. Злитий білок з цим антитілом зазвичай конструюють таким чином, що білковий лікарський засіб або токсин поміщають на С-кінцевій стороні цього антитіла. Між цим антитілом і білковим лікарським засобом або токсином може бути переважно інсертований пептидний лінкер. Фармацевтична композиція Даний винахід забезпечує фармацевтичну композицію для ефективного лікування або попередження раку печінки, що містить комбінацію хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3антитіла, а також ефективний спосіб лікування раку печінки з використанням цієї фармацевтичної композиції. В іншому аспекті, цей винахід забезпечує спосіб застосування цього анти-гліпікан 3-антитіла для посилення терапевтичних дій хіміотерапевтичного агентав лікуванні пацієнта з раком печінки цим хіміотерапевтичним агентом. У даному контексті, фраза "посилення терапевтичних дій" означає, що швидкість реакції поліпшується, кількість хіміотерапевтичного агента для лікування зменшується і/або період лікування цим хіміотерапевтичним агентом скорочується. Ще в одному аспекті, цей винахід забезпечує спосіб застосування анти-гліпікан 3-антитіла для приготування фармацевтичної композиції для лікування або попередження раку печінки, причому ця композиція містить хіміотерапевтичний агент і анти-гліпікан 3-антитіло як активні інгредієнти. Крім того, цей винахід забезпечує спосіб лікування або попередження пацієнтів з раком печінки, що використовує хіміотерапевтичний агент і анти-гліпікан 3-антитіло. 20 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному винаході, фраза "містять хіміотерапевтичний агент і/або анти-гліпікан 3-антитіло як активний інгредієнт" означає вміст хіміотерапевтичного агента і/або анти-гліпікан 3-антитіла як головного активного інгредієнта, хоча вміст цього хіміотерапевтичного агента і/або цього антигліпікан 3-антитіла конкретно не обмежується. Термін "лікування" означає, що за допомогою введення фармацевтичної композиції цього винаходу суб'єкту клітини раку печінки руйнуються або кількість таких клітин зменшується, ріст клітин раку печінки пригнічується або різні симптоми, викликувані раком печінки, послабляються. Термін "попередження" означає запобігання збільшення кількості клітин раку печінки внаслідок рецидиву пухлини або запобігання рецидиву клітин раку печінки, ріст яких був пригнічений. Терапевтичне антитіло цього винаходу може вводитися перорально або парентерально. Особливо переважним є парентеральне введення. Ілюстративні приклади таких способів введення містять у собі введення ін'єкцією, назальне введення, легеневе введення і черезшкірне введення. Приклади введення ін'єкцією містять у собі внутрішньовенну ін'єкцію, внутрішньом'язову ін'єкцію, внутрішньочеревинну ін'єкцію і підшкірну ін'єкцію, де терапевтичне антитіло цього винаходу може вводитися системно або локально (місцево). Спосіб введення може бути вибраний придатним чином відповідно до віку і конкретних симптомів пацієнта. Ця доза може бути вибрана з діапазону від 0,0001 мг до 1000 мг на кілограм маси тіла на уніфіковану (стандартну) дозу. Альтернативно, доза терапевтичного антитіла цього винаходу не обмежується вищезгаданими дозами. Об'єднане застосування хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3-антитіла в цьому винаході означає, що цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3-антитіло вводять або використовують (що називають колективно нижче терміном "вводять") разом; і ця фраза не повинна інтерпретуватися як обмежуючий порядок введення, інтервал введення доз і т.п. Крім того, ці хіміотерапевтичний агент і анти-гліпікан 3-антитіло цього винаходу можуть бути використані у вигляді набору, що містить обидва інгредієнти. Відповідно до цього винаходу, цей хіміотерапевтичний агент і це анти-гліпікан 3-антитіло можуть використовуватися в комбінації, якщо бажано, при більш низьких дозах, ніж дози кожного при роздільному застосуванні. Порядок введення хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3-антитіла цього винаходу може містити в собі: перше введення анти-гліпікан 3-антитіла, потім введення хіміотерапевтичного агента; введення хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3-антитіла одночасно або перше введення хіміотерапевтичного агента, потім введення анти-гліпікан 