Модифікований білок лецитин-холестерин ацилтрансферази (lcat)

Реферат: Винахід належить до модифікованого білка лецитин-холестерин ацилтрансферази (LCAT) людини, що має заміну амінокислотного залишку С31 і де модифікований LCAT має підвищену ферментативну активність у порівнянні з нативним ферментом. Винахід також належить до фармацевтичної композиції, що містить даний білок, способу лікування LCAT-опосередкованого UA 103304 C2 (12) UA 103304 C2 порушення, способу підвищення рівнів HDL холестерину в індивіда та способу профілактики нагромадження холестерину. UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується в основному галузі медицини і, зокрема, стосується композицій і способів лікування коронарних захворювань серця, атеросклерозу, запальних захворювань і порушень, зв'язаних з утворенням тромбів. Попередній рівень техніки У більш 50 мільйонів американців виникають серцево-судинні порушення, і багато інших країн зіштовхуються з високим і усе більш зростаючим рівнем серцево-судинних захворювань. Це причина номер один смертності і втрати працездатності в Сполучених Штатах і в більшості країн Європи. На той час, коли виявляють серцеві порушення, основна причина, атеросклероз, звичайно вже досить прогресував, оскільки тривав протягом десятків років. Атеросклероз являє собою полігенне комплексне захворювання ссавців, що характеризується утворенням відкладень, або ліпідних бляшок і інших похідних крові, на стінках артерій (аорти, коронарних артерій і сонної артерії). З подальшим розвитком процесу ці бляшки можуть у більшій або меншій мірі кальцинуватися. Усі бляшки зв'язані з нагромадженням в артеріях жирових відкладень, що складаються в основному зі складних ефірів холестерину. Холестерин накопичується в ксантомних клітинах стінки артерії, при цьому просвіт судини звужується і кровоток зменшується. Зазначений процес супроводжується стовщенням стінки артерії, гіпотрофією гладких м'язів, появою ксантомних клітин і нагромадженням волокнистої з'єднувальної тканини. Таким чином, гіперхолестеринемія може привести до значних серцевосудинних патологій, таких як інфаркт, захворювання периферичних судин, порушення мозкового кровообігу, раптова смерть, серцева недостатність, удари тощо. Холестерин переноситься в крові різними ліпопротеїнами, що включають ліпопротеїн дуже низької щільності (VLDL), ліпопротеїн низкої щільності (LDL) і ліпопротеїн високої щільності (HDL). VLDL синтезується в печінці і перетворюється в LDL у крові, що дозволяє постачати периферичні тканини холестерином. Навпроти, HDL захоплює молекули холестерину з периферичних тканин і транспортує їх у печінку, де вони перетворюються в жовчні кислоти і виводяться. Розвиток атеросклерозу і ризик виникнення коронарної хвороби серця (CHD) зворотно пропорційні рівням HDL у сироватці. Gordon et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321: 1311; Goldbourt et al. (1997) Thromb Vase. Biol. 17: 107. Низькі рівні HDL холестерину часто виникають у зв'язку з ожирінням верхнього типу, діабетом і іншими ознаками метаболічного синдрому. Goldbourt et al., див. вище. Було висловлене припущення, що низькі рівні HDL холестерину зв'язані з підвищеним ризиком коронарної хвороби серця, у той час як високі концентрації HDL надають захисну дію проти розвитку раннього атеросклерозу. Gordon et al. (1986) Circulation 74: 1217. Дослідження показують, що ризик розвитку клінічного атеросклерозу в чоловіків падає на 2-3 % з кожним підвищенням на 1 мг/дл концентрації HDL у плазмі. Gordon et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321: 1311. Установлено, що концентрації LDL холестерину можна знизити шляхом лікування за допомогою статинів, інгібіторів ферменту біосинтезу холестерину 3гідроксиметилглутарилового коферменту А редуктази, і тому зазначене лікування використовували як успішний підхід до зниження ризику атеросклерозу, коли головним симптомом є високий рівень LDL. Проте, залишається нез'ясованим, або надають статини доброчинну дію на пацієнтів, в яких основною ліпідною аномалією є низький рівень HDL холестерину. Лецитин-холестерин ацилтрансфераза (LCAT) являє собою фермент, що каталізує етерифікацію вільного холестерину шляхом переносу ацильної групи з фосфатідилхоліну на 3гідроксильну групу холестерину з утворенням складного ефіру холестерину і лізофосфатідилхоліну. McLean et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 2335 і McLean et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14(23): 9397. LCAT синтезується в печінці і секретується в плазму, де вона поєднується з HDL, називаними ліпопротеїнами, що перешкоджають розвитку атеросклерозу. Зазначені частинки HDL здатні зв'язувати надлишок холестерину, що потім етерифікується в частинках за допомогою LCAT. Молекули складного ефіру холестерину в частинках HDL або безпосередньо транспортуються за допомогою рецептора SR-BI або за допомогою CETP транспортуються в apoB-вмісні ліпопротеїни, включаючи ліпопротеїни дуже низької щільності (VLDL) і LDL, і потім транспортуються в печінку по метаболічному шляху LDL-рецептора. Зазначений механізм, що називається зворотним транспортом холестерину (Glomset (1968) J. Lipid Res. 9:155), дозволяє видаляти надлишок холестерину з організму і, таким чином, втягується в процес запобігання розвитку атеросклерозу. LCAT відіграє ключову роль у зазначеному процесі за рахунок створення градієнта холестерину між плазменними мембранами і циркулюючими ліпопротеїнами. Даний винахід стосується модифікованих білків LCAT, що володіють підвищеною ферментною активністю і/або стабільністю, а також способів лікування коронарної хвороби 1 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 серця, атеросклерозу, запальних захворювань і порушень, опосередкованих тромбозом, з використанням зазначених модифікованих білків LCAT. Суть винаходу Даний винахід стосується модифікованих білків LCAT, що містять амінокислотну заміну послідовності білка LCAT дикого типу. Відповідно до одного з аспектів, модифікований білок LCAT ферментативно більш активний, ніж білок LCAT дикого типу, з якого одержують модифікований білок LCAT. Відповідно до другого аспекту, модифікований білок LCAT у більшій мірі підвищує рівні ліпопротеїнів високої щільності (HDL), чим білок LCAT дикого типу, з якого одержують модифікований білок LCAT. Відповідно до ще одного аспекту, модифікований білок LCAT більш стійкий in vivo або є менш імуногенним, ніж білок дикого типу, з якого він одержаний. В одному з варіантів здійснення даного винаходу модифікований білок LCAT містить амінокислотну заміну в положенні 31 послідовності SEQ ID NO:1, або в положенні ортологічної амінокислотної послідовності білка LCAT, що відповідає положенню 31 у SEQ ID NO:1. Відповідно до різних аспектів, модифікований білок LCAT одержують з білка LCAT людини, кролика, мавпи, хом'яка, миші або щура дикого типу. В іншому варіанті здійснення даного винаходу модифікований білок LCAT одержаний з амінокислотної послідовності LCAT дикого типу SEQ ID NO:1 і включає заміну в положенні F1, L3, L4, N5, L7, C31, N384 або E416. Відповідно до різних аспектів, заміна являє собою F1A, F1G, F1I, F1L, F1M, F1P, F1V, F1C, F1Y, F1T, F1Q, F1N, F1H або F1D. Відповідно до інших аспектів, заміна являє собою L3I, L3F, L3C, L3W або L3Y. Відповідно до інших аспектів, заміна являє собою L4A, L4I, L4M, L4F, L4V, L4W, L4Y, L4T, L4Q або L4R. Нарешті, відповідно до інших аспектів, заміна являє собою N5A, N5M, N5H, N5K, N5D або N5E. Відповідно до інших аспектів, заміна являє собою L7M, L7F або L7E. Відповідно до інших аспектів, заміна являє собою C31A, C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R або C31H. Відповідно до інших аспектів, заміна являє собою N384C, N384Q або E416C. В інших варіантах здійснення даного винаходу модифікований білок LCAT містить заміну в положенні З31 послідовності SEQ ID NO:1 і заміну в положенні амінокислотного залишку F1, L4, N5, V28, P29, G30, L32, G33 або N34. Відповідно до різних аспектів, заміна являє собою F1A, L4F, N5E, N5Q, N5D, N5A, V28A, V28I, V28C, V28T, V28R, P29G, P29F, P29T, G30A, G301, L32A, L32I, L32M, L32F, L32C, L32W, L32Y, L32T, L32S, L32N, L32H, L32E, G33I, G33M, G33F, G33S, G33H, N34A, N34C, N34S або N34R. Відповідно до інших аспектів, заміна в положенні 31 являє собою C31A, C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R або C31H. Відповідно до іншого аспекту, модифікований білок LCAT включає заміну C31Y і додаткову заміну F1, L4, L32 або N34 і, відповідно до деяких аспектів, зазначеними замінами є F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F або L32H. В інших варіантах здійснення даного винаходу описуваний в описі модифікований білок LCAT включає "носій" і, відповідно до різних аспектів даного винаходу, зазначеним "носієм" є константна область імуноглобуліну (Fc) або водорозчинний полімер і, зокрема, водорозчинний полімер, що являє собою поліетиленгліколь. В інших варіантах здійснення даного винаходу пропонований модифікований LCAT включає N-кінцеву область амінокислотної послідовності білка LCAT дикого типу, що дуплікований і ковалентно приєднаний до кінця модифікованого білка LCAT. Відповідно до одного аспекту, Nкінцева область амінокислотної послідовності білка LCAT дикого типу складає від 10 до 15 амінокислот у довжину. Відповідно до інших аспектів, область амінокислотної послідовності LCAT дикого типу дуплікована і ковалентно приєднана до N-кінця модифікованого білка LCAT, до С-кінця модифікованого білка LCAT або до обох кінців. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить пропонований у даному винаході модифікований білок LCAT і фармацевтично прийнятний носій. Винахід також стосується способу лікування LCAT-опосередкованого порушення, що включає стадії введення пропонованого в даному винаході модифікованого білка LCAT у кількості, ефективній для лікування зазначеного порушення. У різних варіантах здійснення даного винаходу модифікований LCAT уводять або внутрішньовенно у вигляді болюса. Відповідно до різних аспектів способів лікування, LCAT-опосередкованим порушенням є атеросклероз, запалення, тромбоз, коронарна хвороба серця, підвищений кров'яний тиск, синдром дефіциту LCAT, хвороба Альцгеймера, помутніння роговиці, метаболічний синдром, дисліпідемія, інфаркт міокарда, удар, критична ішемія кінцівок і/або стенокардія. Винахід також стосується способу підвищення в індивіда HDL холестерину, що включає стадію введення зазначеному індивіду терапевтично ефективної кількості пропонованого в даному винаході модифікованого білка LCAT. 2 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід також стосується способу профілактики нагромадження в індивіда холестерину, що включає введення терапевтично ефективної кількості пропонованого в даному описі модифікованого білка LCAT. Опис креслень На фіг. 1 наведені реєстраційні депозитарні номери комп'ютерного банку даних Genbank для білків LCAT дикого типу, з яких можна одержати модифіковані білки LCAT. Докладний опис винаходу I. Визначення Термін "LCAT", або "лецитин-холестерин ацилтрансфераза" в описі стосується глікопротеїнового ферменту дикого типу, що каталізує синтез складних ефірів холестерину і лізолецитину з фосфатідилхоліну і неетерифікованого холестерину, що присутні у ліпопротеїнах. Зазначений фермент продукується в основному печінкою і циркулює в крові в зворотно зв'язаному з ліпопротеїнами вигляді. Маса поліпептиду LCAT людини (SEQ ID NO:1; реєстраційний депозитарний номер Genbank № ААВ34898) складає 49 кДа або приблизно 67 кДа разом з масою вуглеводу. Різні амінокислотні послідовності LCAT, які можна використовувати для одержання модифікованого білка LCAT згідно з даним винаходом представлені на фіг. 1. LCAT людини (SEQ ID NO:1; реєстраційний депозитарний номер Genbank № ААВ34898) FWLLNVLFPP HTTPKAELSN HTRPVILVPG CLGNQLEAKL DKPDVVNWMC YRKTEDFFTI WLDLNMFLCL GVDCWIDNTR VVYNRSSGLV SNAPGVQIRV PGFGKTYSVE YLDSSKLAGY LHTLVQNLVN NGYVRDETVR AAPYDWRLEP GQQEEYYRKL AGLVEEMHAA YGKPVFLIGH SLGCLHLLYF LLRQPQAWKD RFIDGFISLG APWGGSIKPM LVLASGDNQG IPIMSSIKLK EEQRITTTSP WMFPSRMAWP EDHVFISTPS FNYTGRDFQR FFADLHFEEG WYMWLQSRDL LAGLPAPGVE VYCLYGVGLP TPRTYIYDHG FPYTDPVGVL YEDGDDTVAT RSTELCGLWQ GRQPQPVHLL PLHGIQHLNM VFSNLTLEHI NAILLGAYRQ GPPASPTASP EPPPPE Термін "модифікований LCAT" стосується лецитин-холестерин ацилтрансферази, визначення якої дано вище, у якій одна або кілька амінокислот у білку LCAT дикого типу замінені іншою амінокислотою, або одна або кілька амінокислот додані або до кінця, або в середину LCAT дикого типу, з якого одержаний модифікований білок LCAT. Передбачається, що модифіковані білки LCAT мають поліпшені фармакокінетичні властивості, у порівнянні з білком LCAT дикого типу, з якого одержаний модифікований білок LCAT. Зокрема, модифікований білок LCAT володіє або (i) підвищеною ферментативною активністю, у порівнянні з білком LCAT дикого типу, з якого одержаний модифікований білок LCAT, при визначенні зазначеної активності в аналогічних умовах проведення in vitro аналізу, або (ii) більшою здатністю підвищувати рівні HDL in vivo, у порівнянні з білком LCAT дикого типу, з якого одержаний модифікований білок LCAT, або (iii) підвищеною стабільністю в плазмі або збільшеним напівперіодом існування, тобто збільшеним напівперіодом циркулювання, у порівнянні зі стабільністю в плазмі білка LCAT дикого типу, з якого одержаний модифікований білок LCAT, і/або (iv) зниженою імуногенністю (тобто він викликає більш слабку імунну відповідь), у порівнянні з білком LCAT дикого типу, з якого одержаний модифікований білок LCAT. Аналізи для визначення ферментативної активності LCAT включають, наприклад, apoAI-ліпосомний аналіз і застосування аналізу активності LCAT у плазмі, за допомогою якого визначають швидкість етерифікації холестерину в штучній системі й у фізіологічно значимій системі, відповідно. Аналізи для визначення стабільності LCAT in vivo включають аналіз ELISA, в якому визначають напівперіод існування рекомбінантного білка LCAT у крові після введення білка LCAT. Біологічно активними фрагментами модифікованого білка LCAT вважаються такі фрагменти, що включають зміни амінокислот, внесені в амінокислотну послідовність LCAT дикого типу. Терміни "дериватизація", "перетворення в похідне" або "одержання похідного" включають способи й одержання модифікованих білків LCAT, у яких, наприклад, але без обмеження, (1) сполука має циклічну частину; наприклад, містить поперечні зв'язки між цистеїнільними залишками усередині сполуки; (2) сполука структурована або має область для утворення поперечних зв'язків; наприклад, сполука має цистеїнільний залишок і, таким чином, утворює поперечно зшиті димери в культурі або in vivo; (3) один або декілька пептидильних зв'язків замінені непептидильним зв'язком; (4) N-кінець заміщений -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, сукцинімідною групою або заміщеним або незаміщеним бензилоксикарбоніл-NH-, де R і R1, а також замісники в кільці будуть визначені нижче в даному описі; (5) C-кінець замінений -C(O)R2 або -NR3R4, де R2, R3 і R4 будуть визначені нижче в даному описі; і (6) сполуки, в яких окремі фрагменти амінокислот модифіковані шляхом обробки реагентами, здатними взаємодіяти з вибраними бічними ланцюгами або кінцевими залишками. 