Антитіло, яке специфічно зв’язує людський tyrp1

Реферат: UA 99339 C2 (12) UA 99339 C2 Винахід належить до моноклонального антитіла, яке специфічно зв’язує людський тирозиназазв’язаний білок 1-го типу TYRP1, ізольованої полінуклеїнової кислоти, вектору, клітини-хазяїна та фармацевтичної композиції для застосування як лікарського засобу для лікування раку. UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання Ця заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою на патент США № 61/069199, поданої 12 березня 2008 року. Галузь, до якої належить винахід Цей винахід стосується людських та гібридних антитіл, у тому числі їх фрагментів або частин, які є специфічними по відношенню до людського тирозиназа-зв’язаного білку 1-го типу (TYRP1). Згадані антитіла застосовують для лікування росту ракових клітин, і вони можуть бути застосованими окремо або у комбінації з протипухлинним засобом або лікарським засобом. Передумови створення винаходу Людський тирозиназа-зв’язаний білок 1-го типу (TYRP1), відомий також як gp75 (WO 91/14775) (послідовність SEQ ID NO: 28), являє собою глікопротеїн меланосомної мембрани, залучений до біосинтезу меланіну. Згаданий білок знаходять, головним чином, всередині меланосом меланоцитів, а також його знаходять експресованим на клітинній поверхні меланоцитів та людських меланом. Антиген TYRP1 є високоімуногенним. У пацієнтів, хворих на меланому, були ідентифіковані антитіла та T-клітини проти TYRP1. Виявляється, що як клітинна імунна відповідь, так і гуморальна імунна відповідь є ефективними щодо ліквідації меланоми in vivo. Зворотний розвиток пухлин також є наслідком адаптивного перенесення меланома-реактивних T-клітин. Гуморальна імунна відповідь, спричинена застосуванням вакцини проти TYRP1, також може пригнічувати ріст та метастазування меланом у тварин. Незважаючи на проведені на цей час дослідження різних варіантів лікування меланоми, у тому числі застосування дрібномолекулярних інгібіторів, хіміотерапевтичних засобів, імунотерапевтичних засобів, у тому числі вакцин (дивись, наприклад, патент США № 6,168,946), генної терапії/імуностимуляторів та антиангіогенних засобів, ефективного лікування для пацієнтів, хворих на меланому, не існує. Вкрай необхідною є розробка нових способів лікування для цієї незадоволеної медичної потреби. Результатом досліджень на тваринах виявилось відкриття антитіла TA99. TA99 (IgG2a), мишаче моноклональне антитіло (MAb), специфічне до людського та мишачого TYRP1, локалізується in vivo на підшкірній людській меланомі. Дивись Welt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4200-4204 (1987) та патент США № 4,798,790. Лікування антитілом TA99 пригнічує ріст та метастазування пухлин у мишей. Дивись Takechi et al., Clin Cancer Res. 2:1837-42 (1996). Миші, яких лікують за допомогою TA99, часто втрачають забарвлення волосся (тобто у них спостерігається депігментація), що наводить на думку про руйнування меланоцитів у шкірі. Виявляється, що опосередкована Fc-рецепторами активація ефекторів відіграє критичну роль у ліквідації клітин, на які спрямоване антитіло TA99. У мишей з блокованими Fc-рецепторами була різко зменшена протипухлинна дія антитіла TA99. Дивись Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Однак мишача природа TA99 означає, що слід запобігати його застосуванню як лікарського засобу для лікування людей унаслідок можливих проблем з імуногенністю, і, крім того, це означає, що здатність цього антитіла до активації імунних ефекторних функцій у прямому напрямку буде обмеженою. Таким чином, існує потреба у наданні альтернативних антитіл проти TYRP1, які є ефективними при лікуванні меланоми. Цей винахід пропонує альтернативні антитіла проти TYRP1, які є ефективними при лікуванні меланоми. Крім того, існує потреба у наданні альтернативних антитіл проти TYRP1, які мають поліпшену зв’язувальну спорідненість до TYRP1, порівняно з антитілами, відомими у цій галузі. Цей винахід пропонує альтернативні антитіла проти TYRP1, які мають поліпшену зв’язувальну спорідненість до TYRP1, порівняно з антитілами, відомими у цій галузі. Крім того, існує потреба у наданні альтернативних антитіл проти TYRP1, які мають зменшену імуногенність у людей та поліпшену здатність до активації імунних ефекторних функцій у прямому напрямку, таких як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (ADCC). Цей винахід пропонує гібридні та людські антитіла проти TYRP1, які мають зменшену імуногенність у людей та поліпшену здатність до активації імунних ефекторних функцій у прямому напрямку, таких як антитілозалежна клітинна цитотоксичність (ADCC), порівняно з антитілами, відомими у цій галузі. Залишається також потреба у наданні альтернативних антитіл проти TYRP1, які мають поліпшену стійкість завдяки зменшенню ступеня помилкового укладання та неправильного процесингу. Антитіла за цим винаходом, яким віддають перевагу, мають поліпшену стійкість завдяки зменшенню ступеня помилкового укладання та неправильного процесингу. Короткий виклад суті винаходу Цей винахід стосується людських та гібридних моноклональних антитіл та їх фрагментів, які 1 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв’язуються з меланомним антигеном TYRP1 (послідовність SEQ ID NO: 28). Одним із варіантів здійснення цього винаходу є моноклональне антитіло, яке специфічно зв’язує людський TYRP1 з константою дисоціації KD при температурі навколишнього -9 -9 лабораторного середовищa (20-25C), у межах від 0,110 M до 1,610 M, де згадані значення KD визначають за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. У інших варіантах здійснення цього винаходу згадане моноклональне антитіло є гібридним або людським. Фрагменти таких антитіл, де згадані фрагменти зберігають здатність до специфічного зв’язування людського TYRP1, є частиною цього винаходу, незважаючи навіть на те, що константи дисоціації для таких фрагментів не входять у згаданий діапазон. У інших варіантах здійснення цього винаходу згадане моноклональне антитіло специфічно -9 -9 зв’язує людський TYRP1 з KD від приблизно 0,110 M до приблизно 1,210 M, від приблизно -9 -9 -9 -9 0,110 M до приблизно 0,810 M, від приблизно 0,110 M до приблизно 0,410 M, від -9 -9 -9 приблизно 0,210 M до приблизно 1,210 M, від приблизно 0,210 M до приблизно 0,810 9 -9 -9 -9 M, від приблизно 0,210 M до приблизно 0,410 M, від приблизно 0,210 M до приблизно -9 -9 0,310 M або приблизно 0,2810 M. Одним із варіантів здійснення цього винаходу є антитіло або його фрагмент, який зв’язує TYRP1, що містить CDRH1, що має послідовність GYTFTSYAMN (послідовність SEQ ID NO: 1), CDRH2, що має послідовність WINTNTGNPTYAQGFTG (послідовність SEQ ID NO: 2), CDRH3, що має послідовність RYSSSWYLDY (послідовність SEQ ID NO: 3), CDRL1, що має послідовність RASQSVSSYLA (послідовність SEQ ID NO: 4), CDRL2, що має послідовність DASNRAT (послідовність SEQ ID NO: 5), та CDRL3, що має послідовність QQRSNWLMYT (послідовність SEQ ID NO: 6), де згадане антитіло, крім того, містить амінокислотну заміну у межах однієї із згаданих послідовностей CDR. У інших варіантах здійснення вищезгадані гіперваріабельні ділянки (CDR) не мають амінокислотної заміни у одній з послідовностей CDR. За ще іншим варіантом здійснення згадане антитіло, яке має вищезгадані CDR, специфічно зв’язує людський TYRP1 з константою дисоціації KD у межах від 0,1(10-9 M до 1,6(10-9 M. У іншому варіанті здійснення цього винаходу згадане антитіло або його фрагмент, який специфічно зв’язує TYRP1, містить CDRH1, що має послідовність GFNIKDYFLH (послідовність SEQ ID NO: 7), CDRH2, що має послідовність WINPDNGNTVYDPKFQG (послідовність SEQ ID NO: 8), CDRH3, що має послідовність DYTYEKAALDY (послідовність SEQ ID NO: 9), CDRL1, що має послідовність RASGNIYNYLA (послідовність SEQ ID NO: 10), CDRL2, що має послідовність DAKTLAD (послідовність SEQ ID NO: 11), та CDRL3, що має послідовність QHFWSLPFT (послідовність SEQ ID NO: 12), додатково містить амінокислотну заміну у межах однієї зі згаданих послідовностей CDR. У іншому варіанті здійснення вищезгадані CDR (послідовності SEQ ID NO: 7-12) не мають жодних амінокислотних замін. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є антитіло або його фрагмент, який зв’язує TYRP1 і містить VL, що має послідовність: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGS GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWLMYTFGQGTKLEIK (послідовність SEQ ID NO: 16), та VH, що має послідовність: QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLECMGWINTNTGNPTYAQG FTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRYSSSWYLDYWGQGTLVTVSS (послідовність SEQ ID NO: 13) або QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLESMGWINTNTGNPTYAQG FTGRFVFSMDTSVSTAYLQISSLKAEDTAIYYCAPRYSSSWYLDYWGQGTLVTVSS (послідовність SEQ ID NO: 14). Іншим варіантом здійснення цього винаходу є моноклональне антитіло, яке містить важкий ланцюг (послідовність SEQ ID NO: 29) та легкий ланцюг (послідовність SEQ ID NO: 32) або важкий ланцюг (послідовність SEQ ID NO: 30) та легкий ланцюг (послідовність SEQ ID NO: 32). У одному із варіантів здійснення антитіло містить два важкі ланцюги (послідовність SEQ ID NO: 29) і два легкі ланцюги (послідовність SEQ ID NO: 32) або містить два важкі ланцюги (послідовність SEQ ID NO: 30) та два легкі ланцюги (послідовність SEQ ID NO: 32). TYRP1зв’язувальні фрагменти таких антитіл є частиною цього винаходу. Цей винахід стосується також ізольованих ДНК, які кодують такі антитіла та їх частини. Інші варіанти здійснення цього винаходу включають: ізольовану полінуклеїнову кислоту, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує згадане антитіло або його фрагмент; вектор експресії, який містить згадану нуклеотидну послідовність, зв’язану з експресійною послідовністю або рекомбінантною клітиною-хазяїном, яка містить згаданий вектор експресії або рекомбінантну клітину-хазяїна чи її потомство, де згадана клітина експресує згадане антитіло або його 2 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагмент. Ще іншим варіантом здійснення цього винаходу є спосіб продукування або очищення антитіла або його фрагмента, який включає культивування згаданих клітин при умовах, які надають можливість експресії згаданого антитіла або його фрагмента. Крім того, цей винахід спрямований на створення способів пригнічення росту ракової клітини та способів лікування меланоми шляхом введення ефективної кількості антитіла, причому згадані способи призначені для застосування на ссавцях. Одним із варіантів здійснення цього винаходу є застосування попередньо описаних антитіл або їх фрагментів як лікарського засобу. За ще іншим варіантом здійснення попередньо описані антитіла або їх фрагменти повинні бути застосовані для лікування раку, у тому числі (але без обмеження) злоякісної меланоми. У іншому варіанті здійснення цей винахід пропонує застосування антитіла за цим винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування раку. У варіанті здійснення, якому віддають перевагу, згаданим раком є злоякісна меланома. Згадані антитіла можуть бути застосовані окремо або у комбінації з протипухлинним засобом або лікарським засобом. Одним із варіантів здійснення цього винаходу є застосування попередньо описаних антитіл у комбінації з додатковим протипухлинним засобом або лікарським засобом. У ще іншому варіанті здійснення згаданим протипухлинним засобом є дакарбазин (dacarbazine). Докладний опис винаходу Цей винахід пропонує людські і гібридні антитіла та їх фрагменти, специфічні до антигену TYRP1, а також ізольовані або очищені полінуклеотидні послідовності, які кодують згадані антитіла. Антитіла за цим винаходом можуть бути застосовані для лікування неопластичних захворювань, у тому числі солідних та несолідних пухлин, та для лікування гіперпроліферативних розладів. Згаданий термін “антитіло” включає фрагменти, які зв’язують TYRP-1, якщо не зазначено інше. Параметри зв’язування у цьому випадку наведені для непроцесованих антитіл, а не для фрагментів, які обов’язково будуть мати інші параметри зв’язування внаслідок їх розміру, який відрізняється від розміру непроцесованих антитіл. Природні антитіла, як правило, мають два ідентичні важкі ланцюги і два ідентичні легкі ланцюги, де кожен легкий ланцюг є ковалентно зв’язаним з важким ланцюгом міжланцюговим дисульфідним зв’язком. Численні дисульфідні зв’язки також зв’язують два важкі ланцюги між собою. Термін “антитіло”, вжитий у цьому описі, охоплює імуноглобулінові молекули, які складаються з 4 поліпептидних ланцюгів, двох важких (H) ланцюгів і двох легких (L) ланцюгів, які взаємозв’язуються за допомогою дисульфідних зв’язків. Індивідуальні ланцюги можуть укладатись у домени, які мають однакові розміри (110-125 амінокислот) та однакові структури, але різні функції. Легкий ланцюг може містити одну варіабельну ділянку (скорочено позначену у цьому описі як VL) та/або одну константну ділянку (скорочено позначену у цьому описі як CL). Легкі ланцюги антитіл (імуноглобулінів) є або легкими ланцюгами типу каппа (K), або легкими ланцюгами типу лямбда (). Вжите у цьому описі скорочення VL охоплює варіабельні ділянки як легких ланцюгів типу каппа (VK), так і легких ланцюгів типу лямбда (V). Константна ділянка легкого ланцюга складається з одного домену і позначається CL. Важкий ланцюг може також містити одну варіабельну ділянку (скорочено позначену у цьому описі як VH) та/або, у залежності від класу або ізотипу антитіла, три або чотири константні ділянки (CH1, CH2, CH3 та CH4) (спільно скорочено позначені у цьому описі як CH). У людей згаданими ізотипами є IgA, IgD, IgE, IgG та IgM, де IgA та IgG, крім того, підрозділяються на підкласи або підтипи (IgA1-2 та IgG1-4). До обсягу цього винаходу включені антитіла будь-якого з вищезгаданих класів або підкласів (ізотипів). За варіантом, якому віддається перевага, ізотипом для антитіл за цим винаходом є людський IgG1. Як правило, варіабельні ділянки демонструють значну варіабельність амінокислотних послідовностей між антитілами, зокрема, у положенні антигензв’язувального центру антитіла. Кожна з VL та VH містить три ділянки, які називають гіперваріабельними ділянками або ділянками, які обумовлюють комплементарність (CDR), які підтримуються менш варіабельними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Амінокислоти конкретної гіперваріабельної ділянки або домену позначені за схемою нумерації, яка розроблена Кабатом (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). Кожна VH та VL складається з трьох гіперваріабельних ділянок (CDR) та чотирьох каркасних ділянок (FR), які у напрямку від аміно-кінця до карбоксильного кінця розміщуються у такому порядку: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Частина антитіла, яка складається з VL та VH, позначена як Fv (варіабельний фрагмент), являє собою антигензв’язувальний центр антитіла. Одноланцюговий Fv (scFv) являє собою 3 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагмент антитіла, який містить домен VL та домен VH на одному поліпептидному ланцюзі, де N-кінець одного домену та C-кінець другого домену з’єднуються гнучким лінкером (дивись, наприклад, патент США № 4,946,778 (Ladner et al.); WO88/09344 (Huston et al.); WO92/01047 (McCafferty et al.) описує дисплей scFv-фрагментів на поверхні розчинних рекомбінантних генетичних пакунків “дисплейного” типу, наприклад, бактеріофагу). Пептидні лінкери, що застосовуються для продукування одноланцюгових антитіл, можуть бути гнучкими пептидами, вибраними для забезпечення відповідного тривимірного укладання доменів VL та VH. Згаданий лінкер, як правило, складається з 10-50 амінокислотних залишків. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий лінкер складається з 10-30 амінокислотних залишків. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, згаданий лінкер складається з 1230 амінокислотних залишків. Лінкер, якому віддають найбільшу перевагу, складається з 1525 амінокислотних залишків. Прикладом таких лінкерних пептидів є (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. “Ізольованим антитілом” є антитіло, яке (1) було частково, значною мірою або повністю очищеним від інших компонентів; (2) було ідентифікованим та відокремленим та/або виділеним з компонента його природного середовища; (3) є моноклональним; (4) є вільним від інших білків з того ж самого виду; (5) експресоване клітиною іншого виду; або (6) не зустрічається у природі. Забруднюючими компонентами його природного середовища є речовини, які можуть перешкоджати діагностичному або терапевтичному застосуванню згаданого антитіла, причому згадані речовини можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. Приклади ізольованого антитіла включають антитіло, очищене афінним шляхом, антитіло, продуковане гібридомою або іншою лінією клітин in vitro, та людське антитіло від трансгенної миші. Термін “моноклональне антитіло”, вжитий у цьому описі, означає антитіло, яке одержали з популяції по суті гомогенних антитіл, наприклад, індивідуальні антитіла, які складають популяцію, є по суті ідентичними за виключенням можливих природних мутацій або незначних посттрансляційних варіацій, які можуть бути присутніми. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і спрямовуються проти окремих ділянок детермінанти у молекулі антигену (відомої також як антигенна детермінанта або епітоп). Крім того, на відміну від препаратів, які містять традиційні (поліклональні) антитіла, які, як правило, включають різні антитіла, спрямовані проти різних антигенних детермінант, кожне моноклональне антитіло спрямоване проти однієї антигенної детермінанти на антигені. Визначник “моноклональне” вказує на властивість антитіла, яке було одержане з по суті однорідної популяції антитіл, і не повинен вважатись таким, що вказує на продукування згаданого антитіла будь-яким конкретним способом. Термін “антитіла”, вжитий у цьому описі, охоплює також “гібридні” антитіла (імуноглобуліни), у яких частина важкого та/або легкого ланцюга є ідентичною з або гомологічною відповідним послідовностям антитіл, які були одержані з конкретного виду або належать до конкретного класу або підкласу антитіл, у той час як залишок ланцюга(-ів) є ідентичним або гомологічним відповідним послідовностям антитіл, які були одержані від іншого виду (наприклад, миші або пацюка) або належать до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони демонструють бажану біологічну активність. Дивись, наприклад, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Таким чином, до обсягу цього винаходу включені, наприклад, гібридні антитіла, які містять гібридний важкий ланцюг та/або гібридний легкий ланцюг. Гібридний важкий ланцюг може містити будь-яку з варіабельних ділянок важкого ланцюга (VH), опис яких наведений, або їх мутанти чи варіанти, злиті з константною ділянкою важкого ланцюга нелюдського антитіла. Гібридний легкий ланцюг може містити будь-яку з варіабельних ділянок легкого ланцюга (VL), опис яких наведений, або їх мутанти чи варіанти, злиті з константною ділянкою легкого ланцюга нелюдського антитіла. Термін “людське антитіло”, вжитий у цьому описі, включає антитіла, які мають варіабельні та константні ділянки, які відповідають людським зародковим імуноглобуліновим