3антитіла. У випадках роздільного введення хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3-антитіла інтервал дозування доз хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3-антитіла може бути вибраний з урахуванням факторів, що включають у себе спосіб введення і лікарську форму. Наприклад, інтервал введення доз дорівнює зазвичай 0-168 годин, переважно 0-72 годин, більш переважно 0-24 годин і навіть більш переважно 0-12 годин. Поряд з такими факторами, як спосіб введення і лікарська форма, можуть також враховуватися залишкові концентрації в суб'єкті хіміотерапевтичного агента й анти-гліпікан 3-антитіла цього винаходу. У випадках, коли хіміотерапевтичний агент вводять перед введенням анти-гліпікан 3-антитіла, може вводитися анти-гліпікан 3-антитіло, у той час як залишкова концентрація хіміотерапевтичного агента є достатньою для одержання бажаного ефекту анти-гліпікан 3-антитіла. Ця концентрація може бути визначена взяттям проби від суб'єкта й аналізом цієї проби будь-якими способами, відомими особам зі звичайною кваліфікацією в даній галузі, з використанням розділювального приладу, такого як будь-які типи хроматографів. Навпаки, у випадках, коли анти-гліпікан 3-антитіло вводять перед введенням хіміотерапевтичного агента, може вводитися хіміотерапевтичний агент, у той час як залишкова концентрація в суб'єкті анти-гліпікан 3-антитіла є достатньою для одержання бажаного ефекту хіміотерапевтичного агента. Ця концентрація може бути визначена взяттям проби від суб'єкта й аналізом цієї проби імунологічним вимірюванням, відомим особам зі звичайною кваліфікацією в даній галузі, таким як спосіб ELISA, описаний нижче. Терапевтичне антитіло цього винаходу може бути одержане відповідно до загальноприйнятого способу (див., наприклад, саме останнє видання Rеміngtоn's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton, USA), і воно може також містити в собі фармацевтично прийнятні носій і добавку. Приклади добавок, що можуть бути використані, містять у собі, але не обмежуються ними, поверхнево-активні речовини, ексципієнти, барвники, ароматичні агенти, консерванти, стабілізатори, буфери, суспензії, агенти тонічності, зв'язувальні агенти, дезінтрегрувальні агенти, мастильні речовини, інтенсифікатори плинності і поліпшуючі смак агенти. Крім того, можуть бути також використані придатним чином загальноприйняті носії. Ілюстративні приклади таких носіїв містять у собі осаджений діоксид кремнію, лактозу, 21 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кристалічну целюлозу, маніт, крохмаль, кальцій-кармелозу, натрій-кармелозу, гідроксипропілцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, полівінілацеталю діетиламіноацетат, полівінілпіролідон, желатин, тригліцериди жирних кислот із середнім ланцюгом, поліоксіетиленотверджену рицинову олію 60, білий цукор (сахарин-пісок), карбоксиметилцелюлозу, кукурудзяний крохмаль і неорганічні солі. Повні змісти всіх патентів і посилань, цитованих у цьому описі, включені тут як посилання в їхньому повному обсязі. Даний винахід описаний докладно в наступних прикладах, що є тільки ілюстративними і не повинні розумітися як обмежуючі цей винахід. Приклади Приклад 1 Ефекти об'єднаного застосування анти-гліпікан 3-антитіла і хіміотерапевтичного агента (мітоксантрону або гідрохлориду доксорубіцину) у мишачих моделях, імплантованих експресуючою гліпікан 3 клітинною лінією раку печінки людини (1) Клітинна лінія Як експресуючі гліпікан 3 клітинні лінії раку печінки людини використовували клітини HuH-7 (Human Science Research Resource Bank) і клітини Hep2 (ATCC). Клітини HuH-7 підтримували і субкультивували в модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла (Sigma), що містить 10 % ФТС (BIONET), і клітини Hep2 підтримували і субкультивували в Мінімальному Есенцільному середовищі Ігла (Sigma), що містить 10 % ФТС, 1 ммоль/л МЕМ піруват натрію (Invitrogen) і 1 ммоль/л МЕМ замінної амінокислоти (Invitrogen). (2) Одержання мишачих моделей, імплантованих клітинами раку печінки людини 7 Кожен тип клітин одержували при кількості клітин 5 × 10 на мілілітр розчину, що містить рівні кількості середовища субкультивування і матриксу MATRIGEL (BD Science). Потім, 100 мкл 6 (тобто 510 клітин на мишу) цієї клітинної суспензії імплантували