3 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перетворення в похідне модифікованого білка LCAT не приводить до додаткової зміни амінокислотної послідовності модифікованого білка LCAT, за винятком тих випадків, коли дериватизація включає додавання одного або декількох амінокислотних залишків до С-кінця модифікованої амінокислотної послідовності білка LCAT, до N-кінця модифікованої амінокислотної послідовності білка LCAT або одночасно до С-кінця і N-кінця модифікованої амінокислотної послідовності білка LCAT. Крім того, модифікований білок LCAT може бути змінений шляхом модифікації бічного ланцюга амінокислотного залишку, за умови, що з об'єму даного винаходу виключена модифікація бічного ланцюга цистеїна в положенні 31 у послідовності дикого типу LCAT людини і відповідних цистеїнових залишків у гомологічних білках людини й ортологічних білках, що ідентифікують шляхом порівняльного аналізу первинної структури амінокислотної послідовності, включаючи необхідні двониткові розриви. Крім того, варто розуміти, що щораз, коли "модифікований білок LCAT" приводиться в даному описі, зазначений варіант даного винаходу стосується також і похідного сполуки модифікованого білка LCAT. Термін "фармакологічно активний" означає, що для описуваної речовини встановлено, що вона має активність, що впливає на значимий з медичної точки зору параметр (зокрема, на кров'яний тиск, аналіз крові, рівень холестерину) і хворобливий стан (зокрема, на атеросклероз, запальні або тромботичні порушення). Термін "фармакологічно прийнятна сіль" охоплює будь-які солі, для яких відомо, що вони є фармакологічно прийнятними, або для яких буде встановлено, що вони є фармакологічно прийнятними. Деякими конкретними прикладами є: ацетат; трифторацетат; солі галогеноводневих кислот, такі як гідрохлориди і гідроброміди; сульфат; цитрат; тартрат; гліколят і оксалат. "Власне кажучи гомогенний", як використовується в даному описі стосовно до препарату згідно з даним винаходом, означає, що препарат містить єдиний варіант терапевтичної сполуки, що виявляється при одержанні всіх терапевтичних молекул у препараті, якщо не зазначене інше, у вигляді конкретного процентного вмісту всіх терапевтичних молекул. Як правило, власне кажучи гомогенний препарат досить однорідний і має переваги гомогенного препарату, зокрема, легкістю використання в клінічних умовах за рахунок більшої передбачуваності фармакокінетичних властивостей при переході від однієї партії препарату до іншої. "Біоефективність" стосується здатності викликати бажаний біологічний ефект. Біоефективність різних сполук або різних дозувань тієї самої сполуки і різних способів введення тієї самої сполуки, як правило, нормують по кількості сполуки(сполук) для того, щоб можна було провести адекватне порівняння. "Атеросклероз" стосується стану, що характеризується підвищенням твердості і/або звуженням артерій, викликаним осадженням атеросклеротичних бляшок на стінках артерій. Атеросклеротична бляшка включає три компоненти, (1) атеросклеротична бляшка, вузелкове нагромадження м'якої пластівчастої речовини в центрі великих бляшок, складених з макрофагів у найближчого просвіту артерії; (2) підлягаючі області кристалів холестерину; (3) кальцинування на зовнішній основі більш розвитинутих уражень. Симптоми атеросклерозу включають, наприклад, розвиток бляшок в артеріях, їхнє кальцинування, міру якого можна визначити шляхом фарбування барвником Sudan IV, або розвиток ксантомних клітин в артеріях. Звуження артерій можна встановити за допомогою коронарної ангіопластики, надшвидкої комп'ютерної томографії або ультразвуку. "Запалення" або "запальне порушення" стосується локалізованої захисної реакції, викликуваної ушкодженням або деструкцією тканин, призначення якої полягає в тому, щоб зруйнувати, розбавити або ізолювати, як ушкоджуючий агент, так і уражену тканину. Термін "запальне захворювання" або "запальний стан", як використано в даному описі, означає будьяке захворювання, при якому надмірна або нерегульована запальна реакція приводить до надмірних запальних симптомів, ушкодженню тканини хазяїна або втраті виконуваних тканиною функцій. Крім того, термін "аутоімунна хвороба", як використано в даному описі, означає будьяку групу порушень, в яких ушкодження тканини зв'язане з гуморальними або опосередкованими клітинами відповідними реакціями на власні складові частини організму. Термін "алергійне захворювання", як використано в даному описі, означає будь-які викликані алергією симптоми, ушкодження тканини або втрату виконуваних тканиною функцій. Термін "артрит", як використано в даному описі, означає будь-яке велике сімейство захворювань, що характеризуються запальними ураженнями суглобів, що належать до різних етіологій. Термін "дерматит", як використано в даному описі, означає будь-яке велике сімейство захворювань шкіри, що характеризуються запаленням шкіри, що належать до різних етіологій. Термін "відторгнення трансплантату", як використано в даному описі, означає будь-яку імунну реакцію, 4 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спрямовану проти трансплантованої тканини (включаючи орган і клітину (наприклад, кістковий мозок)), що характеризується втратою функції трансплантованої тканини і навколишньої тканини, болем, утворенням пухлини, лейкоцитозом і тромбоцитопенією. "Тромбоз" і "опосередковане тромбозом порушення" стосується патологічного утворення тромбів, що викликає закупорку кровоносних судин і приводить до виникнення станів, зв'язаних з подібною закупоркою. Кровоносні судини функціонують в умовах значних зсувових напруг, що є функцією швидкості зрушення потоку крові. Часто спостерігається ушкодження невеликих кровоносних судин і капілярів. У випадку ушкодження зазначених судин для зупинки кровотечі включається процес гемостазу. У звичайних умовах подібне ушкодження супроводжується послідовністю подій, що звичайно називають "утворенням тромбу". Утворення тромбу залежить від адгезії, активації й агрегування тромбоцитів, а також каскаду процесів коагуляції, вищою стадією розвитку яких є перетворення розчинного фібриногену в згусток нерозчинного фібрину. Утворення тромбу на місці рани перешкоджає транссудації компонентів крові із судин тканини. Потім відбувається заліковування тканини і розчинення згустку, і, тим самим, відновлюється цілісність кровоносної судини і кровоток. Термін "HDL" стосується ліпопротеїнів високої щільності. Термін "LDL", як використано в даному описі, означає ліпопротеїни низкої щільності. Термін "VLDL" стосується ліпопротеїнів дуже низької щільності. Термін "лікування" включає введення індивіду, при необхідності, фармакологічно активної кількості модифікованого білка LCAT згідно з даним винаходом, що придушує, послабляє або припиняє розвиток, наприклад, патологічного атеросклерозу, запального порушення або зв'язаного з тромбозом порушення. Відповідно до іншого аспекту, лікування в даному описі означає ведення індивіду, при необхідності, кількості сполуки згідно з даним винаходом, що, у випадку атеросклерозу, приводить до підвищення рівнів HDL холестерину. Варто розуміти, що "придушення" у випадку атеросклерозу означає профілактику, стабілізацію або припинення утворення або росту атеросклеротичних бляшок, запального порушення або зв'язаного з тромбозом порушення. Варто розуміти, що в даному описі лікування захворювань і порушень включає також терапевтичне введення модифікованого білка LCAT згідно з даним винаходом (або його фармацевтичної солі, похідного або проліків) або фармацевтичної композиції, що містить модифікований білок LCAT, індивіду, що, як думають, має потребу в лікуванні таких захворювань і порушень, як, наприклад, запальні порушення, тромботичні порушення, коронарна хвороба серця, високий кров'яний тиск, синдром дефіциту LCAT, хвороба Альцгеймера, помутніння роговиці, метаболічний синдром, дисліпідемія, інфаркт міокарда, удар, критична ішемія кінцівок, стенокардія тощо. Лікування охоплює також введення модифікованого білка LCAT або фармацевтичної композиції індивідам, яким не встановлений діагноз, що припускає необхідності проведення подібного лікування, тобто профілактичне введення індивіду, для профілактики зазначеного стану або порушення. Як правило, індивіду спочатку ставить діагноз дипломований лікар або компетентний практикуючий лікар, і потім рекомендуються або пропонуються схеми призначення модифікованого(их) білка(ів) LCAT або композицій згідно з даним винаходом. Вираз "терапевтично ефективна кількість" означає кількість сполуки згідно з даним винаходом, що дозволяє досягти ослаблення тяжкості порушення і зниженні частоти його виникнення. Ослаблення тяжкості порушення включає, наприклад, у випадку атеросклерозу, профілактику нагромадження холестерину на стінках судин, підвищення в крові рівнів HDL холестерину або припинення атеросклерозу, а також уповільнення розвитку атеросклерозу, профілактику або лікування запальних порушень і профілактику або лікування опосередкованих тромбозом порушень. Варто розуміти, що в даному описі термін "індивід" означає людину або іншого ссавця, що страждає від атеросклерозу або який підданий ризику розвитку атеросклерозу, запального порушення або опосередкованого тромбозом порушення. Подібні індивіди можуть страждати або піддаватися ризику розвитку таких станів, як, наприклад, запалення, тромбоз, коронарна хвороба серця, високий кров'яний тиск, синдром дефіциту LCAT, хвороба Альцгеймера, помутніння роговиці, метаболічний синдром, дисліпідемія, інфаркт міокарда, удар, критична ішемія кінцівок, стенокардія тощо. Прогностичні і клінічні симптоми зазначених станів відомі в даній галузі. II. Модифіковані білки LCAT А. Методи аналізів Методи аналізу для визначення ферментативної активності LCAT, стабільності в плазмі (напівперіоду існування ферменту в плазмі) або рівнів білка LCAT у плазмі відомі в даній галузі. Абсолютна активність LCAT у сироватці і швидкість ендогенної етерифікації холестерину може 5 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути визначена, як описано, наприклад, Albers J. et al. (1986) у Methods in Enzymol. 129: 763-783; Dobiasova M. et al. (1983) Adv. Lipid Res. 20: 107-194. Відповідно до одного аспекту, активність LCAT можна визначити шляхом вимірювання перетворення холестерину, що містить радіоактивну мітку, в складний ефір холестерину після інкубації LCAT і субстратів LCAT, що включають Apo A-I, які містять радіоактивну мітку. Швидкість етерифікації холестерину (CER, нмоль CE/мл на годину) можна вимірити шляхом визначення швидкості перетворення холестерину, що містить мітку, в складний ефір холестерину після інкубування в плазмі, що містить радіоактивну мітку у вигляді слідових кількостей радіоактивного холестерину, при 14 зрівноважуванні із сумішшю [ C]холестерин-альбумін при 4С. Швидкість ендогенної етерифікації холестерину (яку визначають аналізом активності LCAT у плазмі) залежить не тільки від маси LCAT, але і від типу і кількості субстрату LCAT і кофактора, присутнього у сироватці, і, таким чином, забезпечує краще визначення терапевтичної активності LCAT. Методи аналізу з метою визначення стабільності LCAT (напівперіоду існування) у крові і визначення концентрації білка LCAT у плазмі також відомі в даній галузі. Після введення рівні рекомбінантного білка LCAT можуть бути визначені по методу ELISA, який описаний у J.R. Crowther: ELISA theory and practice, methods in molecular Biology Volume 42. Реагенти для визначення стабільності LCAT і концентрації білка включають антитіла проти LCAT, що комерційно доступні від декількох виробників. Приклади використання зазначених аналізів для визначення активності і/або стабільності модифікованого LCAT наведені нижче. В. Амінокислотні модифікації Винахід стосується модифікованих білків LCAT, що включають амінокислотні заміни в амінокислотній послідовності білка LCAT дикого типу. Оскільки амінокислотна послідовність у білку LCAT дикого типу модифікується шляхом заміни однієї або декількох амінокислот, то, відповідно до одного аспекту, модифікований білок LCAT являє собою білок, що не зустрічається в природі. Модифіковані білки LCAT одержують з будь-якого білка LCAT дикого типу, і приклади білків LCAT дикого типу наведені на фіг. 1. Для аспектів даного винаходу, що включають лікування станів людини, які виникають внаслідок порушень, опосередкованих LCAT, даний винахід стосується модифікованих білків LCAT, в яких білок LCAT людини модифікований, для включення однієї або декількох амінокислотних замін або одного або декількох амінокислотних додавань, і, відповідно до одного аспекту, амінокислотна послідовність дикого типу LCAT людини представлена як SEQ ID NO:1. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що при описі конкретних амінокислот у послідовності білка LCAT людини, представленої як SEQ ID NO:1, розглядаються і передбачаються ті ж самі або схожі модифікації тих же самих або відповідних амінокислотних залишків в інших амінокислотних послідовностях LCAT людини (тобто, алельні варіанти й інші, що зустрічаються в природі послідовності LCAT) або в ортологічних амінокислотних послідовностях LCAT людини. Що стосується SEQ ID NO:1, то розглядаються амінокислотні заміни (для позначення амінокислот використовують одну букву, за якою йде вказівка положення в послідовності білка, тобто "F1" вказує на фенілаланін у положенні 1 у SEQ ID NO:1): F1, W2, L3, L4, N5, V6, L7, F8, P9, P10, H11, T12, T13, P14, K15, A16, E17, L18, S19, N20, H21, T22, R23, P24, V25, I26, L27, V28, P29, G30, C31, L32, G33, N34, Q35, L36, E37, A38, K39, L40, D41, K42, P43, D44, V45, V46, N47, W48, M49, C50, Y51, R52, K53, T54, E55, D56, F57, F58, T59, I60, W61, L62, D63, L64, N65, M66, F67, L68, C69, L70, G71, V72, D73, C74, W75, I76, D77, N78, T79, R80, V81, V82, Y83, N84, R85, S86, S87, G88, L89, V90, S91, N92, A93, P94, G95, V96, Q97, I98, R99, V100, P101, G102, F103, G104, K105, T106, Y107, S108, V109, E110, Y111, L112, D113, S114, S115, K116, L117, A118, G119, Y120, L121, H122, T123, L124, V125, Q126, N127, L128, V129, N130, N131, G132, Y133, V134, R135, D136, E137, T138, V139, R140, A141, A142, P143, Y144, D145, W146, R147, L148, E149, P150, G151, Q152, Q153, E154, E155, Y156, Y157, R158, K159, L160, A161, G162, L163, V164, E165, E166, M167, H168, A169, A170, Y171, G172, K173, P174, V175, F176, L177, I178, G179, H180, S181, L182, G183, C184, L185, H186, L187, L188, Y189, F190, L191, L192, R193, Q194, P195, Q196, A197, W198, K199, D200, R201, F202, 1203, D204, G205, F206, I207, S208, L209, G210, A211, P212, W213, G214, G215, S216, I217, K218, P219, M220, L221, V222, L223, A224, S225, G226, D227, N228, Q229, G230, I231, P232, I233, M234, S235, S236, 1237, K238, L239, K240, E241, E242, Q243, R244, I245, T246, T247, T248, S249, P250, W251, M252, F253, P254, S255, R256, M257, A258, W259, P260, E261, D262, H263, V264, F265, I266, S267, T268, P269, S270, F271, N272, Y273, T274, G275, R276, D277, F278, Q279, R280, F281, F282, A283, D284, L285, H286, F287, E288, E289, G290, W291, Y292, M293, W294, L295, Q296, S297, R298, D299, L300, L301, A302, G303, L304, P305, A306, P307, G308, V309, E310, V311, Y312, C313, L314, Y315, G316, V317, G318, L319, P320, T321, P322, R323, T324, Y325, I326, Y327, D328, H329, G330, F331, P332, Y333, T334, D335, P336, V337, G338, 6 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 V339, L340, Y341, E342, D343, G344, D345, D346, T347, V348, A349, T350, R351, S352, T353, E354, L355, C356, G357, L358, W359, Q360, G361, R362, Q363, P364, Q365, P366, V367, H368, L369, L370, P371, L372, H373, G374, I375, Q376, H377, L378, N379, M380, V381, F382, S383, N384, L385, T386, L387, E388. H389, I390, N391, A392, I393, L394, L395, G396, A397, Y398, R399, Q400, G401, P402, P403, A404, S405, P406, T407, A408, S409, P410, E411, P412, P413, P414, P415 і/або E416. Амінокислоти в одному або декількох із зазначених положень замінені природними або неприродними амінокислотами. Наприклад, але без обмеження, модифікований LCAT включає заміну C31Y і заміну одного або декількох амінокислотних залишків F1, L4, L32 і N34. Відповідно до одного аспекту, зазначеною другою заміною є F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F і/або L32H. Відповідно до різних аспектів даного винаходу, пропонуються особливі заміни. Наприклад, але, не обмежуючись ними, залишок аліфатичної амінокислоти (G, A, V, L або I) замінений іншим аліфатичним залишком, залишок ароматичної амінокислоти (F, Y або W) замінений іншим ароматичним залишком, залишок з гідроксильним аліфатичним бічним ланцюгом (S або T) замінений іншим залишком з гідроксильним аліфатичним бічним ланцюгом, основний залишок (K, R або H) замінений іншим залишком основної амінокислоти, кислий залишок (D або E) замінений іншим залишком кислої амінокислоти, залишок з амідним бічним ланцюгом (N або Q) замінений іншим залишком з амідним бічним ланцюгом, гідрофобний залишок (норлейцин, M, A, V, L або I) замінений іншим гідрофобним залишком, залишок нейтральної амінокислоти (C, S, T, N або Q) замінений іншим нейтральним залишком, залишок, що впливає на орієнтацію ланцюга (G або P), замінений іншим залишком, що впливає на орієнтацію ланцюга, і/або залишок, що містить сірку в бічному ланцюзі (C або M), замінений іншим залишком, що містить сірку в бічному ланцюзі. В інших аспектах, також без обмеження, в амінокислотну послідовність LCAT дикого типу вводять консервативні заміни. Таблиця 1 Вихідний замісник A R N D C Q E G H I L K M F S T W Tyr Val Приклади консервативних замін G, S K Q, H E S N D A, P N, Q L, V I, V R, Q, E L, Y, I M, L, Y T S Y W, F I, L Інші розглянуті в даному описі заміни включають, але не обмежуються ними, заміни, наведені нижче в таблиці 2. 30 7 UA 103304 C2 Таблиця 2 Вихідна амінокислота A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V 5 10 15 20 25 30 35 Приклади замін V, L, I K, Q, N Q E S, A N D P, A N, Q, K, R L, V, M, A, F, норлейцин норлейцин, I, V, M, A, F R, 1,4-діаміномасляна кислота, Q, N L, F, I L, V, I, A, Y A T, A, C S Y, F W, F, T, S I, M, L, F, A, норлейцин С. Похідні На додаток до наведених в даному описі модифікованих білків LCAT, передбачається, що наведений вище модифікований білок LCAT може бути замінений іншими "похідними" модифікованих білків LCAT. Подібні похідні можуть поліпшити розчинність, усмоктування, біологічний напівперіод існування і подібні властивості зазначених сполук. Альтернативно, подібні ланки в структурі хімічних сполук можуть усувати або послабляти будь-які небажані побічні ефекти зазначених сполук тощо. Подібні похідні модифікованих білків LCAT включають такі похідні, у яких: 1. Модифіковані білки LCAT або деякі їхні частини є циклічними. Наприклад, пептидна частина може бути модифікована так, щоб містити два або кілька залишків цистеїну (зокрема, в лінкері), що здатні циклізуватися за рахунок утворення дисульфідного зв'язку. 2. Модифікований білок LCAT є зшитим або йому додана здатність утворювати перехресні зв'язки між молекулами. Наприклад, пептидна частина може бути модифікована так, щоб містити один залишок цистеїну і, таким чином, додати здатність утворювати міжмолекулярний зв'язок з аналогічною молекулою. Білок також може бути зшитий за допомогою його С-кінця. 3. Один або декілька пептидильних [-C(O)NR-] зв'язків замінені непептидильним зв'язком. Прикладами непептидильних зв'язків є -СН2-карбамат [-CH2-OC(O)NR-], фосфонат, -CH2сульфонат [-CH2-S(O)2NR-], сечовина [-NHC(O)NH-], -CH2-вторинний амін і алкілпептид [C(O)NR6-, де R6 означає нижчий алкіл]. 4. N-кінець дериватизований. Як правило, N-кінець може бути ацилований або 1 перетворений у заміщений амін. Приклади N-кінцевих похідних груп включають -NRR 1 1 1 1 (відмінний від -NH2), -NRC(O)R , -NRC(O)OR , -NRS(O)2R , -NHC(O)NHR , сукцинімід або 1 бензилоксикарбоніл -NH-(CBZ-NH-), де R і R кожен незалежно означають атом водню або 1 нижчий алкіл, за умови, що R і R обидва не є атомом водню, і де фенільне кільце може бути заміщено 1-3 замісниками, вибраними з групи, що складається з C 1-C4алкілу, C1-C4алкокси, атома хлору й атома брому, сукцинімідну групу, бензилоксикарбонільну -NH-(CBZ-NH-) групу; і пептиди, де С-кінець перетворений у -C(O)R2, де R2 вибраний із групи, що складається з 3 4 3 4 нижчого алкокси і NR R , де R і R незалежно вибрані з групи, що складається з атома водню і нижчого алкілу. Під "нижчою" розуміють групу, що містить від 1 до 6 атомів вуглецю. 5. С-кінець дериватизований. Як правило, С-кінець етерифікують або амідують. Наприклад, можна використовувати способи, описані в даній галузі для додавання (NH-CH2-CH2-NH2)2 до Скінця сполук згідно з даним винаходом. Аналогічно, можна використовувати описані в даній галузі способи введення -NH2 у С-кінець сполук згідно з даним винаходом. Приклади С-кінцевих 8 UA 103304 C2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4 3 похідних груп включають, наприклад, -C(O)R2, де R2 означає нижчий алкокси або -NR R , де R і 4 R незалежно означають атом водню або C1-C8алкіл (або C1-C4алкіл). 6. Дисульфідний зв'язок замінений іншим, наприклад, більш стабільним фрагментом, що зшиває, (зокрема, алкіленом). Див., зокрема, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9. 7. Модифікований один або кілька індивідуальних амінокислотних залишків. Відомі різні агенти для перетворення в похідне, які специфічно взаємодіють з вибраними бічними ланцюгами або кінцевими залишками, як докладно описано нижче. Крім того, модифікації індивідуальних амінокислот в амінокислотній послідовності модифікованого LCAT можуть бути здійснені шляхом взаємодії необхідних амінокислотних залишків білка з органічним агентом для перетворення в похідне, здатним реагувати з вибраними бічними ланцюгами або кінцевими залишками. Приклади наведені нижче. Лізинільні й аміно кінцеві залишки можуть бути піддані взаємодії з ангідридом бурштинової кислоти або ангідридами інших карбонових кислот. Дериватизація за допомогою зазначених агентів здатна звертати заряд лізинільних залишків. Інші придатні реагенти для перетворення в похідне альфа-аміновмісних залишків включають імідоефіри, такі як метилпіколінімідат; піридоксальфосфат; піридоксаль; хлорборгідрид; тринітробензолсульфонову кислоту; Ометилізосечовину; 2,4-пентандіон і каталізовану трансаміназою реакцію з гліоксилатом. Аргінільні залишки можуть бути модифіковані по реакції з одним або декількома звичайними реагентами, такими як фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон, 1,2-циклогександіон і нінгідрин. Перетворення в похідне залишків аргініну вимагає проведення реакції в лужному середовищі через високі значення pKa гуанідинової функціональної групи. Більш того, зазначені реагенти можуть взаємодіяти з групами лізина, а також гуанідиновою групою аргініну. Конкретні модифікації залишків тирозилу інтенсивно вивчалися самі по собі, при цьому особливий інтерес представляло введення спектральних міток у залишки тирозилу по реакції з ароматичними діазонієвими сполуками або з тетранітрометаном. Найбільш часто, Nацетилімідазол і тетранітрометан використовують для одержання похідних О-ацетилтирозилу і 3-нітропохідних, відповідно. Карбоксильні бічні групи (аспартил або глутаміл) можуть бути селективно модифіковані по реакції з карбодіімідом (R'-N=C=N-R'), таким як 1-циклогексил-3-(2-морфолініл-(4етил)карбодіімід або 1-етил-3-(4-азоній-4,4-диметилпентил)карбодіімід. Більш того, залишки аспартилу і глутамілу можуть бути перетворені в залишки аспарагінілу і глутамінілу по реакції з іонами амонію. Залишки глутамінілу й аспарагінілу часто деамінують у відповідні залишки глутамілу й аспартилу. Альтернативно, зазначені залишки можуть бути деаміновані в помірних кислих умовах. Будь-яка форма зазначених залишків входить в об'єм даного винаходу. Цистеїнільні залишки в положенні, відмінному від залишку 31, можуть бути замінені амінокислотними залишками або іншими хімічними фрагментами або для елімінування дисульфідного зв'язку, або, навпроти, для стабілізації утворення зшитої структури. Див., зокрема, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9. Перетворення в похідне з використанням біфункціональних агентів може використовуватися для зшивання пептидів і їхніх функціональних похідних з утворенням водорозчинної несучої матриці або інших макромолекулярних носіїв. Звичайно використовувані агенти, що зшивають, включають, наприклад, 1,1-біс(діазоацетил)-2-фенілетан, глутаральдегід, N-гідроксисукцинімідні складні ефіри, наприклад, складні ефіри 4-азидосаліцилової кислоти, гомобіфункціональні імідоефіри, включаючи дисукцинімідилові складні ефіри, такі як 3,3'дитіобіс(сукцинімідилпропіонат), і біфункціональні малеіміди, такі як N-малеімідо-1,8-октан. Агенти для одержання похідних, такі як метил-3-[(п-азидофеніл)дитіо]пропіоімідат, дають фотоактивну проміжну сполуку, що здатна утворювати структурні зшивки в присутності світла. Альтернативно, для іммобілізації білка можуть використовуватися реакційноспроможні водорозчинні матриці, такі як активований бромціаном вуглеводень і реакційноспроможні субстрати, що наведені в патентах США №№ 3969287, 3691016, 4195128, 4247642, 4229537 і 4330440. Інші можливі модифікації включають гідроксилування проліну і лізину, фосфорилування гідроксильних груп залишків серилу і треонілу, окислювання атома сірки в цистеїні, метилування альфа-аміногруп лізину, аргініну і бічних ланцюгів гістидіну (Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), ацетилування Nкінцевого аміну і, у деяких випадках, амідування C-кінцевих карбоксильних груп. Такі похідні фрагменти, переважно, поліпшують одну або кілька властивостей сполук згідно з даним винаходом, включаючи ферментативну активність, розчинність, усмоктування, 9 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біологічний напівперіод існування тощо. Альтернативно, похідні фрагменти приводять до одержання сполук, що мають такі ж або власне кажучи такі ж характеристики і/або властивості, що і сполука, що не піддавалася дериватизації. Або структурні фрагменти можуть усувати або послабляти будь-які небажані побічні ефекти зазначених сполук тощо. Вуглеводневі (олігосахаридні) групи зручно приєднувати в місцях, що відомі як сайти глікозилування білків. Як правило, О-зв'язані олігосахариди приєднані до залишків серину (Ser) або