послідовностям (як описано у Kabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Людські антитіла за цим винаходом можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються людськими зародковими імуноглобуліновими послідовностями (наприклад, мутації, введені довільним або сайтспецифічним мутагенезом in vitro або соматичною мутацією in vivo), наприклад, у CDR. Людське антитіло може мати щонайменше одне положення, замінене на амінокислотний залишок, наприклад, амінокислотний залишок, що стимулює активність, який не кодується людською зародковою імуноглобуліновою послідовністю. Однак термін “людське антитіло”, вжитий у цьому описі, не включає антитіла, у яких послідовності CDR, які були одержані з зародкової лінії ссавців іншого виду, таких як миші, були пересаджені на людські каркасні 4 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності. Словосполучення “рекомбінантне людське антитіло” охоплює людські антитіла, які одержані, експресовані, створені або ізольовані рекомбінантними способами, такі як антитіла, експресовані за допомогою рекомбінантного вектору експресії, трансфектованого у клітинухазяїна, антитіла, ізольовані з бібліотеки рекомбінантних комбінаторних людських антитіл, антитіла, ізольовані з тварини, яка є трансгенною через людські імуноглобулінові гени, або антитіла, одержані, експресовані, створені або ізольовані будь-якими іншими способами, які спричинюють сплайсування послідовностей людських імуноглобулінових генів до інших послідовностей ДНК. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні та константні ділянки, одержані з людських зародкових імуноглобулінових послідовностей (дивись Kabat, et al., supra). Fc (фрагмент, що кристалізується) є позначенням частини або фрагмента антитіла, яка(-ий) містить дві константні домени важкого ланцюга. У антитіла IgG, наприклад, Fc містить CH2 та CH3. Fc антитіла IgA або IgM додатково містить CH4. Fc пов’язують зі зв’язуванням Fcрецептору, активацією комплементопосередкованої цитотоксичності та ADCC. Для антитіл, таких як IgA та IgM, які являють собою комплекси численних IgG-подібних білків, утворення комплексу потребує константних ділянок Fc. Таким чином, антитіла за цим винаходом включають (але ними не обмежуються) природні антитіла, антитіла, людські антитіла, гуманізовані антитіла, рекомбінантні людські антитіла, моноклональні антитіла, фрагменти розщеплення, їх визначені частини та варіанти, у тому числі антитіла-міметики або такі, які містять частини антитіл, які імітують структуру та/або функцію антитіла або його певного фрагмента чи певної частини, причому кожне антитіло, його фрагмент або частина містить щонайменше одну CDR. Функціональні фрагменти включають антигензв’язувальні фрагменти, які зв’язуються з антигеном TYRP1. Наприклад, фрагменти антитіл, здатні до зв’язування з TYRP1 або його частиною, які входять до обсягу цього винаходу, включають бівалентні фрагменти, такі як (Fab') 2, з інтактними міжланцюговими дисульфідними зв’язками, моновалентні фрагменти, такі як Fab (антигензв’язувальний фрагмент), до яких належать фрагменти антитіла, які складаються з VL CL VL CH1 ділянок і не зберігають шарнірної ділянки важкого ланцюга (одержані, наприклад, шляхом папаїнового розщеплення), Fabs, які зберігають шарнірну ділянку важкого ланцюга, facb (одержані, наприклад, шляхом плазмінового розщеплення), F(ab') 2, Fab', яким бракує дисульфідних зв’язків, pFc' (одержані, наприклад, шляхом пепсинового або плазмінового розщеплення), Fd (одержані, наприклад, шляхом пепсинового розщеплення, часткового відновлення та повторного агрегування) та Fv або scFv (одержані, наприклад, методами молекулярної біології). Фрагменти антитіл включають також, наприклад, антитіла з видаленими доменами, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла, scFv, однодоменні антитіла, полівалентні одноланцюгові антитіла, мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіла, у тому числі діатіла, триатіла тощо, які специфічно зв’язуються з антигенами. Шарнірна ділянка відокремлює Fab- та Fc-фрагменти антитіла із забезпеченням взаємної рухливості Fabs та рухливості відносно Fc, а також включає численні дисульфідні зв’язки для ковалентного зв’язування двох важких ланцюгів. Антитіла за цим винаходом або їх фрагменти є специфічними до TYRP1. Специфічність антитіла означає вибіркове розпізнання антитілом конкретної антигенної детермінанти антигену. Антитіла за цим винаходом або їх фрагменти можуть, наприклад, бути моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. Біспецифічними антитілами (BsAbs) є антитіла, які мають дві різні антигензв’язувальні специфічності або два різні антигензв’язувальні центри. Мультиспецифічні антитіла мають більше двох різних антигензв’язувальних специфічностей або центрів. Якщо антитіло має більше однієї специфічності, то розпізнані антигенні детермінанти можуть пов’язуватись з одним антигеном або більше ніж з одним антигеном. Таким чином, цей винахід пропонує біспецифічні антитіла або їх фрагменти, які зв’язуються з двома різними антигенами, із щонайменше однією специфічністю до TYRP1. Цей винахід пропонує ізольовані антитіла або їх фрагменти, специфічні до TYRP1. Білок TYRP1 являє собою білок ссавців і є, за варіантом, якому віддають перевагу, людським. За варіантом, якому віддають особливу перевагу, антитіло за цим винаходом є здатним до зв’язування як людського TYRP1, так і мишачого TYRP1 [Shibahara et al., Nucleic Acids Res. 14(6) 2413-2427 (1986)], і внаслідок цього є придатним як для передклінічних, так і для клінічних досліджень in vivo. Антитіла за цим винаходом є здатними до здійснення однієї або декількох з наведених нижче активностей: 1) демонстрації високої спорідненості до зв’язування виключно з TYRP1; та 2) пригнічення росту пухлин in vitro та in vivo. Специфічність антитіл за цим винаходом або їх фрагментів до TYRP1 може бути визначена, 5 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виходячи із афінності та/або авідності. Афінність, представлена константою дисоціації антигену з антитілом у стані рівноваги (KD), визначає силу зв’язування між антигенною детермінантою та антигензв’язувальним центром антитіла. До антитіл за цим винаходом або їх фрагментів належать також антитіла, зв’язувальні властивості яких були модифіковані або поліпшені шляхом безпосередньої мутації, методами “визрівання афінності”, технікою фагового дисплею або перестановкою ланцюгів. Афінність та специфічність можуть модифікуватись або поліпшуватись шляхом мутування CDR і проведенням перевірки для пошуку антигензв’язувальних центрів антитіла, які мають бажані властивості (дивись, наприклад, Yang et al., J. Mol. Biol., (1995) 254: 392-403). Мутацію CDR здійснюють різними способами. Один із способів полягає у рандомізації окремих залишків або комбінацій залишків так, щоб у популяції за всіма іншими властивостями ідентичних антигензв’язувальних центрів усі двадцять амінокислот знаходились у конкретних положеннях. У альтернативному варіанті мутації спричинені у ряду залишків CDR методами схильної до помилок ПЛР (дивись, наприклад, Hawkins et al., J. Mol. Biol., (1992) 226: 889-896). Наприклад, вектори фагового дисплею, які містять гени варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів, можуть розмножуватись у штамах-мутаторах E. coli (дивись, наприклад, Low et al., J. Mol. Biol., (1996) 250: 359-368). Ці методи мутагенезу є ілюстративними для багатьох методів, відомих фахівцю у цій галузі. Зручним способом одержання замінених варіантів є “визрівання афінності” за допомогою техніки фагового дисплею. Коротко кажучи, декілька сайтів CDR піддають мутаціям для одержання усіх можливих амінокислотних замін на кожному сайті. Одержані таким способом варіанти антитіл відображають у моновалентному вигляді з частинок нитчастих фагів як злиття з продуктом гену III M13, який є запакованим у кожній частинці. Після цього варіанти, одержані за допомогою техніки фагового дисплею, перевіряють на їх біологічну активність (наприклад, зв’язувальна спорідненість, специфічність, IC50, EC50, KD), як розкрито у цьому описі. Для встановлення сайтів CDR, які є кандидатами для модифікації, може бути проведеним аланіновий сканувальний мутагенез для встановлення залишків CDR, які значною мірою сприяють зв’язуванню антигену. У альтернативному варіанті або додатково довільному мутагенезу може бути піддана одна або декілька послідовностей CDR у одному чи декількох положеннях залишків або у той час, коли CDR є функціонально зв’язаною з варіабельною ділянкою, або у той час, коли CDR є незалежною від іншої послідовності варіабельної ділянки, з подальшим поверненням зміненої CDR до варіабельної ділянки за допомогою методу рекомбінантних ДНК. Після одержання та експресії таких антитіл-варіантів панель варіантів піддають скринінгу, як розкрито у цьому описі, і антитіла з кращими властивостями за допомогою одного або декількох відповідних аналізів можуть відбиратись для подальшого дослідження. Як розкрито у цьому описі, крім конкретно описаних антитіл, інші “по суті гомологічні” модифіковані антитіла можуть бути легко розроблені та одержані за допомогою різних методів рекомбінантних ДНК, добре відомих фахівцям у цій галузі. Наприклад, каркасні ділянки можуть відрізнятись від нативних послідовностей на первинному структурному рівні декількома амінокислотними замінами, термінальними та проміжними доданнями та делеціями тощо. Крім того, цілий ряд різних людських каркасних ділянок може застосовуватись окремо або у комбінації як основа для гуманізованих імуноглобулінів за цим винаходом. Загалом модифікування