підшкірно в ділянці живота мишей SCID (п'ятитижневих самців; CLEA Japan, Inc.), яким, за день до імплантації клітин, внутрішньочеревинно вводили 100 мкл анти-асіало GM1-антитіла (Wako Pure Chemical Industrts, Ltd.; розчиненого в 5 мл рідині в одному флаконі). Вважали, що ці моделі були встановлені, коли, при розрахунку обсягу пухлини за наступною формулою, середній обсяг пухлини ставав 3 рівним 237-298 мм : Обсяг пухлини = велика вісь  мала вісь  мала вісь/2 (3) Приготування антитіла і хіміотерапевтичного агента Мишаче моноклональне анти-гліпікан 3 людини-антитіло (назва клону: GC33; описане в WO 2006/006693) готували в концентрації 0,5 мг/мл (група 5 мг/кг) і 0,1 мг/мл (група 1 мг/кг) з використанням PBS(-). Гідрохлорид доксорубіцину (Adriacin Injection, доступний з Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.) розчиняли при концентрації 10 мг/мл у дистильованій воді для ін'єкції (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.), потім розводили до концентрації 0,5 мг/мл з використанням PBS(-). Гідрохлорид мітоксантрону (Novantrone Injection; доступний з Wyeth) розчиняли при 10 мг/мл у фізіологічному сольовому розчині (Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.), потім розводили до концентрації 0,1 мг/мл з використанням PBS(-). (4) Введення хіміотерапевтичного агента В імплантованій раком печінки людини мишачій моделі, створеній в (2) вище, дози 10 мл/кг проби цього антитіла, приготовленої в (3) вище, вводили через хвостову (каудальну) вену один раз на тиждень протягом періоду трьох тижнів, починаючи в день 11 після імплантації для моделі ксенотрансплантата клітин HuH-7 і починаючи в день 20 після імплантації для моделі ксенотрансплантата клітин Hep2. Як негативний контроль дози 10 мл/кг відфільтрованого стерилізованого PBS(-) (носія) вводили подібним чином один раз на тиждень протягом періоду трьох тижнів через хвостову вену. Модель ксенотрансплантата клітин HuH-7 одержувала єдину дозу 10 мл/кг, у день 10 після імплантації, гідрохлориду доксорубіцину (DOX), приготовленого в (3) вище, або PBS(-) як негативного контролю, причому кожна доза вводилася через хвостову вену. Модель ксенотрансплантата клітин Hep2 одержувала єдину дозу 10 мл/кг на тиждень протягом періоду трьох тижнів, починаючи в день 20 після імплантації, гідрохлориду мітоксантрону (МХ), приготовленого в (3) вище, або PBS(-) як негативного контролю, причому кожна доза вводилася через хвостову вену. Кожна група складалася з 6 тварин. Подробиці, що стосуються введення цих хіміотерапевтичних агентів, показані в таблицях 1 і 2. 22 UA 103614 C2 Таблиця 1 Модель ксенотрансплантата HuH-7 Група Кількість тварин Лікарський засіб Доза (мг/кг) Спосіб введення PBS(-) PBS(-) 1 хвостова вена хвостова вена 6 GC33 2 хвостова вена 5 6 PBS(-) PBS(-) 3 хвостова вена хвостова вена 6 DOX 4 6 5 хвостова вена GC33 5 хвостова вена Дні введення дні 10, 17, імплантації день 10 імплантації день 10, 17, імплантації день 10 імплантації день 10, 17, імплантації день 10 імплантації дні 10, 17, імплантації 24 після після 24 після після 24 після після 24 після Таблиця 2 Модель ксенотрансплантата Hep2 Група Кількість тварин Лікарський засіб Доза (мг/кг) Спосіб введення PBS(-) PBS(-) 1 хвостова вена хвостова вена 6 GC33 2 хвостова вена 1 6 PBS(-) PBS(-) 3 хвостова вена хвостова вена 6 МX 10 15 1 хвостова вена МX 5 хвостова вена GC33 4 1 1 хвостова вена 6 Дні введення дні 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації день 20, 27, імплантації 34 після 34 після 34 після 34 після 34 після 34 після 34 після 34 після (5) Оцінювання протипухлинного ефекту Протипухлинні ефекти комбінації антитіла GC33 і хіміотерапевтичного агента в мишачих моделях імплантації раку печінки людини оцінювали на основі обсягу пухлини через один тиждень після кінцевого введення. Статистичний аналіз проводили за допомогою t-критерію з використанням обсягів пухлин у кінцевий день вимірювання. Для статистичного аналізу використовували SAS Preclinical Package (SAS Institute, Inc.). Ці результати показані на фіг. 1. Фіг. 1 є графіком, що показує зміну обсягу пухлини при введенні антитіла GC33 і доксорубіцину (DOX) разом у мишачу модель, імплантовану клітинами клітинної лінії HuH-7 раку печінки людини. Ромби вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала носій. Кружки вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки антитіло GC33. Трикутники вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки доксорубіцин (DOX). Зірочки вказують зміну обсягу пухлини в групі, в якій антитіло GC33 і доксрубіцин (DOX) вводили разом. Фіг. 1В є графіком, що показує зміну обсягу пухлини при введенні антитіла GC33 і доксорубіцину (DOX) разом у мишачу модель, імплантовану клітинною лінією Hep2. Ромби вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала носій. Кружки вказують зміну обсягу пухлини в групі, що 23 UA 103614 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержувала тільки антитіло GC33. Трикутники вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки мітоксантрон (МХ). Зірочки вказують зміну обсягу пухлини в групі, в якій антитіло GC33 і мітоксатрон (МХ) вводили разом. Як видно з фіг. 1, у порівнянні з ростом пухлини в групі, що одержувала тільки GC33, ріст пухлини в групах, що одержували комбінацію GC33 і доксорубіцину (DOX, фіг. 1А) або мітоксатрону (МХ, фіг. 1В), був значно пригнічений. Приклад 2 Ефекти об'єднаного застосування анти-гліпікан 3-антитіла і хіміотерапевтичного агента (Сорафенібу) у мишачих моделях, імплантованих експресуючою гліпікан 3 клітинною лінією раку печінки людини Шеститижневих самців мишей СВ-17 SCID купували з CLEA Japan, Inc. Перед імплантацією пухлини, мишам вводили внутрішньочеревинно 200 мкг анти-асіало-GM-антитіло (WAKO). 5 Клітини Hep2 або клітини HuH-7 (510 клітин), дисперговані в 50 % Матригелі (Becton 3 Dickinson), імплантували підшкірно. При досягненні обсягу пухлини 250 мм , цих мишей поділяли на групи і починали введення. Гуманізоване анти-гліпікан 3-антитіло (GC33, WO 2006/006693) готували в придатній концентрації в PBS(-) і вводили внутрішньовенно згідно зі способом, описаним у Organic Research & Development 6, 777-781 (2002), і суспендували в чистій воді, що містить 10 % етанол і 10 % Кремофор EL, і вводили перорально 5 разів на тиждень протягом 3 тижнів. Як контроль-носій служила чиста вода, що містить PBS(-), 10 % 3 етанол і 10 % Кремофор EL. Обсяг пухлини (мм ) розраховували з використанням формули, описаної в прикладі 1. Ці результати показані на фіг. 2-4. Фіг. 2 є графіком, що показує протипухлинні ефекти антитіла hGC33 і Сорафенібу на мишачій моделі, імплантованій клітинами клітинної лінії HuH-7 раку печінки людини, показані зміною обсягу пухлини (середнє + стандартне відхилення). Білі кружки вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала носій. Суцільні кружки вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки антитіло hGC33 у дозі 5 мг/кг. Білі квадрати вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки Сорафеніб у дозі 80 мг/кг. Суцільні квадрати вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала комбінацію антитіла hGC33 у дозі 5 мг/кг і Сорафенібу в дозі 80 мг/кг. Фіг. 3 є графіком, що показує протипухлинні ефекти антитіла hGC33 і Сорафенібу на мишачій моделі, імплантованій клітинами клітинної лінії Hep2 раку печінки людини, показані зміною обсягу пухлини (середнє + стандартне відхилення). Білі кружки вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала носій. Суцільні кружки вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки антитіло hGC33 у дозі 5 мг/кг. Білі квадрати вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки Сорафеніб у дозі 80 мг/кг. Суцільні квадрати вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала комбінацію антитіла hGC33 у дозі 5 мг/кг і Сорафенібу в дозі 80 мг/кг. Фіг. 4 є графіком, що показує дію антитіла hGC33 і Сорафенібу на втрату маси тіла в мишачій моделі, імплантованій клітинами клітинної лінії Hep2 раку печінки людини, показані зміною маси цієї моделі (середнє + стандартне відхилення). Білі кружки вказують зміну маси тіла в групі, що одержувала носій. Суцільні кружки вказують зміну маси тіла в групі, що одержувала тільки антитіло hGC33 у дозі 5 мг/кг. Білі квадрати вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала тільки Сорафеніб у дозі 80 мг/кг. Суцільні квадрати вказують зміну обсягу пухлини в групі, що одержувала комбінацію антитіла hGC33 у дозі 5 мг/кг і Сорафенібу в дозі 80 мг/кг. Зірочки на цих фігурах указують Р