треоніну (Thr), у той час як N-зв'язані олігосахариди приєднані до залишків аспарагіну (Asn), коли вони є частиною послідовності Asn-X-Ser/Thr, де X може бути будь-якою амінокислотою, крім проліну. Переважно, X є однією з 19 природних амінокислот, відмінних від проліну. Структури N-зв'язаних або О-зв'язаних олігосахаридів і залишків цукрів, що виявляються в кожному типі, різні. Одним з типів цукрів, що звичайно виявляють в обох типах, є Nацетилнейрамінова кислота (яка називається сіаловою кислотою). Сіалова кислота звичайно є кінцевим залишком як N-зв'язаних, так і О-зв'язаних олігосахаридів і за рахунок свого негативного заряду може додавати кислі властивості глікозилованим сполукам. Такий(і) сайт(и) може (можуть) бути включені в лінкер сполук за даною сполуеою, і вони переважно глікозиловані клітиною в процесі рекомбінантної продукції поліпептидних сполук (зокрема, у клітинах ссавців, таких як CHO, BHK, COS). Проте, подібні сайти можуть бути додатково глікозиловані з використанням синтетичних або напівсинтетичних методик, відомих у даній галузі. Модифіковані білки LCAT згідно з даним винаходом можуть бути також змінені на рівні ДНК. Послідовність ДНК будь-якої частини сполуки може бути замінена кодонами, більш сумісними з вибраної клітиною-хазяїном. Для E. coli, що, відповідно до одного аспекту, є клітиною-хазяїном, оптимізовані кодони відомі в даній галузі. Кодони можуть бути замінені, для видалення сайтів або рестрикції включення сайтів рестрикції, що мовчать, що можуть надати допомогу в процесінгу ДНК в вибраної клітині-хазяїні. Носій, лінкер і послідовність ДНК пептиду можуть бути модифіковані, для включення кожної з вищевказаних змін у послідовності. Інший набір ефективних похідних являють собою описані вище молекули, кон'юговані з токсинами, індикаторами або радіоізотопами. Така кон'югація приносить особливу користь для молекул, що містять пептидну послідовність, що зв'язує з клітинами пухлин або патогенів. Дані молекули можуть використовуватися як терапевтичні засоби або як допоміжні сполуки в хірургії (наприклад, у радіоімунонаправленій хірургії, або RIGS) або як діагностичні агенти (зокрема, у радіоімунодіагностиці, або RID). Як терапевтичні засоби зазначені кон'юговані похідні володіють рядом переваг. Вони полегшують використання токсинів і радіоізотопів, що токсичні, якщо їх вводять без специфічного зв'язування, що забезпечує пептидна послідовність. Вони також здатні зменшувати побічні ефекти, що супроводжують терапію радіацією і хіміотерапію, за рахунок зниження ефективних доз партнера по кон'югації. Придатні партнери для кон'югації включають: 90 131 225 213 - радіоізотопи, такі як Y (ітрій), I (йод), Ac (актиній) і Bi (вісмут); - токсин рицин А, утворені мікробами токсини, такі як ендотоксин Pseudomonas (зокрема, PE38, PE40) тощо; - молекули-партнери в системі захоплення (див. нижче); - біотин, стрептавідин (придатний або як молекула-партнер в системі захоплення, або як індикатор, особливо, для діагностичних цілей); і - цитотоксичні агенти (зокрема, доксорубіцин). Однією корисною адаптацією зазначених кон'югованих похідних є їхнє використання в системі захоплення. У подібній системі молекула згідно з даним винаходом являє собою молекулу захоплення, що володіє доброякісною дією. Зазначена молекула захоплення може мати здатність специфічно зв'язуватися з окремою ефекторною молекулою, що містить, наприклад, токсин або радіоізотоп. Пацієнту вводять як кон'юговану з носієм молекулу, так і ефекторну молекулу. У подібній системі ефекторна молекула повинна мати короткий напівперіод існування, якщо вона з'єднана з кон'югованою з носієм молекулою захоплення, що в такому випадку зводить до мінімуму будь-які токсичні побічні ефекти. Кон'югована з носієм молекула повинна мати відносно довгий напівперіод існування, повинна мати доброякісну дію і бути нетоксичною. Конкретні сайти зв'язування обох молекул можуть бути частиною відомої специфічної пари, що зв'язується, (зокрема, біотин, стрептавідин) або можуть бути одержані за допомогою методів одержання пептидів, подібно тим, що наведені в даному описі. Такі кон'юговані похідні можуть бути одержані відомими в даній галузі способами. У випадку ефекторних молекул білка (зокрема, ендотоксину Pseudomonas) подібні молекули можуть бути експресовані як злиті білки з парних генно-інженерних конструкцій ДНК. Кон'юговані з 10 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 радіоізотопом похідні можуть бути одержані, наприклад, як описано для антитіла BEXA (Coulter). Похідні, що містять цитотоксичні агенти або мікробні токсини, можуть бути одержані, наприклад, як описано для антитіла BR96 (Bristol-Myers Squibb). Молекули, що використовують систему захоплення, можуть бути одержані, наприклад, як описано в патентах, патентних заявках і публікаціях компанії NeoRx. Молекули, що використовують для проведення RIGS і RID, можуть бути одержані, наприклад, як описано в патентах, патентних заявках і публікаціях компанії NeoProbe. D. Групи носії Сполуки згідно з даним винаходом також можуть бути ковалентно або нековалентно зв'язані з молекулою носія, такою як лінійний полімер (зокрема, поліетиленгліколь, полілізин, декстран і т.д.), полімер з розгалуженим ланцюгом (див., наприклад, патент США 4289872; патент США 5229490; заявку WO 93/21259); ліпід; сполука групи холестерину (така як стероїд); або вуглеводень або олігосахарид. Інші можливі носії включають фрагменти антитіл і, зокрема, константні області антитіл. Нарешті, інші можливі носії включають приєднання одного або декількох водорозчинних полімерів, таких як поліетиленгліколь або пропіленгліколь, як описано в патентах США 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 і 4179337. Інші придатні полімери, відомі в даній галузі, включають монометоксиполіетиленгліколь, декстран, целюлозу або інші полімери на основі вуглеводів, полі(N-вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю, співполімер поліпропіленоксиду/етиленоксиду, поліоксіетиловані поліолі (наприклад, гліцерин) і полівініловий спирт, а також суміші зазначених полімерів. 1. Носій на основі константної області імуноглобуліну Відповідно до одного з варіантів здійснення, модифікований білок LCAT згідно з даним винаходом включає щонайменше один приєднаний носій, що зв'язаний з білком через N-кінець, С-кінець або бічний ланцюг одного з амінокислотних залишків. В одному варіанті здійснення даного винаходу носієм є домен Fc. Так, домен Fc може бути злитий з N-кінцем або С-кінцем пептиду або одночасно з N- і С-кінцем. Може також використовуватися множина носіїв, приклади яких наведені в даному описі; зокрема, Fc по кожному кінці або Fc біля одного кінця, і група PEG біля іншого кінця або в бічній групі. У різних варіантах здійснення даного винаходу компонент Fc є або нативним Fc, або варіантом Fc. Як приклад, але без обмеження, компонент Fc являє собою область Fc важкого ланцюга імуноглобуліну IgG1 людину або його біологічно активний фрагмент, похідне або димер, див. Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982). Однак, варто розуміти, що область Fc для використання в даному винаході, може бути одержана з будь-яких різновидів IgG, IgA, IgM, IgE або IgD. Нативні домени Fc складені з мономерних поліпептидів, що можуть бути зв'язані в димерні або мультимерні форми ковалентними (зокрема, дисульфідними зв'язками) і/або нековалентними зв'язками. Число внутрішньомолекулярних дисульфідних зв'язків між мономерними субодиницями нативних молекул Fc складає від 1 до 4 у залежності від класу (наприклад, IgG, IgA, IgE) або підкласу (наприклад, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Одним із прикладів нативного Fc є з'єднаний дисульфідним зв'язком димер, одержаний при розщепленні IgG папаїном (див. Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Відповідно до різних аспектів, передбачається, що послідовності Fc включають відомі в даній галузі послідовності, наприклад, Fc IgGl (реєстраційний номер GenBank P01857), Fc IgG2 (реєстраційний номер GenBank P01859), Fc IgG3 (реєстраційний номер GenBank. P01860), Fc IgG4 (реєстраційний номер GenBank P01861), Fc IgAl (реєстраційний номер GenBank P01876), Fc IgA2 (реєстраційний номер GenBank P01877), Fc IgD (реєстраційний номер GenBank P01880), Fc IgM (реєстраційний номер GenBank P01871) і Fc IgE (реєстраційний номер GenBank P01854). Варіанти, аналоги і похідні частини Fc можуть бути сконструйовані, наприклад, шляхом різних замін залишків і послідовностей. Відповідно до одного аспекту, включений варіант Fc, що складається з молекули або послідовності, що одержана гуманізацією з нативного Fc, відмінного від людини. Альтернативно, варіант Fc складається з молекули або послідовності, в якій відсутній один або декілька сайтів нативного Fc або залишків, що впливають або залучаються в (1) утворення дисульфідного зв'язку, (2) несумісність з вибраною клітиноюхазяїном, (3) N-кінцеву неоднорідність при експресії в вибраній клітині-хазяїні, (4) глікозилування, (5) взаємодія з комплементом, (6) зв'язування з рецептором Fc, відмінним від резервного рецептора або (7) опосередковану антигеном клітинну цитотоксичність (ADCC), кожне з який докладно описане в заявці на патент США № 2004008778, опис якої цілком включено в даний опис за допомогою посилання. Фрагменти варіанта (або аналога) Fc включають варіанти, що містять будь-які вставки, в яких один або кілька амінокислотних залишків доповнюють амінокислотні послідовності Fc. 11 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вставки можуть бути розташовані біля будь-якого або обох кінців білка або можуть розміщатися усередині амінокислотної послідовності Fc. Варіанти вставок з додатковими залишками по будьякому або по обох кінцях можуть включати, наприклад, злиті білки і білки, що містять амінокислотні мітки або маркірування. Наприклад, молекула Fc необов'язково може містити Nкінцевий Met, особливо в тому випадку, коли молекула рекомбінантно експресується в бактеріальній клітині, такій як E. coli. У варіантах делецій Fc один або кілька амінокислотних залишків у поліпептиді Fc вилучені. Делеції можуть бути здійснені біля одного або біля обох кінців поліпептиду Fc або шляхом видалення одного або декількох залишків в амінокислотній послідовності Fc. Таким чином, варіанти делецій включають усі фрагменти поліпептидної послідовності Fc. У варіантах замін Fc один або кілька амінокислотних залишків у поліпептиді Fc вилучені і замінені альтернативними залишками. Відповідно до одного аспекту, заміни є консервативними, і консервативні заміни такого типу добре відомі в даній галузі. Альтернативно, даний винахід також стосується замін, що не є консервативними. Наприклад, залишки цистеїну можуть бути вилучені або замінені іншими амінокислотами, щоб перешкоджати утворенню деяких або всіх дисульфідних зшивок у послідовності Fc. Кожен залишок цистеїну може бути вилучений і/або замінений іншими амінокислотами, такими як Ala або Ser. Як інший приклад, модифікації можуть бути також здійснені для проведення амінокислотних замін, щоб (1) видалити сайт зв'язування рецептора Fc; (2) видалити сайт зв'язування комплементу (C1q); і/або (3) видалити сайт опосередкованої антитілом клітинної цитотоксичності (ADCC). Такі сайти відомі в даній галузі, і будь-які відомі заміни входять в об'єм Fc, як використовується в даному описі. Відносно сайтів ADCC у IgG1 див., наприклад, Molecular Immunology, Vol. 29, No. 5, 633-639 (1992). Аналогічним чином, один або кілька залишків тирозину можуть бути замінені залишками фенілаланіну. На додаток, варто розуміти, що можливі й інші варіанти амінокислотних вставок, делецій і/або замін, що входять в об'єм даного винаходу. Відповідно до одного аспекту, вони можуть бути консервативними амінокислотними замінами. Більше того, зміни можуть бути у формі змінених амінокислот, таких як пептидоміметики або D-амінокислоти. Як зазначено вище, як нативні Fc, так і варіанти Fc є придатними доменами Fc для використання в даному винаході. Нативний Fc може бути значно модифікований з утворенням варіанта Fc, за умови, що зберігається здатність зв'язуватися з резервним рецептором; див., наприклад, WO 97/34631 і WO 96/32478. У таких варіантах Fc можна видалити один або декілька сайтів нативного Fc, що визначають структурні ознаки або функціональну активність, що не потрібно злитим молекулам згідно з даним винаходом. Можна видалити зазначені залишки, наприклад, заміною або делецією залишків, вставкою залишків у сайт або усіканням частин, що містять даний сайт. Вставлені або замінені залишки також можуть бути зміненими амінокислотами, такими як пептидоміметики або D-амінокислоти. Варіанти Fc можуть виявитися бажаними з ряду причин, деякі з яких наведені нижче. Приклади варіантів Fc включають молекули і послідовності, в яких: 1. Вилучені сайти, що беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків. Подібне видалення може перешкоджати взаємодії з іншими білками, що містять цистеїн, присутніми у хазяїні, що використовують для одержання молекул згідно з даним винаходом. З цією метою, може бути зрізаний сегмент біля N-кінця, що містить цистеїн, або залишки цистеїну можуть бути вилучені або замінені іншими амінокислотами (зокрема, аланілом, серилом). Навіть у тому випадку, коли вилучені залишки цистеїну, одноланцюжкові домени Fc усе ще здатні утворювати димерний домен Fc, в якому вони нековалентно зв'язані. 2. Нативний Fc модифікований так, щоб він став більш сумісним з клітиною-хазяїном. Наприклад, можна видалити послідовність PA поблизу N-кінця конкретного нативного Fc, що може розпізнати фермент, що розщеплює, в E. coli, такий як пролінімінопептидаза. Можна також додати N-кінцевий залишок метіоніну, особливо, коли молекула рекомбінантно експресується в бактеріальній клітині, такій як E. coli. 3. Частина N-кінця нативного Fc вилучена, для запобігання неоднорідності N-кінця, коли експресія здійснюється в клітину-хазяїна. З цією метою, можна видалити будь-який з перших 20 амінокислотних залишків біля N-кінця, зокрема, такі амінокислотні залишки, що знаходяться в положенні 1, 2, 3, 4 і 5. 