генів може бути легко здійснені за допомогою цілого ряду добре відомих методів, таких як сайт спрямований мутагенез. До обсягу цього винаходу включені TYRP1-зв’язувальні поліпептиди з амінокислотними послідовностями, по суті такими ж самими, що і амінокислотна послідовність варіабельних або гіперваріабельних ділянок описаних непроцесованих антитіл проти TYRP1. По суті така ж сама амінокислотна послідовність визначена у цьому описі як послідовність із щонайменше 70%, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 80% та за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 90%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% гомологією з іншою амінокислотною послідовністю, як визначено пошуковим методом FASTA згідно з Pearson та Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:2444-8). Антитіла за цим винаходом або їх фрагменти включають людські антитіла, які мають одну, дві, три, чотири, п’ять та/або шість гіперваріабельних ділянок (CDR), вибраних з групи, до складу якої входять амінокислотні послідовності CDR, наведені у Таблиці 1. У іншому варіанті здійснення антитіла за цим винаходом або їх фрагменти можуть мати варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла 20D7 або антитіла 20D7S та/або варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла 20D7 або антитіла 20D7S, опис яких наведений нижче. Антитіла 20D7 та 20D7S являють собою антитіла за цим винаходом, яким віддають особливу 6 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перевагу. Ці антитіла мають людські каркасні ділянки (FR) VH та VL, а також людські CDR. До обсягу цього винаходу включені нуклеїновокислотні послідовності, які кодують важкий ланцюг антитіла проти TYRP1, що містить будь-яку VH або її частину чи будь-яку з CDR VH, у тому числі будь-які її варіанти, як розкрито у цьому описі. До обсягу цього винаходу включені також нуклеїновокислотні молекули, які кодують легкий ланцюг антитіла проти TYRP1, що містить будь-яку ділянку VL або її частину чи будь-яку з CDR ділянки VL, у тому числі будь-які варіанти CDR, як розкрито у цьому описі. Кожен домен антитіл за цим винаходом може бути повним антитілом з варіабельною ділянкою важкого або легкого ланцюга, або він може бути функціональним еквівалентом чи мутантом або похідною природного домену чи сконструйованим штучним доменом, наприклад, in vitro, за допомогою такого методу, як описаний у WO 93/11236 (Griffiths et al.). Наприклад, можна з’єднати між собою домени, які відповідають варіабельним ділянкам антитіла, яким бракує щонайменше однієї амінокислоти. Також таким антитілом є антитіло з однією або декількома амінокислотними замінами, мутаціями або делеціями у межах однієї з послідовностей CDR. Важливою відмітною особливістю є здатність кожного домену до зв’язування з комплементарним доменом для утворення антигензв’язувального центру. Таким чином, словосполучення “фрагмент варіабельної ділянки важкого ланцюга” та “фрагмент варіабельної ділянки легкого ланцюга” не повинні розглядатись як такі що виключають варіанти, у тому числі варіанти CDR, які не справляють істотного впливу на специфічність. Антитіла за цим винаходом можуть продукуватись методами, відомими у цій галузі. До цих методів належить імунологічний метод, опис якого наведений у Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) і у Campbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas, Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985); а також метод рекомбінантних ДНК, опис якого наведений у Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Фрагменти антитіл можуть продукуватись шляхом розщеплення цілого антитіла або шляхом експресії ДНК, яка кодує згаданий фрагмент. Фрагменти антитіл можна одержати за допомогою методів, опис яких наведений у Lamoyi et al., J. Immunol. Methods 56: 235-243 (1983) та у Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Такі фрагменти можуть містити один або обидва Fab-фрагменти чи F(ab')2-фрагмент. Такі фрагменти можуть також містити одноланцюгові фрагменти варіабельної ділянки антитіл, тобто scFv, діатіла або інші фрагменти антитіл. Методи продукування таких функціональних еквівалентів розкриті у заявці WO 93/21319, заявці на європейський патент EP 239,400; заявці WO 89/09622; заявці на європейський патент EP 338,745; та заявці на європейський патент EP 332,424. Клітинами-хазяями для трансформації векторів та експресії антитіл за цим винаходом, яким віддають перевагу, є клітини ссавців, наприклад, клітини NSO (несекретуючі (0) клітини мишачої мієломи), клітини 293 і клітини CHO (клітини яєчника китайського хом’ячка) та інші клітинні лінії лімфоїдного походження, такі як клітини лімфоми, мієломи або гібридоми. У альтернативному варіанті можуть бути застосовані інші хазяї-еукаріоти, такі як дріжджі. Трансформовані клітини-хазяї культивовані за допомогою методів, відомих у цій галузі, у рідкому середовищі, яке містить засвоювані джерела вуглецю (вуглеводи, такі як глюкоза або лактоза), азот (амінокислоти, пептиди, білки або продукти їх розщеплення, такі як пептони, солі амонію тощо) та неорганічні солі (сульфати, фосфати та/або карбонати натрію, калію, магнію та кальцію). Згадане середовище також містить, наприклад, речовини, що стимулюють ріст, такі як мікроелементи, наприклад, залізо, цинк, марганець тощо. Якщо бажаним є експресування генно-інженерної конструкції у дріжджах, відповідним селекційним геном для застосування у дріжджах є ген trp1, присутній у дріжджовій плазміді YRp7. Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979). Ген trp1 забезпечує селекційний маркер для мутантного штаму дріжджів, якому бракує здатності до зростання у триптофані, наприклад, ATCC (Американська колекція типових культур) № 44076 або PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Присутність пошкодження гена TRP1 у геномі дріжджової клітини-хазяїна при подальшому використанні цього гена забезпечує прийнятне середовище для виявлення трансформації шляхом вирощування при відсутності триптофану. Подібним же чином дріжджові штами, які мають недостатню кількість Leu2(ATCC 20,622 або 38,626), доповнені відомими плазмідами, які несуть ген Leu2. Антитіла за цим винаходом можуть ізолюватись або очищатись від фізіологічного розчину будь-яким методом, відомим у цій галузі, у тому числі осаджуванням за допомогою сульфату амонію або сульфату натрію з подальшим діалізом проти фізіологічного розчину, іонообмінною хроматографією, або імуноафінною хроматографією, а також гель-фільтрацією або зонним електрофорезом. Методом очищення антитіл за цим винаходом, якому віддають перевагу, є 7 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білок А-специфічна афінна хроматографія. ДНК, яка кодує людські антитіла, можна одержати шляхом рекомбінування ДНК, що кодує людські константні ділянки та варіабельні ділянки, за винятком CDR, одержаної по суті або виключно з відповідних ділянок людських антитіл, та ДНК, яка кодує CDR, одержаної від людини. Прийнятні джерела ДНК, які кодують фрагменти антитіл, включають будь-яку клітину, таку як клітини гібридом та селезінки, які експресують непроцесоване антитіло. Згадані фрагменти можуть бути застосовані самі по собі як еквіваленти антитіл або можуть бути рекомбіновані у еквіваленти, як описано вище. Делеції та рекомбінації ДНК, описані у цьому розділі, можуть бути здійснені добре відомими методами. Іншим джерелом ДНК є фаг-дисплейна бібліотека антитіл, як відомо у цій галузі. Антитіла за цим винаходом, наведені як приклади, були одержані за гібридомною технологією від імунізованих мишей. Крім того, цей винахід пропонує вектори експресії, які містять полінуклеотидні послідовності, опис яких наведений вище, функціонально зв’язані з експресійною послідовністю, промотором та енхансерною послідовністю. Був розроблений цілий ряд векторів експресії для ефективного синтезу поліпептиду антитіла у прокаріотних системах, таких як бактерії, та еукаріотних системах, у тому числі (але без обмеження ними) системах культури клітин дріжджів та ссавців. Вектори за цим винаходом можуть містити сегменти послідовностей хромосомної, нехромосомної та штучної ДНК. Може бути застосований будь-який прийнятний вектор експресії. Наприклад, прокаріотичні клонувальні вектори включають плазміди з E. coli, такі як colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM та RP4. Прокаріотичні вектори включають також похідні фагової ДНК, такі як M13, та інших нитчастих фагів з одноланцюжковою ДНК. Прикладом вектору, прийнятного у дріжджів, є плазміда 2. До числа прийнятних векторів для експресії у клітинах ссавців належать добре відомі похідні SV-40, аденовірусу, послідовності ДНК ретровірусного походження та “човникові” вектори, які є похідними комбінації функціональних векторів ссавців, таких як вектори, опис яких наведений вище, та функціональних плазмід і фагової ДНК. У цій галузі відомі інші еукаріотичні вектори експресії (описані, наприклад, у P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864 (1981); Kaufmann and Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-664 (1982); Scahill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4654-4659 (1983); та Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980)). Вектори експресії, прийнятні для застосування за цим винаходом, містять щонайменше одну контрольну послідовність експресії, яка є функціонально зв’язаною з послідовністю ДНК або фрагментом, який підлягає експресії. Контрольну послідовність вводять до складу вектора для контролювання та регуляції експресії клонованої послідовності ДНК. Прикладами прийнятних контрольних