Ген і білок, асоційовані з шизофренією

1. Виділений полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з: а) полінуклеотиду, що кодує поліпептид РАРАР, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2; b) полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NО:1, 3 або його комплементарну послідовність; і c) полінуклеотиду, який щонайменше на 95 % ідентичний полінуклеотиду, вказаному в (b). 2. Рекомбінантний вектор, що містить полінуклеотид за п.1. 3. Клітина-хазяїн тварини, що відмінна від людини, яка містить рекомбінантний вектор за п.2. 4. Полінуклеотид за п.1, який додатково включає мітку і/або приєднаний до твердого носія. 5. Очищений поліпептид РАРАР, амінокислотна послідовність якого: (а) кодується будь-яким з полінуклеотидів за п.1; 2 (19) 1 3 79582 4 b) контактування вказаного поліпептиду з вказаною речовиною-кандидатом; c) визначення утворення комплексу між вказаним поліпептидом і вказаною речовиною-кандидатом. 15. Спосіб скринінгу речовин, які модулюють експресію полінуклеотиду за п.1, що включає: a) культивування прокаріотичних або еукаріотич них клітин, трансфікованих полінуклеотидом за п.1; b) контактування культивованої клітини з речовиною-кандидатом; c) детекцію експресії продукції вказаного полінуклетиду в присутності вказаної молекуликандидата. Даний винахід відноситься до полінуклеотидів гена РАРАР, до поліпептидів, що кодуються геном РАРАР, і до антитіл, специфічних до таких поліпептидів. Даний винахід також відноситься до способів лікування або діагностики шизофренії, біполярних порушень або споріднених захворювань ЦНС. Даний винахід також відноситься до взаємодії РАРАР з геном g34872, який є кандидатом на ген шизофренії. Прогрес, досягнутий в технологічному оснащенні сучасних лабораторій для теоретичних і клінічних досліджень, дозволяє провести більш серйозне вивчення функцій головного мозку і нервової системи як у здорових індивідуумів, так і у індивідуумів з патологією. Було висунено множину нейробіологічних і фармакологічних гіпотез, що стосуються нейрохімічних і генетичних механізмів, що викликають порушення центральної нервової системи (ЦНС), включаючи психічні і нейродегенеративні порушення. Однак, порушення ЦНС мають складну і ще недостатньо ясну етіологію, і їх симптоми, які перекриваються один з одним, ще недостатньо охарактеризовані і представляють певні труднощі для діагностики. У майбутньому необхідно розробити такі схеми лікування і лікарські засоби, які володіли б більш тонкою і направленою дією на мультигенні етіологічні фактори, а також необхідно розробити нові аналізи для виявлення людей, які страждають вказаними захворюваннями, і для одержання більш точних діагностичних і прогностичних даних відносно пацієнтів, які страждають порушеннями ЦНС. Порушення ЦНС можуть охоплювати захворювання широкого спектра і, відповідно, широкий спектр генетичних факторів. Прикладами порушень ЦНС є нейродегенеративні захворювання, психотичні порушення, порушення настрою, аутизм, зловживання речовинами, що викликають залежність, і алкоголізм, затримка розумового розвитку та інші психічні захворювання, включаючи порушення пізнавальної здатності, тривожні стани, порушення, пов'язане з прийомом їжі, імпульсивність, що не контролюється, і порушення особистості. Такі порушення можуть бути визначені з використанням "Керівництва з діагностики і статистики психічних порушень, четверте видання, класифікація (DSM-IV)" ["Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition classification"]. Навіть при розгляді лише невеликого ряду порушень ЦНС, очевидно, що виходячи з відсутності адекватного лікування і розуміння молекулярних механізмів психотичних порушень, шизофренії і біполярних порушень, які є новими цілями терапії даного винаходу, необхідно розробити вдосконалені способи лікування цих порушень. Що стосується шизофренії і біполярного порушення, то всі відомі молекули, що використовуються для лікування шизофренії, дають побічні ефекти і діють тільки на симптоми даного захворювання. Існує крайня необхідність в одержанні нових молекул, які не давали б побічних ефектів, і які були б направлені на мішені, що беруть участь в механізмах, які викликають шизофренію і біполярне порушення. Тому, необхідно розробити способи, що полегшують виявлення і характеризацію цих мішеней. Дані про поєднання шизофренії з біполярним порушенням в сім'ях, дані, одержані при дослідженні близнюків і прийомних дітей, а також відсутність динаміки в захворюваності у всьому світі вказують на те, що шизофренія і біполярне порушення є, головним чином, генетичними станами, хоча на певному рівні присутні також і зовнішні фактори ризику, такі, як необхідні, достатні або інтерактивні етіологічні фактори. Так, наприклад, шизофренією страждає 1% всього населення. Але якщо в сім'ї бабуся або дідусь страждали шизофренією, то ризик розвитку цього захворювання зростає приблизно до 3%, а якщо один з батьків страждав шизофренією, то цей ризик збільшується приблизно до 10%. Якщо обидва батьки страждали шизофренією, то ризик становить приблизно 40%. Ідентифікація гена чутливості до шизофренії на хромосомі 13q31-q33 Ідентифікація генів, що беруть участь в наданні конкретної ознаки, такої як специфічне порушення центральної нервової системи, наприклад, шизофренія, може бути здійснена за допомогою двох головних стратегій, які використовуються в цей час для генетичного картування, а саме, аналіз на зчеплення генів і дослідження на асоціацію генів. Аналіз на зчеплення генів вимагає проведення дослідження сімейств, в яких спостерігалася множина випадків захворювання індивідуумів, і таке дослідження в цей час може бути використане для виявлення моно- або олігогенних успадкованих ознак. На відміну від цього, дослідження асоціації генів дозволяють визначити частоту зустрічальності маркерних алелей у неспоріднених індивідуумів з цією ознакою (Т+) в порівнянні з негативним контролем (Т-) за цією ознакою, і таке дослідження часто використовується для виявлення полігенної спадковості. 