4. Вилучено один або декілька сайтів глікозилування. Залишки, що звичайно глікозиловані (зокрема, аспарагін) можуть викликати цитолітичну відповідну реакцію. Подібні залишки можуть бути вилучені або замінені неглікозилованими залишками (наприклад, аланіном). 5. Вилучені сайти, залучені у взаємодію з комплементом, такі як сайт зв'язування C1q. Наприклад, можна видалити або замінити послідовність EKK у IgG1 людини. Рекрутмент 12 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комплементу може виявитися небажаним для молекул згідно з даним винаходом, так що його можна уникнути в такому варіанті Fc. 6. Вилучені сайти, що впливають на зв'язування з рецепторами Fc, відмінними від резервного рецептора. Нативний Fc може мати сайти для взаємодії з деякими лейкоцитами, що не вимагаються для злитих молекул згідно з даним винаходом, так що їх можна видалити. 7. Вилучений сайт ADCC. Сайти ADCC відомі в даній галузі; відносно сайтів ADCC у IgG1 див., наприклад, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992). Зазначені сайти також не вимагаються для злитих молекул згідно з даним винаходом і їх можна видалити. 8. У тому випадку, коли нативний Fc виділений з антитіла, відмінного від антитіла людини, то нативний Fc можна гуманізувати. Як правило, для гуманізації нативного Fc, можна замінити вибрані залишки у відмінному від Fc людини нативному Fc залишками, що звичайно виявляються в нативному Fc людини. Методики гуманізації антитіла добре відомі в даній галузі. Слід зазначити, що мономери Fc будуть мимовільно димеризуватися, якщо присутні відповідні залишки цистеїну, за винятком тих умов, в яких маються перешкоди до димеризації через утворення дисульфідного зв'язку. Навіть якщо залишки цистеїну, що звичайно утворюють дисульфідні зв'язки в димері Fc, вилучені або замінені іншими залишками, мономерні ланцюги як правило, утворюють димер за допомогою нековалентних взаємодій. Термін "Fc" у даному описі означає кожну з зазначених форм; нативний мономер, нативний димер (зв'язаний дисульфідним зв'язком), модифіковані димери (зв'язані дисульфідними і/або нековалентними зв'язками) і модифіковані мономери (тобто похідні). Послідовності Fc можуть бути перетворені в похідні, тобто несучі модифікації, відмінні від вставок, делецій або замін амінокислотних залишків. Відповідно до одного аспекту, модифікації є ковалентними і включають, наприклад, хімічні зв'язки з полімерами, ліпідами, іншими органічними і неорганічними структурними фрагментами. Однак маються на увазі також нековалентні модифікації. Похідні згідно з даним винаходом можуть бути одержані, для збільшення напівперіоду існування при циркулюванії, або можуть бути розроблені таким способом, щоб поліпшити здатність поліпептиду націлюватися на необхідні клітини, тканини або органи. Можна також використовувати резервний рецептор домена зв'язування інтактної молекули Fc як Fc частини сполуки згідно з даним винаходом, як описано в WO 96/32478 за назвою "Altered Polypeptides with Increased Half-Life." Додатковими членами класу молекул, позначеними в даному описі як Fc, є такі молекули, що наведені в WO 97/34631 за назвою "Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives." 2. Носії на основі водорозчинних полімерів Як зазначено вище, передбачається використовувати полімерні носії. В даний час доступні різні засоби для приєднання хімічних структурних фрагментів, див., зокрема, міжнародну публікацію WO 96/11953 за назвою "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", яка цілком включена в даний опис за допомогою посилання. У зазначеній PCT публікації, серед іншого, розкрите селективне приєднання водорозчинного полімеру до N-кінця білків. Таким чином, у даному винаході передбачається використовувати сполуки, що містять водорозчинні полімери (WSP). Придатні, прийнятні для використання в клінічних умовах WSP включають, але не обмежуються ними, поліетиленгліколь (PEG), поліетиленглікольпропіоновий альдегід, співполімери етиленгліколю/пропіленгліколю, монометоксиполіетиленгліколь, карбоксиметилцелюлозу, поліацеталі, полівініловий спирт (PVA), полівінілпіролідон, полі-1,3діоксан, полі-1,3,6-триоксан, співполімери етилену/малеїнового ангідриду, полі-β-амінокислоти (або гомополімери, або статистичні співполімери), полі(вінілпіролідон)поліетиленгліколь, гомополімери пропіленгліколю (PPG) і інші поліалкіленоксиди, співполімери поліпропілену/етиленоксиду, поліоксіетиловані поліолі (POG) (зокрема, гліцерин) і інші поліоксіетиловані поліолі, поліоксіетилований сорбіт і поліоксіетиловану глюкозу, колонову кислоту або інші полімери вуглеводів, фізикол або декстран і їх суміші. Насправді, пропонуються будь-які інші форми PEG, що використовуються для перетворення в похідне інших білків, таких як, але без обмеження, моно(С1-С10)алкоксиабо арилоксиполіетиленгліколі. Поліетиленпропіоновий альдегід може мати переваги при одержанні завдяки своїй стабільності у воді. Група PEG може мати будь-яку зручну молекулярну масу і може бути лінійною або розгалуженою. Середня молекулярна маса групи PEG, що передбачається використовувати згідно з даним винаходом, знаходиться в діапазоні приблизно від 2 кДа до приблизно 100 кДа, приблизно від 5 кДа до приблизно 50 кДа, приблизно 5 кДа до приблизно 10 кДа. Відповідно до іншого аспекту, фрагмент PEG може мати молекулярну масу приблизно від 6 кДа до приблизно 13 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 25 кДа. Групи PEG як правило, приєднані до пептидів або білків шляхом ацилування або відбудовного алкілування через реакційноспроможну групу фрагмента PEG (зокрема, альдегідну, аміно, тіольну або складноефірну групу) і реакційноспроможну групу необхідного пептиду або білка (зокрема, альдегідну, аміно або складноефірну групу). Використовуючи наведені в даному описі способи, можна одержати суміш кон'югованих молекул полімер/пептид, і перевага, що надає даний винахід, полягає в тому, що мається можливість вибрати пропорцію кон'югата полімер/пептид для включення в суміш. Таким чином, якщо необхідно, може бути одержана суміш пептидів з різними кількостями приєднаних полімерних фрагментів (зокрема, нуль, один або два) із заздалегідь заданою пропорцією кон'югата полімер/пептид. Зручна стратегія для пегілування синтетичних пептидів полягає в об'єднанні, за рахунок формування сполученого зв'язку в розчині, пептиду і фрагмента WSP (PEG), кожний з який має спеціальні функціональні групи, здатні взаємодіяти одна з одною. Зазначені пептиди можуть бути легко одержані за допомогою звичайного твердофазного синтезу. Пептиди "попередньо активують" по конкретній ділянці за допомогою придатної функціональної групи. Перед проведенням реакції з фрагментом PEG попередники очищають і досліджують усі їх властивості. Зв'язування пептиду з PEG звичайно проводять у водній фазі і його можна легко контролювати методом аналітичної ВЕРХ із зворотною фазою. Пегілований пептид можна легко очистити методом препаративної ВЕРХ і досліджувати методом аналітичної ВЕРХ, методом аналізу амінокислот і мас-спектрометрією з лазерною десорбцією. Полісахаридні полімери є іншим типом WSP, що можуть бути використані для модифікації білків. Декстрани являють собою полісахаридні полімери, складені з індивідуальних субодиниць глюкози, що переважно з'єднані за допомогою α1-6 зв'язків. Декстран сам по собі доступний з масою в широкому діапазоні значень і легко доступні молекули з масою приблизно від 1 кДа до приблизно 70 кДа. Декстран є зручним водорозчинним полімером, що може бути використаний у даному винаході як носій як такий, так і в комбінації з іншим носієм (зокрема, Fc). Див., наприклад, WO 96/11953 і WO 96/05309. Маються повідомлення про використання декстрану, кон'югованого з терапевтичними або діагностичними імуноглобулінами; див., наприклад, європейську патентну публікацію № 0315456. Якщо декстран використовують як носій згідно з даним винаходом, то переважним є декстран з молекулярною масою приблизно від 1 кДа до приблизно 20 кДа. WSP фрагмент молекули може бути розгалуженим або не розгалуженим. При використанні кінцевого препарату в терапевтичних цілях полімер є фармацевтично прийнятним. Як правило, необхідний полімер вибирають, беручи до уваги яи буде полімерний кон'югат використовуватися в терапії, і якщо так, то враховують необхідне дозування, час циркулювання, стійкість до протеолізу й інші фактори. Відповідно до різних аспектів даного винаходу, середня маса кожного WSP складає приблизно від 2 кДа до приблизно 100 кДа, приблизно від 5 кДа до приблизно 50 кДа, приблизно від 12 кДа до приблизно 40 кДа і приблизно від 20 кДа до приблизно 35 кДа. Відповідно до ще одного аспекту, молекулярна маса кожного полімеру складає приблизно від 6 кДа до приблизно 25 кДа. Термін "приблизно", що використовують у даному випадку і по всьому тексту даного опису, означає, що при одержанні водорозчинного полімеру деякі молекули будуть мати масу більше, а деякі – менше, ніж зазначена молекулярна маса. Як правило, чим більше молекулярна маса або чим більше розгалужень, тим більше відношення полімер/білок. Можуть використовуватися молекули іншого розміру, у залежності від необхідного терапевтичного профілю, включаючи, наприклад, тривалість пролонгованого вивільнення; вплив, якщо він виявляється, на біологічну активність; простоту в поводженні; міру антигенності або відсутності антигенності й інші відомі ефекти водорозчинного полімеру на терапевтичний білок. WSP повинний бути приєднаний до білка з урахуванням впливу на функціональні або антигенні домени пептиду або білка. Як правило, хімічне перетворення в похідне можна здійснити в будь-яких придатних умовах, що використовують для проведення реакції між білком і активованою молекулою полімеру. Групи, що активують, які можуть використовуватися для зв'язування водорозчинного полімеру з одним або декількома білками, включають, але без обмежень, сульфон, малеімід, сульфгідрил, тіол, трифлат, трезилат, азиридин, оксиран і 5піридил. Якщо приєднання здійснюють шляхом відбудовного алкілування, вибраний полімер повинний містити один реакційноспроможний альдегід, щоб можна було контролювати міру полімеризації. 3. Альтернативні носії Альтернативні носії включають білок, поліпептид, пептид або малу молекулу (зокрема, пептидоміметик), здатну зв'язуватися з резервним рецептором. Наприклад, як носій можна використовувати пептид, приведений у патенті США 5739277. Пептиди можна також відібрати 14 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом фагового дисплея для зв'язування з резервним рецептором FcRn. Такі сполуки, що зв'язують резервний рецептор, також включені у визначення "носій" і в об'єм даного винаходу. Такі носії варто вибирати для збільшення напівперіоду існування (тобто, щоб уникнути послідовностей, розпізнаваних протеазами) і зниження імуногенності (наприклад, шляхом переважного використання неімуногенних послідовностей, як було виявлено при гуманізації антитіл). III. Одержання модифікованих білків LCAT/Способи одержання А. Полінуклеотиди Описані вище білки у великих масштабах можуть бути одержані в трансформованих клітинах-хазяїна з використанням методів рекомбінантної ДНК. З цією метою, одержують молекулу рекомбінантної ДНК, що кодує пептид. Способи одержання таких молекул ДНК добре відомі в даній галузі. Наприклад, із ДНК, використовуючи придатні ферменти рестрикції, можна вирізати послідовність, що кодує пептиди. Альтернативно, молекулу ДНК можна синтезувати методами хімічного синтезу, такими як фосфорамідатний спосіб. Крім того, можна використовувати комбінацію зазначених методів. Даний винахід також включає вектор, здатний експресувати пептиди в придатному хазяїні. Вектор містить молекулу ДНК, що кодує пептиди, функціонально зв'язані з відповідними послідовностями, що контролюють експресію. Способи здійснення зазначеного функціонального зв'язування як до, так і після того, як молекула ДНК вставлена у вектор, добре відомі. Послідовності, що контролюють експресію, включають промотори, активатори, енхансери, оператори, сайти зв'язування рибосом, стартові сигнали, сигнали зупинки, сигнали метилованого кепа, сигнали поліаденілування й інші сигнали, що беруть участь у керуванні транскрипцією або трансляцією. Одержаний вектор, що несе молекулу ДНК, використовують для трансформації придатного хазяїна. Зазначену трансформацію можна здійснити, використовуючи способи, добре відомі в даній галузі. При здійсненні даного винаходу може використовуватися кожна з великої кількості доступних і добре відомих клітин-хазяїна. Вибір конкретного хазяїна залежить від ряду факторів, визнаних у даній галузі. Вони включають, наприклад, сумісність з вибраним вектором експресії, токсичність пептидів, кодованих молекулою ДНК, швидкість трансформації, легкість виділення пептидів, параметри експресії, біобезпеку і витрати. Баланс зазначених факторів повинний підбиратися з урахуванням того, що не всі хазяї однаково ефективні для експресії конкретної послідовності ДНК. У рамках зазначених загальних нормативів придатні мікробні хазяїни включають бактерії (такі як E. Coli sp.), дріжджі (такі як Saccharomyces sp.), а також інші гриби, клітини комах, рослин, ссавців (включаючи людину) у культурі або інші хазяїни, відомі в даній галузі. Потім культивують і очищають трансформованого хазяїна. Клітини-хазяїна можна вирощувати в звичайних умовах ферментації, щоб експресувалися необхідні сполуки. Подібні умови ферментації добре відомі в даній галузі. Нарешті, пептиди відокремлюють від культури, використовуючи методи, добре відомі в даній галузі. Модифіковані білки LCAT можна також одержати синтетичними способами. Наприклад, можна використовувати методи твердофазного синтезу. Придатні методики відомі в даній галузі і включають методики, наведені в Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; патент США №. 