послідовностей експресії є lac система, trp система, tac система, trc система, головні операторні та промоторні ділянки фагу лямбда, контрольна ділянка білку оболонки fd, гліколітичні промотори дріжджів, наприклад, промотор 3-фосфогліцераткінази, промотори кислої фосфатази дріжджів, наприклад, Pho5, промотори альфа-фактору дріжджів та промотори, одержані від поліоми, аденовірусу, ретровірусу та мавпячого вірусу, наприклад, ранній та пізній промотори SV40, та інші послідовності, які, як відомо, контролюють експресію генів прокаріотних або еукаріотних клітин та їх вірусів або їх комбінації. Цей винахід пропонує також рекомбінантні клітини-хазяї, які містять вектори експресії, опис яких наведений вище. Антитіла за цим винаходом можуть бути експресовані у інших лініях клітин, крім гібридом. Нуклеїнові кислоти, які містять послідовність, яка кодує поліпептид за цим винаходом, можуть бути застосовані для трансформації прийнятної клітини-хазяїна ссавця. Лінії клітин, яким віддається особлива перевага, можуть бути вибрані, виходячи з високого рівня експресії, конститутивної експресії білка, який становить інтерес, та мінімального забруднення білками хазяїна. Лінії клітин ссавців, доступні як хазяї для експресії, є добре відомими у цій галузі і включають багато імморталізованих ліній клітин, таких як (але без обмеження ними) клітини NSO (несекретуючі (0) клітини мишачої мієломи), клітини мишачої мієломи, клітини яєчника китайського хом’ячка (CHO), клітини нирок дитинча хом’ячка (BHK) та багато інших. Інші прийнятні еукаріотні клітини включають дріжджі та інші гриби. Прийнятні хазяї-прокаріоти включають, наприклад, E. coli, наприклад, E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI та E. coli MRCl, Pseudomonas, Bacillus, такі як Bacillus subtilis та Streptomyces. Ці рекомбінантні клітини-хазяї за цим винаходом можуть бути застосовані для продукування антитіла або його фрагмента, шляхом культивування згаданих клітин при умовах, які уможливлюють експресію антитіла або його фрагмента, та відділення антитіла або його фрагмента від клітини-хазяїна або середовища, яке оточує згадану клітину-хазяїна. 8 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спрямування експресованого антитіла або фрагмента для секреції у рекомбінантних клітинаххазяях може бути полегшеним шляхом введення послідовності, яка кодує сигнальний або секреторний лідерний пептид (дивись, Shokri et al., (2003) Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654-64, Nielsen et al., Prot. Eng. (1997) 10:1-6 òà von Heinje et al., (1986) Nucl. Acids Res. 14:4683-4690), на 5' кінці антитілокодувального гену, який становить інтерес. Ці секреторні лідерні пептидні елементи можуть бути одержані як з прокаріотної, так і з еукаріотної послідовностей. Таким чином, застосовують прийнятні секреторні лідерні пептиди, які являють собою амінокислоти, приєднані до N-кінця поліпептиду для спрямування пересування поліпептиду з цитозолю клітини-хазяїна та секреції у живильне середовище. Антитіла за цим винаходом можуть зливатись з додатковими амінокислотними залишками. Такими амінокислотними залишками може бути пептидна мітка, можливо, для полегшення ізоляції. Передбачені також інші амінокислотні залишки для спрямування антитіл у конкретні органи або тканини. Іншим варіантом одержання антитіл за цим винаходом є експресія нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло за цим винаходом, у трансгенній тварині, яка має введену у неї значну частину людського геному, що продукує антитіло, і яку роблять дефіцитною щодо продукування ендогенних антитіл. Трансгенні тварини включають (але ними не обмежуються) мишей, кіз та кроликів. Один з інших варіантів здійснення цього винаходу включає експресію антитілокодувального гену, наприклад, у молочній залозі тварини для секреції поліпептиду під час лактації. Цей винахід пропонує також лікування росту пухлин у ссавця шляхом введення згаданому ссавцю ефективної кількості антитіла. Пухлини, якіпідлягають лікуванню за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, експресують TYRP1. Не обмежуючись жодним конкретним механізмом, способи за цим винаходом передбачають лікування росту ракових пухлин, у тому числі злоякісної меланоми. Терміни “лікування” або “лікувати” у контексті цього винаходу означають терапевтичне лікування, у тому числі пригнічення, уповільнення, зменшення або звертання розвитку стану, що лежить у основі, або небажаної фізіологічної зміни, пов’язаної з захворюванням або розладом, поліпшення клінічних симптомів стану або запобігання появі клінічних симптомів стану. Сприятливі або бажані клінічні результати включають (але ними не обмежуються) полегшення тяжкості симптомів, зменшення ступеня захворювання або розладу, стабілізацію захворювання або розладу (тобто коли захворювання або розлад не погіршується), уповільнення або затримку розвитку захворювання або розладу, поліпшення або тимчасове полегшення або ослаблення проявів захворювання або розладу та ремісію (як часткову, так і повну) захворювання або розладу, як виявлювану, так і невиявлювану. Термін “лікування” може також означати подовження виживаності, порівняно з очікуваною виживаністю при відсутності лікування. До числа тих, хто потребує лікування, належать ті, у кого захворювання вже діагностовано. У одному із варіантів здійснення цей винахід може бути застосований як лікарський засіб. Термін “меланома” означає (але ними не обмежується) меланоми, метастатичні меланоми, меланоми, спричинені меланоцитами або клітинами невусів, зв’язаними з меланоцитами, меланокарциноми, меланоепітеліоми, меланосаркоми, меланому in situ, поверхневу меланому, великовузлову меланому, меланому типу злоякісного лентіго, акральну лентигінозну меланому, інвазивну меланому та синдром спадкових атипових родимих плям та меланоми (FAM-M). У одному із варіантів здійснення цього винаходу меланома є специфічною формою раку. У іншому варіанті здійснення меланома може бути злоякісною. Один із варіантів здійснення цього винаходу буде полягати у застосуванні, як описано нижче, описаних вище антитіл проти TYRP1 для лікування меланоми, яка потребує невідкладного лікування. За іншим варіантом здійснення описані антитіла проти TYRP1 будуть застосовані як терапія першої лінії для метастатичної меланоми, тобто вони будуть застосовані у першому циклі лікування нещодавно діагностованої метастатичної меланоми. У способах за цим винаходом терапевтично ефективну кількість антитіла за цим винаходом вводять ссавцю, який цього потребує. Ефективні дози композицій за цим винаходом для лікування розладів, як наведено у цьому описі, різняться у залежності від багатьох різних факторів, у тому числі засобів введення, ділянки-мішені, фізіологічного стану пацієнта, від того, чи є пацієнт людиною або твариною, від інших введених лікарських засобів, від того, чи є лікування профілактичним або терапевтичним. Термін “введення”, вжитий у цьому описі, означає доставку антитіл за цим винаходом ссавцю будь-яким способом, який може забезпечити досягнення бажаного результату. Вони можуть бути введені, наприклад, внутрішньовенним або внутрішньом’язовим шляхом. Незважаючи на те, що людські антитіла за цим винаходом є особливо прийнятними для введення людям, вони можуть вводитись також 9 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншим ссавцям. Термін “ссавець”, вжитий у цьому описі, включає (але без обмеження ними) людей, лабораторних тварин, домашніх тварин та сільськогосподарських тварин. Терапевтично ефективна кількість означає кількість антитіла за цим винаходом, яка при введенні ссавцю є ефективною щодо одержання бажаного терапевтичного впливу, наприклад, пригнічення росту пухлин. Лікувальні дози можуть бути титровані звичайними способами, відомими фахівцям у цій галузі, для оптимізації безпечності та ефективності. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть включати “терапевтично ефективну кількість” антитіла проти TYRP1 за цим винаходом. “Терапевтично ефективна кількість” означає кількість, яка є ефективною, у дозах та впродовж необхідних періодів часу, для досягнення бажаного терапевтичного результату. Терапевтично ефективна кількість антитіла може змінюватись у залежності від таких факторів, як стан захворювання, вік, стать та маса пацієнта, здатність антитіла або частини антитіла викликати бажану реакцію у пацієнта. Терапевтично ефективною кількістю також є кількість, при введенні якої будь-який токсичний або шкідливий вплив антитіла або частини антитіла переважується терапевтично сприятливим впливом. Схема приймання лікарського засобу може регулюватись для забезпечення оптимальної бажаної реакції (наприклад, терапевтичної або профілактичної реакції). Ідентифікація такого захворювання знаходиться у межах знань та кваліфікації фахівця у цій галузі. Наприклад, антитіла проти TYRP1 за цим винаходом прийнятні для введення людям, які страждають на злоякісну меланому або належать до групи ризику розвитку клінічно значущих симптомів. Антитіла проти TYRP1 за цим винаходом вводять для терапевтичного лікування пацієнту, який страждає на злоякісну меланому, у кількості, достатній для пригнічення або уповільнення розвитку пухлини або патологічного стану. Розвиток включає, наприклад, ріст, інвазивність, метастазування та/або рецидивування пухлини або патологічного стану. Кількість, достатня для здійснення цього, визначається як терапевтично ефективна доза. Кількості, ефективні для цього застосування, будуть залежати від тяжкості захворювання та загального стану власної імунної системи пацієнта. Схеми застосування лікарського засобу будуть також змінюватись у залежності від стану захворювання та статусу пацієнта у залежності від рекомендацій лікаря, що лікує пацієнта, та від стану пацієнта, причому згадані схеми застосування лікарського засобу будуть, як правило, коливатись у межах від однієї ударної дози або безперервного вливання до численних декількох введень на добу (наприклад, кожні 4-6 годин). Прикладом необмежувального діапазону для терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом є 0,1-50 мг/кг, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, 3-35 мг/кг, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, 5-20 мг/кг. Кількість та частота введення доз буде визначатись лікарем, який лікує пацієнта, і може включати дози від менше ніж 1 мг/кг до більше ніж 100 мг/кг, які вводять щодобово, три рази на тиждень, щотижнево, один раз на два тижні або рідше. Доза на одне введення може знаходитись у межах 1-100 мг/кг, 2-75 мг/кг або 5-60 мг/кг. Однак варто зауважити, що цей винахід не обмежений жодною конкретною дозою. У певному варіанті здійснення цього винаходу антитіла проти TYRP1 можуть бути введені у комбінації з одним або декількома іншими протипухлинними засобами. Може бути застосований будь-який прийнятний протипухлинний засіб, такий як хіміотерапевтичний засіб, опромінювання або їх комбінації. Згаданим протипухлинним засобом може бути алкілувальний засіб або антиметаболіт. Приклади алкілувальних засобів включають (але ними не обмежуються) цисплатин (cisplatin), циклофосфамід (cyclophosphamide), мелфалан (melphalan) та дакарбазин (DTIC). Дослідження in vivo вказують на те, що введення антитіла 20D7 у комбінації з дакарбазином (DTIC) демонструє сильнішу протипухлинну активність на людському 624mel ксенотрансплантаті порівняно з монотерапією. У одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіла проти TYRP1, описані вище, вводять у комбінації з дакарбазином. Приклади антиметаболітів включають (але ними не обмежуються) доксорубіцин (doxorubicin), даунорубіцин (daunorubicin), паклітаксел (paclitaxel), іринотекан (CPT-11) та топотекан (topotecan). При застосуванні опромінювання як протипухлинного засобу джерело випромінення, по відношенню до пацієнта, якого піддають лікуванню, може бути зовнішнім (дистанційна променева терапія - EBRT) або внутрішнім (контактна променева терапія – BT) Доза протипухлинного засобу, що вводиться, залежить від численних факторів, у тому числі, наприклад, від типу засобу, типу та тяжкості пухлини, яку піддають лікуванню, та шляху введення засобу. Однак слід підкреслити, що цей винахід не обмежується жодною конкретною дозою. За цим винаходом може бути застосований будь-який прийнятний спосіб або шлях для введення антитіл проти TYRP1 за цим винаходом і факультативно для сумісного введення протипухлинних засобів та/або антагоністів інших рецепторів. Схеми приймання 10 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протипухлинного засобу, які застосовують за цим винаходом, включають будь-яку схему, яка, як гадають, є оптимально придатною для лікування пухлинного стану пацієнта. Різні злоякісні пухлини можуть потребувати застосування специфічних протипухлинних антитіл та специфічних протипухлинних засобів, які будуть визначатись індивідуально для кожного пацієнта. Шляхи введення включають, наприклад, пероральне, внутрішньовенне, внутрішньоочеревинне, підшкірне або внутрішньом’язове введення. Перевагу віддають парентеральним шляхам. Однак слід прийняти до уваги, що цей винахід не обмежується жодним конкретним способом або шляхом введення. За іншим аспектом цього винаходу антитіло проти TYRP1 за цим винаходом може хімічним або біосинтетичним шляхом зв’язуватись з одним або декількома протипухлинними або антиангіогенними засобами. Крім того, цей винахід передбачає антитіла проти TYRP1, зв’язані з спрямувальними або репортерними складовими, які включають, наприклад, лише протипухлинні засоби, інші антитіла або репортерні молекули, у діагностичній системі, де виявлюваний засіб, який продукує сигнал, кон’югується з антитілом. Слід розуміти, що антитіла проти TYRP1 за цим винаходом, при їх застосуванні у ссавця для профілактики або лікування, будуть вводитись у формі композиції, яка, крім того, містить фармацевтично прийнятний носій. Відповідні фармацевтично прийнятні носії включають, наприклад, один або декілька з носіїв, вибраних із групи, до складу якої входить вода, фізіологічний розчин, фосфатно-сольовий буферний розчин, декстроза, гліцерин, етанол тощо, а також їх комбінації. Фармацевтично прийнятні носії можуть також містити незначні кількості допоміжних речовин, таких як зволожувальні засоби або емульгатори, консерванти або буфери, які подовжують строк придатності при зберіганні або підвищують ефективність зв’язувальних білків. Рецептура композиції для ін’єкцій може, як це добре відомо у цій галузі, складатись так, щоб композиції забезпечували швидке, тривале або пролонговане виділення активного інгредієнту після введення ссавцю. До обсягу цього винаходу входить також застосування антитіл за цим винаходом in vivo та in vitro для науково-дослідних або діагностичних методів, які є добре відомими у цій галузі. Діагностичні засоби включають набори, які включають в себе антитіла за цим винаходом. За одним із варіантів здійснення цей винахід пропонує людське моноклональне антитіло або його фрагмент, специфічне(-ий) до TYRP1. У іншому варіанті здійснення цей винахід пропонує гібридне моноклональне антитіло або його фрагмент, специфічне(-ий) до TYRP1. У іншому варіанті здійснення гіперваріабельні ділянки антитіла є ідентичними гіперваріабельним ділянкам CTA99. У іншому варіанті здійснення гіперваріабельні ділянки антитіла є ідентичними гіперваріабельним ділянкам антитіла 20D7 або антитіла 20D7S. У одному з варіантів здійснення згадане антитіло зв’язується з TYRP1 з константою -4 -1 -4 дисоціації (Kd або koff) у межах від 1,710 1/с (с , 1/с) до 510 1/с, за визначенням за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, як описано у цьому документі, при температурі навколишнього лабораторного середовища (20-25C). У іншому варіанті здійснення -4 -4 антитіло зв’язується з TYRP1 з Kd або koff у межах від 1,710 1/с до 3,510 1/с. У іншому варіанті здійснення згадане антитіло зв’язується з TYRP1 з константою дисоціації, визначеною за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, яка дорівнює 10% від константи дисоціації, визначеної для 20D7, 20D7S або CTA99 при таких самих умовах. Один із варіантів здійснення цього винаходу являє собою моноклональне антитіло або його фрагмент, специфічне(-ий) до TYRP1, що містить одну або декілька гіперваріабельних ділянок (CDR), вибраних з групи, до складу якої входять CDR, наведені у Таблиці 1 та Таблиці 2. За іншим варіантом здійснення цей винахід пропонує моноклональне антитіло або його фрагмент, специфічне(-ий) до TYRP1, що має CDR1 легкого ланцюга з послідовністю: RASQSVSSYLA (послідовність SEQ ID NO: 4). У іншому варіанті здійснення цей винахід пропонує моноклональне антитіло або його фрагмент, специфічне(-ий) до TYRP1, що має CDR3 важкого ланцюга з послідовністю: RYSSSWYLDY (послідовність SEQ ID NO: 3). У іншому варіантом здійснення цей винахід пропонує моноклональне антитіло або його фрагмент, який містить (i) варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, до складу якої входить 20D7, 20D7S та CTA99, та (ii) варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, до складу якої входить 20D7, 20D7S та CTA99. У іншому варіанті здійснення цей винахід пропонує моноклональне антитіло або його фрагмент, специфічне(-ий) до TYRP1, що містить (i) варіабельну ділянку легкого ланцюга CTA99, (ii) варіабельну ділянку важкого ланцюга CTA99 та (iii) константні ділянки людського імуноглобуліну G1 (hIgG1). Іншим варіантом здійснення цього винаходу є спосіб лікування раку у ссавця, який включає введення ссавцю ефективної кількості антитіла або його фрагмента за будь-яким із вже 11 UA 99339 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описаних варіантів здійснення. Цей винахід пропонує також спосіб лікування злоякісної меланоми. Інший спосіб лікування, запропонований цим винаходом, об’єднує застосування антитіл або їх фрагментів за цим винаходом з введенням додаткового протипухлинного засобу або лікарського засобу. У одному із способів лікування протипухлинним засобом є дакарбазин (DTIC). Слід розуміти і очікувати, що фахівець у цій галузі зможе вносити зміни у суттеві ознаки цього винаходу, розкриті у цьому описі, і це означає, що такі вдосконалення повинні охоплюватись обсягом цього винаходу. Усі посилання, згадані у цьому описі, включені до нього у повному обсязі. Приклади Наведені нижче приклади додатково ілюструють винахід, але вони не повинні розглядатись як такі, що будь-яким чином обмежують обсяг цього винаходу. Однак вони жодним чином не повинні розглядатись як такі, що обмежують обсяг цього винаходу. Докладний опис традиційних способів, таких як способи, які застосовують при конструюванні векторів та плазмід, при введенні генів, що кодують поліпептиди, до таких векторів та плазмід, при введенні плазмід до клітин-хазяїв та експресії і визначенні генів та генних продуктів, можна знайти у численних публікаціях, у тому числі у Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Тварини та лінії клітин SKàme128, SKme123, 624mel, 1102mel та A375 підтримують у середовищі RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies) з 10% інактивованої теплом сироватки плоду великої рогатої худоби (HyClone Laboratories, Logan, штат Юта), і звичайним способом перевіряють їх на забруднення мікоплазмами. SKme123 та SKme128 були надані д-ром Alan Houghton (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, штат Нью-Йорк). 