3941763; rd Finn et al. (1976), The Proteins (3 ed.) 2: 105-253; і Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. Твердофазний синтез розглядається як спосіб одержання індивідуальних пептидів, оскільки він є найбільш ефективним, з погляду витрат, способом одержання невеликих пептидів. B. Вектори Для експресії рекомбінантного білка в даному винаході пропонується вектор, що кодує модифікований білок LCAT, що може бути експресований у придатному хазяїні. Такий вектор являє собою полінуклеотид, що кодує модифікований білок LCAT, що містить або не містить модифікацію носія, що функціонально приєднаний до відповідних послідовностей, які контролюють експресію. Способи здійснення зазначеного функціонального зв'язування як до, так і після вставки молекули ДНК у вектор, добре відомі. Послідовності, що контролюють експресію, включають промотори, активатори, енхансери, оператори, сайти зв'язування рибосом, стартові сигнали, сигнали зупинки, сигнали метилованого кепа, сигнали поліаденілування і/або інші сигнали, що беруть участь у керуванні транскрипцією або трансляцією. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що в залежності, наприклад, від вибору 15 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини-хазяїна, в якій повинний експресуватися модифікований білок LCAT, можуть використовуватися різні комбінації зазначених контролюючих послідовностей. Одержаний вектор трансформують у відповідного хазяїна, використовуючи способи, добре відомі в даній галузі. C. Клітини-хазяїна Для експресії модифікованого білка LCAT може використовуватися кожна з великого числа доступних і добре відомих клітин-хазяїна. Вибір хазяїна залежить від ряду факторів, що, як приклад, але без обмеження, включають сумісність з вибраним вектором експресії, токсичність експресованого модифікованого білка LCAT, кодованого трансформованим полінуклеотидом, швидкість трансформації, легкість виділення експресованого модифікованого білка LCAT, параметри експресії, міру і тип глікозилування і, якщо потрібно, біобезпеку і вартість. Баланс зазначених факторів повинний підбиратися з урахуванням того, що не всі клітини-хазяїна однаково ефективні для експресії конкретного модифікованого білка LCAT. У залежності від використовуваної клітини-хазяїна, продукт експресії у вигляді модифікованого LCAT може бути глікозилованим вуглеводами ссавців або іншими вуглеводами еукаріотів або бути неглікозилованим. Модифікований LCAT як продукт експресії також може включати початковий метіоніновий амінокислотний залишок (амінокислотний залишок у положенні -1), якщо його експресують, наприклад, у бактеріальній клітині-хазяїні. У рамках зазначених загальних нормативів придатні клітини-хазяїна включають бактерії, дріжджі й інші гриби, клітини комах, рослин, ссавців (включаючи людину) в культурі або інші клітини-хазяїна, відомі в даній галузі. Клітини-хазяїна вирощують у звичайних умовах ферментації, добре відомих у даній галузі, таким чином, щоб експресувалися необхідні сполуки, і продукт експресії у вигляді модифікованого LCAT очищають, використовуючи методи, добре відомі в даній галузі. У залежності від клітини-хазяїна, що використовують для експресії модифікованого білка LCAT, вуглеводневі (олігосахаридні) групи зручно приєднувати до місць, що, як відомо, є сайтами глікозилування білка. Як правило, O-зв'язані олігосахариди приєднані до залишку серину (Ser) або треоніну (Thr), у той час як N-зв'язані олігосахариди приєднані до залишків аспарагіну (Asn), коли вони є частиною послідовності Asn-X-Ser/Thr, де X може бути будь-якою амінокислотою, за винятком проліну. Переважно, X є однією з 19 амінокислот, що зустрічаються в природі, за винятком проліну. Структури N-зв'язаних і O-зв'язаних олігосахаридів і залишків цукрів, що зустрічаються в кожному типі, різні. Одним з типів цукрів, що виявляються звичайно на обох кінцях, є N-ацетилнейрамінова кислота (яка називається сіаловою кислотою). Сіалова кислота звичайно є кінцевим залишком як N-зв'язаних, так і O-зв'язаних олігосахаридів, і, оскільки вона несе негативний заряд, то може додавати кислі властивості глікозилованій сполуці. Такі сайти можуть включатися в лінкер сполук згідно з даним винаходом і, переважно, глікозилуються клітиною в процесі рекомбінантної продукції поліпептидних сполук (наприклад, у клітинах ссавців, таких як CHO, BHK, COS). Проте, подібні ділянки можна також глікозилувати за допомогою синтетичних і напівсинтетичних методів, відомих у даній галузі. D. Модифікація носія модифікованого білка LCAT У залежності від вибраного способу приєднання WSP, пропорція молекул WSP, приєднаних до заданої молекули білка, буде варіювати, а також буде мінятися їх концентрація в реакційній суміші. Як правило, оптимальне відношення (з погляду ефективності реакції, що полягає в томум, що відсутній надлишок білка або полімеру, що не прореагував) визначається молекулярною масою вибраного WSP. Крім того, у тому випадку, коли використовують методи, що включають неспецифічне приєднання і наступне очищення необхідних хімічних сполук, відношення може залежати від кількості доступних реакційноспроможних груп (як правило, аміногруп). Як правило, WSP додають до модифікованого білка LCAT за допомогою ацилування, відбудовного алкілування, приєднання по Міхаелю, тіольного алкілування або інших способів хімічно селективного кон'югування/зв'язування за допомогою реакційноспроможних груп WSP (тобто альдегідної, аміно, складноефірної, тіольної, α-галогенацильної, малеімідної або гідразинової груп) і реакційноспроможних груп мішені. Таким чином, пропонується також спосіб одержання кон'югованих похідних. Таким чином, одним з аспектів даного винаходу є спосіб, що включає одержання модифікованого агента LCAT, що містить щонайменше один носій, будь-яким способом, що приведений у даному описі або відомий у даній галузі. Як приклад, але без обмеження, може використовуватися методика хімічної модифікації з використанням відбудовного алкілування. Альтернативний спосіб модифікації WSP описаний Francis et al., у Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern, T. and Manning, M. C.) Plenum, N.Y., 1991. Відповідно до іншого аспекту, використовують спосіб, приведений Delgado et al., у 16 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", In: Fisher et al., eds., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y., 1989 pp. 211-213, де використовують трезилхлорид, що приводить до утворення зв'язку між фрагментом WSP і модифікованим білком LCAT. Однак зазначений альтернативний спосіб може виявитися важко здійсненним при одержанні продуктів для терапевтичного застосування, оскільки використання трезилхлориду може привести до утворення токсичних продуктів. Відповідно до інших аспектів, приєднання WSP здійснюють, використовуючи N-гідроксисукцинімідильні складні ефіри карбоксиметилметоксиполіетиленгліколю, як добре відомо в даній галузі. 1. Відбудовне алкілування Відповідно до одного аспекту, ковалентне приєднання WSP до модифікованого білка LCAT здійснюють за допомогою методів хімічної модифікації з використанням відбудовного алкілування, що наведені в даному описі для проведення селективної модифікації N-кінцевих αаміногруп, з наступним проведенням аналізів одержаного продукту на наявність необхідних біологічно властивостей, таких як методи аналізу біологічної активності, наведені в даному описі. При відбудовному алкілуванні, з метою приєднання WSP до білка або пептиду, використовують розходження в активності різних типів первинних аміногруп (наприклад, лізину, у порівнянні з N-кінцем), що доступні для дериватизації в конкретному білку. У відповідних умовах проведення реакції досягається власне кажучи селективна дериватизація білка по Nкінцю за допомогою полімеру, що містить карбонільну групу. При використанні відбудовного алкілування відновник повинний бути стабільний у водному розчині і, переважно, здатний відновлювати тільки основу Шифа, що утвориться на початковій стадії відбудовного алкілування. Відновники вибирають, але без обмеження, з боргідриду натрію, ціаноборгідриду натрію, диметиламінборату, триметиламінборату і піридинборату. рН реакційного середовища впливає на використовуване відношення полімеру до білка. Як правило, якщо рН реакційного середовища менше, ніж величина рКа вибраної реакційної групи, то буде потрібний великий надлишок полімеру стосовно білка. Якщо рН більше, ніж задана величина рКа, то відношення полімер:білок необов'язково повинно бути настільки великим (тобто доступно більше реакційноспроможних груп, так що потрібно менше молекул полімеру). Таким чином, відповідно до одного аспекту, реакцію проводять при рН, що дозволяє використовувати перевагу, яка полягає в різниці між значеннями рКа ε-аміногруп залишків лізина і α-аміногруп N-кінця білка. Шляхом такого селективного перетворення в похідне здійснюється контроль приєднання водорозчинного полімеру до білка; кон'югація з полімером переважно відбувається біля N-кінця білка і не відбувається істотна модифікація інших реакційноспроможних груп, таких як аміногрупи в бічному ланцюзі лізина. Таким чином, відповідно до одного аспекту, пропонуються способи ковалентного приєднання WSP до вибраного модифікованого білка LCAT, що забезпечують одержання власне кажучи однорідних молекул кон'югата WSP/білок, при цьому не потрібно подальше інтенсивне очищення, що необхідне при використанні інших методик хімічної модифікації. Зокрема, якщо використовують поліетиленгліколь, то описані способи дозволяють одержувати пегілований по N-кінцю білок, в якого відсутні можливі антигенні зв'язуючі групи, тобто структурний фрагмент поліетиленгліколю безпосередньо зв'язаний зі структурним фрагментом білка без утворення яких-небудь потенційно токсичних побічних продуктів. Е. Очищення WSP-модифікованої сполуки Спосіб одержання власне кажучи однорідного препарату WSP-білок LCAT, відповідно до одного з аспектів даного винаходу, полягає у виділенні переважно одного типу різновидів модифікованих структурних фрагментів LCAT, що містять приєднаний фрагмент WSP, із суміші модифікованих молекул LCAT, що мають ряд приєднань WSP у різних ділянках у послідовності модифікованого білка LCAT. Як приклад, власне кажучи гомогенні модифіковані молекули LCAT спочатку відокремлюють методом іонообмінної хроматографії, при цьому виділяють речовину, що володіє зарядними характеристиками однотипних хімічних сполук (хоча можуть бути присутніми і інші хімічні сполуки, що мають аналогічний удаваний заряд), і потім необхідні хімічні сполуки відокремлюють ексклюзійною хроматографією. Інші способи, що описані і які передбачається використовувати в даному винаході, включають, наприклад, WO 90/04606, де розкритий спосіб фракціонування суміші адуктів PEG-білок, що полягає у фракціонуванні адуктів PEG/білок у PEG-вмісній водній двохфазній системі. Подібну розділову систему можна модифікувати для використання з модифікованими білками LCAT, що мають інші (тобто відмінні від PEG) приєднання. 17 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, одним аспектом даного винаходу є спосіб одержання кон'югата WSPмодифікований LCAT, що включає (a) взаємодію модифікованого білка LCAT, що містить більше однієї аміногрупи, із фрагментом водорозчинного полімеру в умовах відбудовного алкілування і при рН, придатному для селективного активування α-аміногрупи біля N-кінця фрагмента білка, так що водорозчинний полімер селективно приєднується до зазначеної α-аміногрупи; і (b) виділення продукту реакції. Продукти реакції і, зокрема, продукти для терапевтичного застосування, необов'язково відокремлюють від речовин, що не брали участь у реакції. IV. Фармацевтичні композиції, що містять модифікований LCAT, і способи введення Незважаючи на те, що сполуки згідно з даним винаходом можна вводити індивідуально, в описаних способах сполуки, що вводяться, як правило, присутні як активний інгредієнт у необхідній сполуці одиничної дозованої форми, такій як фармацевтично прийнятна композиція, що містить звичайні фармацевтично прийнятні носії. Таким чином, як інший аспект даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить сполуку згідно з даним винаходом в комбінації з фармацевтично прийнятним носієм. Прийнятні фармацевтичні носії як правило, включають розріджувачі, ексципієнти, ад'юванти тощо, як описано в даному описі. Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом може містити ефективну кількість сполуки за даним винаходом або ефективну дозовану кількість сполуки згідно з даним винаходом. Ефективна дозована кількість сполуки згідно з даним винаходом включає кількість, меншу, рівну або більшу, ніж ефективна кількість сполуки. Прикладом є фармацевтична композиція, в якій дві або кілька одиничних дозованих форм, таких як таблетки, капсули тощо, необхідні для того, щоб ввести ефективну кількість сполуки, або, альтернативно, багатодозова фармацевтична композиція, така як порошки, рідини тощо, в яку ефективна кількість сполуки може бути введена шляхом використання частини композиції. "Одинична дозована форма" визначається як дискретна кількість терапевтичної композиції, диспергованої у придатному носії. Фахівці в даній галузі легко оптимізують ефективні дозування і режими введення, що визначаються належною медичною практикою і клінічним станом індивідуального пацієнта. Фармацевтичні композиції звичайно можуть бути одержані шляхом змішування одного або декількох модифікованих білків LCAT з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, ексципієнтами, зв'язуючими, ад'ювантами, розріджувачами, консервантами, солюбілізаторами, емульгаторами тощо, з утворенням необхідного придатного для введення складу, призначеного для лікування або ослаблення симптомів множини захворювань. Такі композиції містять розріджувачі з різним вмістом буферної сполуки (наприклад, Tris-HCl, ацетат, фосфат), з різною величиною рН і іонною силою; добавки, такі як очищувальні засоби і солюбілізатори (зокрема, Tween 80, Polysorbate 80), антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, метабісульфит натрію), консерванти (наприклад, Thimersol, бензиловий спирт) і наповнювачі (наприклад, лактоза, маніт); включають додавання речовини в порошкоподібні препарати полімерних сполук, таких як полімолочна кислота, полігліколева кислота і т.