624mel та 1102mel були одержані від д-ра Steve Rosenberg (National Cancer Institute, Bethesda, штат Меріленд). Лінія клітин A375 була закуплена з Американської колекції типових культур (Manassas, штат Вірджинія). Миші-самиці лінії Nu/Nu віком від шести до восьми тижнів були закуплені від компанії Taconic Farms (Germantown, штат Нью-Йорк). Експресія та очищення людських та гібридних антитіл проти TYRP1 Для кожного антитіла конструюють відповідну нуклеотидну послідовність важкого ланцюга, наприклад, послідовності SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 або SEQ ID NO: 23 (для 20D7, 20D7S та CTA99, відповідно), у відповідній експресійній плазміді, наприклад, pGSHC, і конструюють відповідну нуклеотидну послідовність легкого ланцюга, наприклад, послідовність SEQ ID NO: 26 або SEQ ID NO: 27 (для 20D7/20D7S та CTA99, відповідно), у відповідній експресійній плазміді, такій як pGSLC, відповідним способом, таким як ПЛР-клонування. Для одержання стабільної лінії клітин котрансфектують відповідну лінію клітин-хазяїв, таку як клітини NSO, переведеними у лінійну форму плазмідами важкого та легкого ланцюгів шляхом електропорації та культивують у прийнятному живильному середовищі, такому як безглутамінове модификоване за способом Дульбекко середовище Ігла з діалізованою сироваткою плода корови, доповненому глутамінсинтетазою. Перевіряють клони на експресію антитіла за допомогою імуноферментного твердофазного аналізу (ELISA), і вибирають максимального продуцента для культивування у обертових колбах. Очищають антитіла відповідним способом, таким як білок А-специфічна афінна хроматографія. Одним із варіантів здійснення цього винаходу є рекомбінантне людське моноклональне антитіло 20D7, непроцесований IgG1, спрямований на експресований на поверхні клітини тирозиназа-зв’язаний білок 1-го типу (TYRP1 або TRP1). Згадане антитіло складається з людського важкого ланцюга типу гамма-1 (HC) (підгрупа І) та людського легкого ланцюга типу каппа (підгрупа III). Було показано, що 20D7 вибірково зв’язується з людським TYRP1 з високою афінністю та опосередкованою сильною протипухлинною активністю на моделях трансплантатів за допомогою механізму, який залучає активацію імунної ефекторної функції. Одним із варіантів здійснення цього винаходу є рекомбінантне людське моноклональне антитіло 20D7S, непроцесований IgG1, спрямований на експресований на поверхні клітини тирозиназа-зв’язаний білок 1-го типу (TYRP1 або TRP1). Згадане антитіло складається з людського важкого ланцюга типу гамма-1 (HC) (підгрупа I) та людського легкого ланцюга типу каппа (підгрупа III). 20D7S створили для одержання ще більш стабільної молекули; вільний цистеїновий залишок у межах варіабельної ділянки важкого ланцюга (C47) перетворили на сериновий залишок шляхом сайтспрямованого мутагенезу. Цей неспарований або вільний цистеїн має потенціал до помилкового парування з іншими цистеїнами, які приймають участь у внутрішньо- та міжланцюговому дисульфідному місточковому зв’язуванні поліпептидів важких та легких ланцюгів. Помилкове парування може потенційно призвести до невідповідного 12 UA 99339 C2 5 10 15 20 вкладання та процесингу, що підвищує неоднорідність продукту та, можливо, і його стабільність. Результати аналізу за допомогою SDS PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), опис якого наведений, підтверджують присутність вільного легкого ланцюга та вільного важкого ланцюга у препараті 20D7, у той час як присутність вільних легких ланцюгів та вільних важких ланцюгів у препараті 20D7S є зменшеною або повністю ліквідованою. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є CTA99, гібридне антитіло з людською константною ділянкою IgG1. Мишаче антитіло TA99 (патент США № 4,798,790) містить два легкі ланцюги; один легкий ланцюг TA99 є специфічним до TYRP1, а другий походить з батьківських мишачих мієломних клітин. Спостерігається знижена активність, оскільки контамінований легкий ланцюг є нездатним до зв’язування з TYRP1. CTA99 був сконструйований для виправлення цього дефекту і поліпшення тим самим активності. У одному із варіантів здійснення цього винаходу CTA99 був сконструйований з двома ідентичними важкими ланцюгами і двома ідентичними легкими ланцюгами. Дослідження, опис яких наведений у цьому документі, ілюструють підвищену активність та зв’язувальну спорідненість CTA99, а також більш прийнятні для людей ефекторні функції. У Таблиці 1 та Таблиці 2 наведені амінокислотні послідовності та ідентифікаційні номери послідовностей (SEQ ID NO) різних CDR за цим винаходом. У Таблиці 3 наведені ідентифікаційні номери (SEQ ID NO) різних послідовностей, які стосуються цього винаходу. Послідовності полінуклеїнових кислот, які кодують описані нижче амінокислотні послідовності, також включені до обсягу цього винаходу. Таблиця 1 Амінокислотна послідовність антитіла 20D7 та 20D7S CDR варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюгів CDR1 CDR2 CDR3 Важкий ланцюг GYTFTSYAMN WINTNTGNPTYAQGFTG RYSSSWYLDY SEQ ID NO 1 2 3 Легкий ланцюг RASQSVSSYLA DASNRAT QQRSNWLMYT SEQ ID NO 4 5 6 Таблиця 2 Амінокислотна послідовність антитіла CTA99 CDR варіабельної ділянки важкого і легкого ланцюгів CDR1 CDR2 CDR3 Важкий ланцюг GFNIKDYFLH WINPDNGNTVYDPKFQG DYTYEKAALDY SEQ ID NO 7 8 9 Легкий ланцюг RASGNIYNYLA DAKTLAD QHFWSLPFT SEQ ID NO 10 11 12 Таблиця 3 Ідентифікаційні номери амінокислотних послідовностей (SEQ ID NO) антитіл 20D7, 20D7S та CTA99 Важкий ланцюг Легкий ланцюг З сигналом Варіабельна ділянка Без сигналу З сигналом Варіабельна ділянка Без сигналу 20D7 18 13 29 24 16 32 20D7S 19 14 30 24 16 32 CTA99 20 15 31 25 17 33 Антитіло 25 Антитіла, застосовані у експериментах, містили непроцесовані важкі та легкі ланцюги без сигналів, як наведено у Таблиці 3. 13 UA 99339 C2 Таблиця 4 Узагальнення данних для антитіл 20D7, 20D7S та CTA99 Антитіло TA99 CTA99 20D7 20D7S FACS (клітинний сортер із збудженням флуоресценції) (mel) +++ +++ +++ +++ Конкурентний ELISA (EC50) (M) 4,010 -10 1,110 -10 1,110 -10 0,9810 -10 Афінність KD (M) -9 1,710 -9 1,110 -9 0,2810 -9 0,2810 Зв’язування з Людська Людська людським FcR ADCC (%) CDC (%) (M) ND ND -10 1,110 -10 0,9710 ND 48 42 56 ND 94 100 ND ND = не визначалось. 5 10 15 Конкурентний імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA) Сенсибілізують гнучкі 96-лункові планшети з пласким дном (Falcon) рекомбінантним людським TYRP (0,5 мкг/мл50 мкл) при температурі 4C впродовж ночі Гнучкі 96-лункові планшети з пласким дном (Falcon) сенсибілізують рекомбінантним людським TYRP (0,5 мкг/мл50 мкл) при температурі 4C впродовж ночі. Наступного дня планшет блокують за допомогою 5% FBS у PBS, який містить 0,1% твін-20, впродовж 2 год при кімнатній температурі. Додають різні кількості антитіл у 100 мкл зразках. Планшет промивають за допомогою (3) PBS/твін, і додають у нього 100 мкл козячого антилюдського антитіла, кон’югованого з пероксидазою з хрону (компанія Biosource, Camarillo, штат Каліфорнія), розбавленого 1:5000 у 100 мкл, та інкубують впродовж однієї години при кімнатній температурі (20-25C). Планшет промивають (3), і додають (50 мкл/лунку) у планшет 3,3',5,5'тетраметилбензидиновий субстрат (TMB; KPL, Gaithersburg, штат Меріленд) Планшети зчитують при 450 нм за допомогою мікропланшет-рідеру (наприклад, від Molecular Devices). Таблиця 5 Імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA) Антитіло TA99 CTA99 20D7 20D7S 20 25 30 Зв’язування з TYRP1 (EC50) (M) -10 4,010 -10 1,110 -10 1,110 -10 0,9810 Половину мінімальної ефективної концентрації (EC50) вимірюють у молях (M). Антитіла, у тому числі людське антитіло 20D7, людське антитіло 20D7S та антитіло CTA99, демонструють специфічне зв’язування з людським TYRP1 у імуноферментному твердофазному аналізі (ELISA). Протокова цитометрія Клітини 624mel обробляють впродовж 1 год на льоду людським IgG (5 мкг/мл) або моноклональними антитілами проти TYRP1 у 1% BSA/PBS. Клітини промивають (3) у 1% BSA/PBS, та інкубують їх впродовж 1 год з козячим антилюдським IgG, міченим флуоресцинізотіоціанатом (FITC). Клітини промивають, та проводять аналіз за допомогою прийнятного протокового цитометру, такого як протоковий цитометр Epics XL (Coulter). Протоковоцитометричний аналіз показує, що антитіла 20D7S, наведені як приклад у цьому описі, демонструють зв’язування з нативним TYRP1, експресованим людськими клітинними лініями SKmel28 та SKmel23, порівняно з контрольним людським IgG 1. Подібним же чином, протоковоцитометричний аналіз показує, що антитіла CTA99 та 20D7, наведені як приклад у цьому описі, демонструють зв’язування з нативним TYRP1, експресованим людською клітинною лінією 624mel, порівняно з контрольним людським IgG1. Поверхневий плазмонний резонанс/Аналіз за допомогою Biacore 14 UA 99339 C2 5 10 Кінетику зв’язування антитіл з рекомбінантним людським TYRP1 при температурі навколишнього лабораторного середовища (20-25C) визначають за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, за допомогою біодатчику Biacore (Pharmacia). TYRP1 іммобілізують на сенсорному чіпі CM5 дослідницького класу, і вводять антитіла з концентраціями у межах від 0,5 нМ до 100 нМ. Для кожної концентрації одержують сенсорограми, та оцінюють їх за допомогою програми BIA Evaluations 3.2 для визначення констант швидкості kon та koff. Kd, яку також позначають як k off, являє собою константу швидкості реакції дисоціації. Ka, яку також позначають як k on, являє собою константу швидкості реакції асоціації. KD є критерієм зв’язувальної спорідненості; обчислюють KD за співвідношенням констант швидкості koff/kon, визначених у молях (M). Узагальнені значення Ka, Kd та KD для антитіл, наведених у цьому описі як приклад, TA99, CTA99, 20D7 та 20D7S, наведені нижче у Таблиці 6. Таблиця 6 Кінетика зв’язування антитіл з рекомбінантним людським TYRP1 Антитіло TA99 CTA99 20D7 20D7S 15 20 25 30 Ka (1/Ms) kon 4 9,510 4 2,810 5 6,810 5 6,410 Kd (1/s) koff -4 1,610 -4 3,010 -4 1,910 -4 1,810 KD (M) -9 1,710 -9 1,110 -9 0,2810 -9 0,2810 Результати аналізу за допомогою Biacore зв’язування антитіл 20D7 та 20D7S з людським TYRP1 демонструють значну специфічну зв’язувальну спорідненість; таким чином, антитіла 20D7 та 20D7S є прийнятними кандидатами на роль терапевтичних антитіл. Аналіз комплементзалежної цитотоксичності (CDC) Людську лінію меланомних клітин 624mel тричі промивають, доводять до концентрації 106 життєздатних клітин/мл у прийнятному середовищі, такому як середовище AIM V (Invitrogen Life Technologies). Сто мікролітрів клітин висівають на 96-лункові планшети з круглим дном (Falcon), та інкубують згадані клітини з моноклональним антитілом 20D7 або hIgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, штат Пенсільванія), розпочинаючи з 3,7 мкг/мл (розбавлених 1:3), впродовж 1 год при температурі 37C. Додають кролячий комплемент low-Tox-M Rabbit complement (компанія Cedarlane Labs, Westbury, штат Нью-Йорк) (розбавлений 1:5 у AIM V) з розрахунку 50 мкл/лунку, та інкубують суміш впродовж 1 год при температурі 37C. Життєздатні клітини підраховують шляхом забарвлювання трипановим синім (Invitrogen Life Technologies). У Таблиці 7 наведений відсоток цитотоксичності при різних концентраціях антитіл у аналізі CDC. Данні демонструють, що антитіла 20D7 та CTA99 індукують CDC проти TYRP1 (+) людські клітини 624mel in vitro. Антитіло 20D7 ініціює дозозалежний комплементопосередкований лізис клітин 624mel з досягненням повного лізису у цьому аналіз при концентрації антитіла 3,7 мкг/мл. Відповідним чином, спостерігається сильна імунна ефекторна реакція на CDC у антитіл 20D7 та CTA99. % специфічного лізису=% цитотоксичності експериментальної культури% цитотоксичності негативного контролю. 35 Таблиця 7 Данні CDC, які демонструють активацію комплементу антитіла 20D7 та CTA99 Концентрація антитіла (мкг/мл) 3,7 1,23 0,41 0,14 0,05 40 CTA99 95% 54% 53% 17% 9,5% 20D7 100% 84% 38% 35% 24% Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (ADCC) проти людської меланоми in vitro Клітини 624mel збирають, та промивають їх прийнятним середовищем, таким як середовище AIM V (Invitrogen Life Technologies), і клітини висівають з густиною 10000 клітин/лунку у 100 мкл об’ємі на 96-лунковий планшет з U-подібним дном (Falcon). 15 UA 99339 C2 5 10 15 Додають антитіла (5 мкг/мл) у 50 мкл об’ємі, та інкубують суміш при температурі 37(C впродовж 0,5 год з клітинами-мішенями. Ефекторні клітини були додані у об’ємі 50 мкл з різними співвідношеннями E:T (ефектор:мішень). Після цього планшети інкубували впродовж 4 год при температурі 37(C. Після інкубування планшети центрифугували при 800 g, і 100 мкл супернатантів обережно переносили у 96-лункові планшети з пласким дном. Аналітичний реактив лактатдегідрогеназу був доданий за інструкціями виробника (компанія Roche), і планшети були зчитані при 490 нм. Контролі при проведенні аналізу: спонтанна мішень і максимальна мішень (шляхом додання 50 мкл 4% тритону). Лізис залежить від концентрації ефектор:мішень з лізисом 50% клітин-мішеней, що відбувається при відношенні 100:1. При фіксованій концентрації (5 мкг/мл) антитіла 20D7 та CTA99 активують лізис клітин624mel. Таблиця 8 показує відсоток клітинної цитотоксичності у присутності різних співвідношень між клітинами-ефекторами та пухлинними клітинами (відношення E:T) у ADCC аналізі. Антитіла 20D7S, 20D7 та CTA99 індукують ADCC проти TYRP1 (+) людські клітини 624mel in vitro. У 20D7S, 20D7 та CTA99 спостерігається сильна імунна ефекторна реакція на ADCC. % цитотоксичності=(експериментальна мішень-спонтанна мішень)/ (максимальна мішень-спонтанна мішень)100 Таблиця 8 ADCC проти людської меланоми in vitro Відношення E:T 100:1 50:1 25:1 12,5:1 20 25 30 35 40 45 50 % цитотоксичності 20D7S 56% 47% 43% 23% 20D7 43% 33% 31% 17% CTA99 49% 39% 17% 12% Аналізи стабільності антитіл 20D7S та 20D7 Антитіла 20D7 та 20D7S завантажують у гель для проведення SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію). Здійснюють процедуру на апараті BioRad до повного видалення барвнику бромофенолового синього. Окремі білки візуалізують за допомогою барвнику кумасі. При проведенні аналізу SDS-PAGE більш стійкі молекули спостерігаються у вигляді однієї смуги з декількома (а то й без них) вільними легкими та/або важкими ланцюгами; присутність вільних легких ланцюгів та вільних важких ланцюгів є свідченням менш стійких молекул. SDSPAGE антитіла 20D7 продемонстрував присутність явно вільних легких та важких ланцюгів. SDS-PAGE антитіла 20D7S продемонстрував дуже незначну кількість легких та важких ланцюгів. Відповідним чином, антитіло 20D7S є більш стійкою молекулою IgG1, ніж антитіло 20D7. Антитіла CTA99 та 20D7 ефективно лікують трансплантати людської меланоми. Для наведених нижче досліджень підшкірної пухлини об’єм пухлин обчислюють за формулою [/6(W1W2W2)], де W1 представляє найбільший діаметр пухлини, а W2 представляє найменший діаметр пухлини. %T/C=100(Об’єм після лікування/Вихідний об’єм)/(Контрольний об’єм/Вихідний об’єм). Статистичний аналіз проводять із застосуванням традиційного методу визначення рівня значущості (значення p). Для підшкірних досліджень значення p обчислюють, виходячи з об’єму пухлин тварин, які одержали антитіло проти TYPR, у порівнянні з об’ємом пухлин контрольних тварин. Для наведених нижче метастатичних досліджень пригнічення пухлин визначають шляхом підрахунку вузликів на поверхні легень. % пригнічення=100(кількість вузликів у контрольних тварин -кількість вузликів у тварин, які одержали лікування)/(кількість вузликів у контрольних тварин). Статистичний аналіз проводять із застосуванням традиційного методу визначення рівня значущості (значення p). Для метастатичних досліджень значення p обчислюють, виходячи з кількості вузликів, які спостерігаються у тварин, які одержали антитіло проти TYRP, у порівнянні з кількістю вузликів, які спостерігаються у контрольних тварин. In vivo активність застосованого окремо антитіла проти TYRP1 на моделях ксенотрансплантатів людської меланоми Культивовані клітини 624mel збирають, промивають та ресуспендують у розчині (50/50) матригелю та середовища RPMI 1640 (10% інактивованої теплом FBS). У випадку моделі 16 UA 99339 C2 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підшкірної пухлини вводять 210 клітин підшкірним шляхом у лівий бік “голих” мишей. Коли 3 пухлини досягнуть 200 мм , обробляють мишей антитілами проти TYRP1 або контрольним людським IgG; антитіла вводять тричі на тиждень у дозі 1 мг/мишу. Пухлини вимірюють штангенциркулем двічі на тиждень, і обчислюють відсоток T/C. Для визначення in vivo активності застосованого окремо антитіла проти TYRP1 на моделях ксенотрансплантатів людської меланоми ріст ксенотрансплантатів SKmel28 пригнічували обробкою антитілом 20D7 і порівнювали з людським контрольним IgG (T/C=51%; P=0,01 на 43 день). Було також показано, що встановлені пухлини 624mel суттєво пригнічувались обробкою антитілом 20D7. Ріст пухлин пригнічувався і досягнув рівня статистичної значущості на 16 день після початку обробки антитілами (T/C=44%; P=0,01). Додаткові ксенотрансплантати людської меланоми оцінювали на протипухлинну активність 20D7. Через 11 днів після початку обробки поодиноким антитілом 20D7 було показано значне пригнічення ліній клітин A375 та 1102mel (T/C=42%; P=0,01 та T/C=43%; P=0,004 для A375 та 1102mel, відповідно). Лізати шкіри різних видів інкубують з TA99 (5 мкг/мл) впродовж 2 год при кімнатній температурі. Після цього лізати осаджують білком А, та піддають електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDSPAGE) за відновних та невідновних умов із застосуванням чотирьох 12% градієнтних гелів. Після електрофорезу гелі переносять на мембрану полівініліденфториду (PVDF) (Invitrogen Life Technologies). Згадану мембрану зондують антитілом 20D7S (5 мкг/мл) з подальшим застосуванням міченого пероксидазою з хрону антилюдського IgG (Zymed, South San Francisco, штат Каліфорнія). Блот проявляють за допомогою хемілюмінесцентного субстрату (KPL, Gaithersburg, штат Меріленд). Данні показують, що антитіло 20D7 легко вступає у перехресну реакцію з мишачим TYRP1. Однак у жодної тварини, обробленої антитілом 20D7, явної токсичності не спостерігалось. Маса тіла та загальний вигляд у тварин, оброблених антитілом 20D7, у порівнянні з контрольними мишами, обробленими людським IgG, суттєво не відрізнялись. In vivo активність у залежності від дози застосованого окремо антитіла проти TYRP1 на моделях ксенотрансплантатів людської меланоми Клітини Skme128 змішують у розчині (50/50) матригелю та середовища RPMI 1640 (10% 6 інактивованої теплом FBS). Вводять 210 клітин підшкірним шляхом у лівий бік “голих” мишей. 3 Коли пухлини досягнуть 200 мм , обробляють мишей антитілами проти TYRP1 (6 мг/кг, 20 мг/кг або 60 мг/кг) або контрольним людським IgG тричі на тиждень. Пухлини вимірюють штангенциркулем двічі на тиждень, і обчислюють відсоток T/C. Результати дозозалежного дослідження антитіла 20D7 на ксенотрансплантатах SKme128 показали дозозалежну протипухлинну реакцію. Навіть у дозі 6 мг/кг пухлини значно пригнічувались антитілом 20D7 (T/C=69%; P