д., або в ліпосоми. Може також використовуватися гіалуронова кислота, і вона може сприяти пролонгуванню тривалості при циркуляції. Такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість in vivo вивільнення і швидкості in vivo виведення білків і похідних згідно з даним винаходом. Див., наприклад, Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712, що включені в даний опис за допомогою посилання. Композиції можуть бути одержані в рідкій формі або можуть бути у вигляді сухого порошку, такого як ліофілізована форма препарату. Передбачаються також імплантовані сполуки для пролонгованого вивільнення, такі як трансдермальні сполуки. Фармацевтичні композиції можуть бути піддані звичайним фармацевтичним операціям, таким як стерилізація, і/або включенню звичайних ад'ювантів, таких як консерванти, стабілізатори, змочувальні речовини, емульгатори, буферні добавки і т.д. Фармацевтично активні сполуки згідно з даним винаходом можна піддати обробкам відповідно до застосовуваних у фармації методик і одержати терапевтичні засоби, призначені для введення пацієнтам, включаючи людину й інших ссавців. Фармацевтичні композиції можуть бути одержані з використанням способів, добре відомих у даній галузі, серед інших, таких як звичайні операції гранулювання, змішування, розчинення, інкапсулювання, ліофілізації, емульгування або вилуговування. Композиції можуть бути одержані, наприклад, у формі гранул, порошків, таблеток, капсул, сиропу, супозиторіїв, ін'єкцій, емульсій, еліксирів, суспензій або розчинів. Композиції згідно з даним винаходом можуть бути складені для різних способів введення, наприклад, для перорального введення, для черезслизового введення (включаючи внутрішньолегеневе введення і введення через ніс), для парентерального введення (включаючи підшкірне введення), для трансдермального (місцевого) введення або для ректального введення, а також для внутрішньооболонкової, 18 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внутрішньовенної, внутрішньом'язової, внутрішньоочеревинної, інтраназальної, внутріщньоочної або інтравентрикулярної ін'єкції. Сполука або сполуки згідно з даним винаходом можуть також уводитися місцево, а не системно, зокрема, у вигляді ін'єкцій сполуки з пролонгованим вивільненням. Крім приведених у даному описі окремих прикладів дозованих форм, фахівцям у даній галузі як правило, відомі фармацевтично прийнятні ексципієнти і носії, що, таким чином, включені в даний винахід. Подібні ексципієнти і носії описані, наприклад, у "Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (2000); і "Pharmaceutics The Science of Dosage Form Design, nd 2 Ed. (Aulton, ed.) Churchill Livingstone (2002). Наведені нижче дозовані форми представлені тільки як приклад і їх не слід розглядати як обмежуючі даний винахід. А. Пероральне введення Для перорального, трансбукального і сублінгвального введення доступні такі тверді дозовані (і одиничні дозовані) форми як порошки, суспензії, гранули, таблетки, пігулки, капсули, желатинові капсули, пастилки або коржі, саше, пелети і таблетки у формі капсул, що описані в главі 89 довідника Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed., Mack Publishing Co. Easton PA 18042. Тверді дозовані форми включають також ліпосомну або протеїноїдну інкапсуляцію (прикладом є протеїноїдні мікросфери, наведені в патенті США 4925673). Може використовуватися ліпосомна інкапсуляція, і ліпосоми можуть бути перетворені в похідне за допомогою різних полімерів (наприклад, як зазначено в патенті США 5013556). Опис можливих дозованих форм для терапевтичних цілей наведено в главі 10 монографії Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes. Як правило, композиція містить модифікований білок LCAT і інертні інгредієнти, що дозволяють здійснити захист від середовища в шлунку і визволити біологічно активну речовину в кишечнику. Якщо необхідно, сполуки згідно з даним винаходом хімічно модифікують, для підвищення біодоступності при пероральній доставці. Як правило, передбачувана хімічна модифікація включає приєднання щонайменше однієї хімічної сполуки до молекули сполуки згідно з даним винаходом, при цьому зазначена хімічна сполука дозволяє здійснити (a) інгібування протеолізу; і (b) доставку в кровоток з шлунка або кишечнику. Бажано також підвищити загальну стабільність сполуки і збільшити час її циркулювання в організмі. З цією метою в даному винаході можуть використовуватися молекули, придатні як ковалентно зв'язані носії. Приклади подібних хімічних сполук включають PEG, співполімери етиленгліколю і пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлозу, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон і поліпролін, а також інші агенти, наведені в даному описі. Див. також, наприклад, Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg and Roberts, eds., WileyInterscience, New York, NY, pp 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185-9. Іншими полімерами, що можуть бути використані, є полі-1,3-діоксолан і полі-1,3,6-тіоксокан. Відповідно до одного аспекту, для фармацевтичного використання, пропонуються хімічні сполуки на основі PEG, як зазначено вище. Для дозованих форм перорального введення, як носій можна також використовувати сіль модифікованої аліфатичної амінокислоти, таку як N-(8-[2-гідроксибензоил]аміно)каприлат натрію (SNAC), з метою посилення абсорбції терапевтичних сполук згідно з даним винаходом. Клінічна ефективність сполуки гепарину з використанням SNAC була показана у фазі II аналізу, проведених компанією Emisphere Technologies. Див. патент США 5792451, "Oral drug delivery composition and methods". Сполуки згідно з даним винаходом можуть бути включені до складу у вигляді гранул, складених з множини дрібних частинок, або у вигляді пелетів з частинок з розміром приблизно 1 мм. Сполука, що містить речовину для введення у вигляді капсул також може бути одержана у вигляді порошку, злегка спресованих тампонів або у вигляді таблеток. Терапевтичний засіб може бути одержаний методом пресування. Пропоновані фармацевтичні композиції для перорального введення можуть бути одержані, наприклад, шляхом змішування однієї або декількох сполук згідно з даним винаходом щонайменше з однією добавкою або ексципієнтом, таким як крохмаль або інша добавка, і таблетування або інкапсулювання, або вони можуть бути одержані у вигляді інших необхідних форм для звичайного введення. Придатними добавками або ексципієнтами є сахароза, лактоза, целюлозний цукор, маніт, мальтит, декстран, сорбіт, крохмаль, агар, альгінати, хітини, хітозани, пектини, смола трагаканту, гуміарабік, желатини, колагени, казеїн, альбумін, синтетичні або напівсинтетичні полімери або гліцериди, метилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза і/або полівінілпіролідон. Пероральні дозовані форми необов'язково можуть містити інші інгредієнти, що полегшують введення, такі як неактивний розріджувач, або лубриканти, такі як стеарат магнію, або консерванти, такі як парабен і сорбінова кислота, або антиоксиданти, такі як 19 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аскорбінова кислота, токоферол або цистеїн, розпушувач, зв'язуючі, загусники, буферні добавки, підсолоджувачі, віддушки або ароматизатори. Крім того, для цілей ідентифікації, можуть додаватися барвники або пігменти. На таблетки або пігулки можуть бути потім нанесені покриття з придатних для цих цілей речовин, що відомі в даній галузі. Рідкі дозовані форми для перорального введення можуть бути у формі фармацевтично прийнятних емульсій, сиропів, еліксирів, суспензій, суспензій і розчинів, що можуть містити неактивний розріджувач, такий як вода. Фармацевтичні склади можна одержати у вигляді рідких суспензій або розчинів, використовуючи стерильну рідину, таку як, але, не обмежуючись ними, олія, вода або спирт, або їх комбінації. Для проведення перорального або парентерального введення можуть бути додані фармацевтично прийнятні поверхнево-активні речовини, суспендуючі агенти, емульгатори тощо. Зокрема, різні аспекти оральних фармацевтичних композицій включають одну або кілька наступних добавок. Можуть бути включені пігменти й віддушки. Наприклад, білок (або його похідна сполука) може бути введений до складу (як при ліпосомній інкапсуляції або інкапсуляції в мікросфери), і потім доповнений придатним в їжу речовиною, такою як охолоджений напій, що містить пігменти й віддушку. Можна розбавити або збільшити об'єм сполуки згідно з даним винаходом за допомогою інертної речовини. Зазначені розріджувачі можуть включати вуглеводи, зокрема, маніт, лактозу, безводну лактозу, целюлозу, сахарозу, модифіковані декстрани і крохмаль. Деякі неорганічні солі також можуть використовуватися як наповнювачі, включаючи трифосфат кальцію, карбонат магнію і хлорид натрію. Деякими комерційно доступними розріджувачами є Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress і Avicell. Дезінтегранти можуть бути включені до складу терапевтичного засобу у вигляді твердої дозованої форми. Речовини, використовувані як дезінтегранти, включають, але, не обмежуючись ними, крохмаль, у тому числі комерційний дезінтегрант на основі крохмалю, Explotab. Можуть також використовуватися натрійгліколяткрохмаль, амберліт, натрійкарбоксиметилцелюлоза, ультрамілопектин, альгінат натрію, желатин, шкірка апельсинів, кисла карбоксиметилцелюлоза, натуральна губка і бентоніт. Іншою формою дезінтегрантів є нерозчинні катіонообмінні смоли. Як дезінтегранти, а також зв'язуючі можуть використовуватися смоли в порошкоподібному стані, і вони можуть включати здрібнені смоли, такі як агар, смола караїі або смола трагаканту. Альгінова кислота і її натрієва сіль також придатні як дезінтегранти. Зв'язуючі можуть використовуватися для об'єднання терапевтичних засобів один з одним з утворенням твердої таблетки, і вони включають речовини, одержані з природних продуктів, таких як камедь, смола трагаканту, крохмаль і желатин. Інші зв'язуючі включають метилцелюлозу (MC), етилцелюлозу (EC) і карбоксиметилцелюлозу (CMC). Як полівінілпіролідон (PVP), так і гідроксипропілметилцелюлоза (HPMC) можуть використовуватися в спиртових розчинах для гранулювання терапевтичного засобу. До складу терапевтичного засобу може вводитися засіб, що знижує тертя, для запобігання злипання в процесі одержання сполуки. Лубриканти можуть використовуватися як шар між терапевтичним засобом і стінкою матриці, і вони можуть включати, але, не обмежуючись ними, стеаринову кислоту, включаючи її магнієву і кальцієву солі, політетрафторетилен (PTFE), рідкий парафін, рослинні олії і віски. Можуть також використовуватися розчинні лубриканти, такі як лаурилсульфат натрію, лаурилсульфат магнію, поліетиленгліколь з різними молекулярними масами, Carbowax 4000 і 6000. Можуть додаватися гліданти, що можуть поліпшити сипкі властивості лікарського засобу в процесі його одержання і можуть допомогти в процесі перебудови структури при пресуванні. Гліданти можуть включати крохмаль, тальк, пірогенний оксид кремнію і гідратований алюмосилікат. Щоб полегшити розчинення сполуки згідно з даним винаходом у водному середовищі, як змочувальна речовина може додаватися поверхнево-активна речовина. Поверхнево-активні речовини можуть включати аніонні детергенти, такі як лаурилсульфат натрію, діоктилсульфосукцинат натрію і діоктилсульфонат натрію. Можуть бути використані катіонні детергенти, і вони можуть включати бензалконійхлорид або бензетонійхлорид. Список потенційних неіонних детергентів, що можуть бути додані до складу як поверхнево-активні речовини, включає лауромакроголь 400, поліоксил 40 стеарат, поліоксіетиловане гідроване касторове масло 10, 50 і 60, моностеарат гліцерину, полісорбат 40, 60, 65 і 80, складний ефір жирної кислоти і сахарози, метилцелюлозу і карбоксиметилцелюлозу. Зазначені поверхневоактивні речовини можуть бути присутніми у складі білка або його похідного як такі, так і у вигляді суміші в різних співвідношеннях. 20 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До складу можуть також бути включені добавки, для посилення засвоєння сполуки. Добавками, що потенційно володіють зазначеними властивостями, є, наприклад, такі жирні кислоти як олеїнова кислота, лінолева кислота і ліноленова кислота. Може знадобитися сполука з контрольованим вивільненням активної речовини. Сполука згідно з даним винаходом може бути включена в інертну матрицю, що дозволяє визволити її або по дифузійному механізмі, або по механізму вилуговування, наприклад, у смоли. До складу можуть також бути включені повільно розкладані матриці, зокрема, альгінати, полісахариди. Іншою формою контрольованого вивільнення сполуки згідно з даним винаходом є спосіб, оснований на оральній осмотичній терапевтичній системі (Alza Corp.), тобто лікарський засіб вміщується в напівпрозору мембрану, що дозволяє воді проникати усередину і виштовхувати лікарський засіб через окремі маленькі отвори завдяки осмотичним ефектам. Деякі ентеросолюбільні оболонки також мають ефект пролонгованого вивільнення. Для складання в композицію можуть використовуватися інші покриття. Вони включають різні цукри, які можна наносити в установці для нанесення покриттів. Терапевтичний засіб може також міститися в таблетці з плівковим покриттям, і речовини, що використовують у цьому випадку, поділяються на 2 групи. У першу групу входять речовини, що не є ентеросолюбільними і вони включають метилцелюлозу, етилцелюлозу, гідроксіетилцелюлозу, метилгідроксіетилцелюлозу, гідроксипропілцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, натрійкарбоксиметилцелюлозу, повідон і поліетиленгліколі. Другу групу складають ентеросолюбільні речовини, що звичайно являють собою складні ефіри фталевої кислоти. Для одержання оптимального плівкового покриття можуть використовуватися суміші речовин. Нанесення плівкового покриття можна здійснити в установці для нанесення покриттів, або в псевдозрідженому шарі, або шляхом пресування. В. Пульмональні форми доставки У даному винаході передбачається також пульмональна доставка білка згідно з даним винаходом (або його похідного). Білок згідно з даним винаходом (або його похідне) доставляється в легені ссавця при інгаляції, коли він проходить крізь епітеліальну вистілку і потрапляє в кровоток. Інші повідомлення на цю тему включають Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (лейпроліду ацетат); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl. 5): s. 143-146 (ендотелін-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (α1-антитрипсин); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (α1протеїназа); Oswein et al. (March 1990), "Aerosolization of Proteins" Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (рекомбінантний гормон росту людини); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (інтерферон-γ і фактор некрозу пухлин () і Platz et al., патент США № 5284656 (гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор). При здійсненні даного винаходу передбачається використання широкого кола механічних пристроїв, призначених для пульмональної доставки терапевтичних продуктів, включаючи, але, не обмежуючись ними, розпилювачі, дозуючі інгалятори і порошкові інгалятори, що усі відомі фахівцям у даній галузі. Деякими конкретними прикладами комерційно доступних пристроїв, придатних для здійснення даного винаходу, є розпилювач Ultravent, що виготовляється компанією Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; розпилювач Acorn II, що виготовляється компанією Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; дозуючий інгалятор Ventolin, що виготовляється компанією Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; і порошковий інгалятор Spinhaler, що виготовляється компанією Fisons Corp., Bedford, Massachusetts. Усі такі пристрої вимагають використання складів, придатних для дозованої подачі сполуки згідно з даним винаходом. Як правило, кожна сполука адаптована для конкретного типу використовуваного пристрою і, крім розріджувачів, ад'ювантів і/або носіїв, придатних для застосування в терапії, може включати використання відповідного газа-витискувача. Сполуку згідно з даним винаходом найбільше зручно одержувати в порошкоподібній формі із середнім розміром частинок менше ніж 10 мкм (мікрон), найбільше переважно, з розміром частинок у діапазоні від 0,5 до 5 мкм, що дозволяє домогтися найбільш ефективної доставки в дистальний відділ легені. Фармацевтично прийнятні носії для пульмональної доставки включають вуглеводи, такі як трегалоза, маніт, ксиліт, сахароза, лактоза і сорбіт. Інші інгредієнти для використання в зазначених складах, включають DPPC, DOPE, DSPC і DOPC. Можуть використовуватися природні і синтетичні поверхнево-активні речовини. Може використовуватися PEG (незалежно від його використання при дериватизації білка за даним винаходом або його аналога). Можуть використовуватися декстрани, такі як циклодекстран. Можуть використовуватися солі жовчних кислот і інші родинні енхансери. Можуть використовуватися целюлоза і похідні целюлози. Можуть використовуватися амінокислоти, наприклад, при одержанні буферних складів. 21 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Передбачається також використання ліпосом, мікрокапсул або мікросфер, комплексів включення, а також інших типів носіїв. Склади, придатні для використання з розпилювачем, як струминним, так і ультразвуковим, як правило, містять сполуку згідно з даним винаходом, що розчинена у воді з концентрацією приблизно 0,1. Склади можуть являти собою спрей або аерозоль, що містить придатний розчинник і необов'язково інші сполуки, такі як, але, не обмежуючись ними, стабілізатори, антимікробні засоби, антиоксиданти, регулятори рН, поверхнево-активні речовини, модифікатори біодоступності і їх комбінації. Газ-витискувач для аерозольного складу може включати стиснене повітря, азот, діоксид вуглецю або легкокиплячий розчинник на основі вуглеводню. Сполука або сполуки згідно з даним винаходом зручно доставляти в дозованій формі у вигляді спрея-аерозолю з розпилювача або подібного пристрою. D. Парентеральне введення Дозовані форми у вигляді ін'єкцій для парентерального введення, як правило, включають водні суспензії або суспензії в олії, що можуть бути одержані з використанням відповідного диспергатора і змочувального засобу, і суспендуючого агента. Форми для ін'єкцій можуть бути одержані у вигляді розчину або порошку, придатного для відновлення у вигляді розчину. І той і інший готують з використанням розчинника або розріджувача. Прийнятні розчинники або носії включають стерильну воду, розчин Рінгера або ізотонічний фізіологічний розчин. Альтернативно, як розчинники або суспендуючі агенти можуть використовуватися стерильні олії. Як правило, олія або жирна кислота нелкі і включають природні або синтетичні олії, жирні кислоти, моно-, ди- або тригліцериди. Склади для ін'єкції необов'язково можуть містити стабілізатори, регулятори рН, поверхнево-активні речовини, модифікатори біодоступності і їх комбінації. Зі сполук можуть бути одержані склади для парентерального введення у вигляді ін'єкції, наприклад, у вигляді ін'єкції болюсу або у вигляді безперервного уливання. Одинична дозована форма для ін'єкції може бути у вигляді ампул або контейнерів з багаторазовими дозуваннями. Е. Ректальне введення Для ректального введення фармацевтичні склади можуть бути у формі супозиторію, мазі, клізми, таблетки або крему для вивільнення сполуки в кишечнику, сигмовидному вигині ободової кишки і/або в прямій кишці. Ректальні супозиторії одержують, змішуючи одну або кілька сполук за даним винаходом або фармацевтично прийнятних солей, або таутомерів сполуки з прийнятними носіями, наприклад, з олією какао або поліетиленгліколем, що є твердими при кімнатній температурі, але стають рідкими при температурах, придатних для вивільнення лікарського засобу усередині тіла, наприклад, при температурі в прямій кишці. При виготовленні супозиторіїв можуть використовуватися різні інші агенти і добавки, що добре відомо фахівцям у даній галузі. F. Фармацевтичні склади і дозування Склади згідно з даним винаходом можуть бути розроблені для нетривалої дії, швидкого вивільнення, тривалої дії і пролонгованого вивільнення, як описано нижче. Так, фармацевтичні склади можуть також бути одержані для контрольованого вивільнення або для уповільненого вивільнення. Композиції згідно з даним винаходом можуть також включати, наприклад, міцели або ліпосоми або яку-небудь іншу інкапсульовану форму, або можуть вводитися у формі для пролонгованого вивільнення, для збільшення часу збереження і/або посилення ефекту при доставці. З цією метою, фармацевтичні склади можуть бути спресовані у вигляді таблеток або циліндриків і імплантовані внутрішньом'язово або підшкірно у вигляді ін'єкції препарату з уповільненим усмоктуванням або імплантатів, таких як стенти. У подібних імплантатах можуть використовуватися відомі інертні матеріали, такі як кремнійорганічні і біорозкладані полімери. Конкретні дозування можна підібрати в залежності від хворобливого стану, віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі і дієти індивіда, інтервалу доз, шляхів введення, швидкості виведення і комбінацій лікарських засобів. Будь-які з вищевказаних дозованих форм, що містять ефективну кількість речовини, легко можуть бути вибрані після проведення звичайних експериментів, і усі вони входять в об'єм даного винаходу. Терапевтично ефективна доза може змінюватися в залежності від шляху введення і дозованої форми. Як правило, сполука або сполуки згідно з даним винаходом вибирають таким чином, щоб одержати склад, що володіє високим терапевтичним показником. Терапевтичний індекс являє собою відношення між токсичною і терапевтичною дією, і його можна виразити у вигляді відношення між LD50 і ED50. LD50 являє собою дозу, що є смертельною для 50 % популяції, і ED50 являє собою дозу, що терапевтично ефективна для 50 % популяції. Величини LD50 і ED50 визначають по стандартних фармацевтичних методиках у культурах клітин або тварин для піддослідних тварин. 22 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Схема дозування лікарських засобів при лікуванні LCAT-опосередкованих захворювань і порушень, що наведені в даному описі, з використанням модифікованого білка LCAT і/або композицій ґрунтується на різних факторах, включаючи тип захворювання, вік, масу тіла, стать, захворювання пацієнта, тяжкість стану, спосіб введення і конкретну застосовувану сполуку. Таким чином, схеми введення лікарських засобів можуть бути дуже різноманітні, однак вони можуть бути легко встановлені стандартними способами. Рівні дозування складають приблизно від 0,01 мг до 30 мг на кілограм маси тіла на день, наприклад, приблизно від 0,1 мг до 10 мг/кг або приблизно від 0,25 мг до 1 мг/кг придатні для всіх способів застосування, розкритих у даному винаході. Як правило, щоденна схема введення лікарських засобів повинна передбачати введення в діапазоні від 0,1-1000 мкг сполуки згідно з даним винаходом на кілограм маси тіла, переважно, 0,1-150 мкг на кілограм. 1. Оральні дозування Для перорального введення фармацевтичні композиції можуть бути, наприклад, у формі капсули, таблетки, суспензії або в рідкій формі. Фармацевтична композиція може бути приготовлена у формі одиниці дозування, що містить задану кількість активного інгредієнта. Наприклад, фармацевтична композиція може містити кількість активного інгредієнта в діапазоні приблизно від 1 до 2000 мг, наприклад, приблизно від 1 до 500 мг, або приблизно від 5 до 150 мг, або приблизно від 10 до 100 мг. Придатна денна доза для людини або іншого ссавця може змінюватися в широких межах у залежності від стану пацієнта й інших факторів, однак, як було зазначено вище, вона може бути легко визначена звичайними способами. 2. Дозування у вигляді ін'єкцій Активний інгредієнт можна ввести шляхом ін'єкції композиції з придатними носіями, включаючи фізіологічний розчин, декстрозу або воду. Щоденне парентеральне дозування лікарських засобів складає приблизно від 0,1 до приблизно 30 мг/кг від загальної маси тіла, наприклад, приблизно від 0,1 до приблизно 10 мг/кг або приблизно 0,25 до 1 мг/кг. 3. Дозування для місцевого нанесення Склади, придатні для місцевого застосування, включають рідкі або напіврідкі препарати, придатні для проникнення через шкіру (наприклад, лініменти, лосьйони, мазі, креми або пасти), і краплі, придатні для введення в око, вухо або ніс. Придатні місцеві дози активного інгредієнта сполуки згідно з даним винаходом складає від 0,1 мг до 150 мг, що вводять від одного до чотирьох, наприклад, від одного до двох разів на день. Для місцевого застосування активний інгредієнт може складати від 0,001 до 10 % мас., наприклад, від 1 % до 2 % від маси сполуки, хоча він може складати аж до 10 % мас., однак, як правило, складає не більш ніж 5 % мас. Відповідно до одного аспекту даного винаходу, концентрація складає від 0,1 % до 1 % від маси сполуки. G. Схеми введення лікарських засобів Введення композицій може здійснюватися системно або місцево, і може включати єдину область для ін'єкції або вливання терапевтично ефективної кількості композиції модифікованого білка LCAT. Передбачається, що може бути використаний будь-який шлях, відомий фахівцям у даній галузі, для введення терапевтичної композиції згідно з даним винаходом, включаючи, наприклад, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, підшкірний або використання катетера для тривалого введення. Альтернативно, передбачається, що терапевтична композиція може доставлятися пацієнту через множину ділянок. Множинні введення можна здійснювати одночасно або введення можна здійснювати протягом періоду часу. У визначених випадках може виявитися корисним створення безперервного потоку терапевтичної композиції. Додаткова терапія може застосовуватися протягом визначеного періоду часу, наприклад, щодня, щотижня або щомісяця. У деяких варіантах здійснення даного винаходу модифікований поліпептид LCAT наносять місцево на ділянку реперфузії. V. Способи лікування А. Атеросклероз, серцево-судинні захворювання або зв'язане з ними захворювання Відповідно до одного аспекту, способи лікування згідно з даним винаходом є терапевтичними, і сполуки і композиції згідно з даним винаходом застосовуються для індивіда, що вже страждає від атеросклерозу, серцево-судинного захворювання або зв'язаного з ними захворювання. Відповідно до іншого аспекту, способи лікування є профілактичними, і сполуки і композиції застосовуються для індивідів, що піддані небезпеки розвитку атеросклерозу. Щоб визначити, чи підданий індивід небезпеці розвитку, наприклад, атеросклерозу, можна провести аналіз профілю ліпопротеїну, що сприяє розвитку атеросклерозу. Наприклад, відношення вмісту в сироватці холестерину до HDL, що дорівнює 5:1 або вище, вказує на більш ніж середній ризик розвитку атеросклерозу. Іншими факторами є рівень холестерину в сироватці, який дорівнює 240 мг/дл або вище, рівень HDL 35 мг/дл або нижче, або рівень LDL 190 мг/дл або вище, рівень 23 UA 103304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у плазмі білка LCAT нижче нормального (