5 79582 Генетичний зв'язок або "зчеплення" генів засновано на аналізі, який дозволяє визначити, які з двох сусідніх послідовностей на хромосомі містять найменше число рекомбінацій, що виникають в результаті кросинговеру в процесі мейозу. Для цього була визначена точна локалізація хромосомних маркерів, таких як мікросателітні маркери, на геномі. Аналіз на зчеплення генів дозволяє обчислити імовірності рекомбінацій на цільовому гені з використанням хромосомних маркерів, відповідно до генеалогічного древа, імовірність передачі хвороби і перенесення маркерів. Таким чином, якщо конкретний алель даного маркера передається з даною хворобою більш часто, ніж імовірність того, що він вже присутній в ньому (рівень рекомбінації від 0 до 0,5), то можна зробити висновок, що цільовий ген, який розглядається, присутній у цього маркера. З використанням цього методу можна визначити локалізацію декількох генів, що свідчать про генетичну схильність до спадкової злоякісної пухлини. Для включення в дослідження на зчеплення генів сім'ї, яка страждає успадкованою формою захворювання, вона повинна задовольняти критеріям "інформативності", тобто, ця сім'я повинна мати декілька індивідуумів, які страждають цим захворюванням, (у яких є структурна ДНК) на одне покоління, а щонайбільше, вона повинна мати велике число сибсів. Результати попередніх досліджень на зчеплення генів підтвердили припущення, що хромосома 13 ймовірно має локус чутливості до шизофренії на 13q32 [Blouin J.L. et al., 1998, Nature Genetics, 20:70-73; Lin M.W. et al., 1997, Hum. Genet., 99 (3): 417-420]. Ці спостереження дозволяють передбачити, що локус шизофренії знаходиться на хромосомі 13q32, що було підтверджено в дослідженнях на зчеплення генів. Аналіз на зчеплення генів був успішно застосований для картування простих генетичних ознак, які ясно вказують на характер менделевского успадкування, і які мають високий рівень пенетрантності, однак, цей метод має ряд недоліків. По-перше, аналіз на зчеплення генів залежить від вибору генетичної моделі, відповідної для кожної ознаки, що досліджується. Крім того, використання аналізу на зчеплення генів обмежене розрізненням, яке може бути досягнуте при його застосуванні, і для більш точного аналізу типових 20 м.п.н. - областей, які були заздалегідь ідентифіковані цим методом, потрібні додаткові дослідження. Крім того, аналіз на зчеплення генів представляє певні труднощі при його застосуванні з метою виявлення складних генетичних ознак, таких як ознаки, зумовлені комбінованою дією множини генів і/або факторів навколишнього середовища. У цих випадках для підбору адекватного числа сімей з даним захворюванням, необхідного для проведення аналізу на зчеплення генів для конкретних ситуацій, потрібний дуже великий об'єм роботи і коштів. І, нарешті, аналіз на зчеплення генів не може бути застосований для дослідження ознак, в яких не може брати участь велике число "інформативних" сімей. Пізніше, замість використання аналізів на зчеплення генів був використаний альтернативний метод досліджень на асоціацію генів, який дозво 6 лив ідентифікувати новий ген, асоційований з шизофренією і біполярним порушенням і позначений геном g34872, який локалізований в локусі хромосоми 13q31-q33. Цей альтернативний метод передбачає створення біалельних маркерів (головним чином, з однонуклеотидним поліморфізмом) в потрібній області, ідентифікацію маркерів, що вказують на нерівноважність із зчеплення з шизофренією, і проведення досліджень на асоціацію генів у індивідуумів з випадками неспорідненої шизофренії і біполярного порушення, а також у контрольних популяцій. Загалом був сконструйований ВАС-контиг, що охоплює геномну ділянку-кандидат, з використанням 27 опублікованих STS (STS-ДНКмаркувальний сайт), локалізованих на ділянці хромосоми 13q31-q33 для скринінгу 7 геномних еквівалентних запатентованих ВАС-бібліотек. На основі цих матеріалів були генеровані нові STS, що дозволило побудува ти щільну фізичну карту цієї області. Загалом 275 STS дозволили ідентифікувати 255 ВАС, що мають всі можливі розміри і картовані шляхом хромосомної гібридизації in situ для їх підтвердження. Нові біалельні маркери були генеровані шляхом часткового секвенування кінців вставки від субклонів деяких вставок ВАС, локалізованих в області 13q31-q33 хромосоми людини. У першій фазі цього аналізу, для випадку шизофренії і контролю, була проаналізована перша серія 34 біалельних маркерів на 9 різних ВАС вздовж локусу-кандидата хромосоми 13q31-q33, що дозволило ідентифікувати субобласть, що вказує на асоціацію з шизофренією. Після проведення цього першого аналізу генерували додаткові біалельні маркери, як описано вище для побудови карти дуже високої щільності потрібної області. Була ідентифікована і повністю секвенована мінімальна серія з 35 ВАС, що дозволило виявити декілька контигів, включаючи контиг, що складається з послідовностей в більше, ніж 900 т.п.н. в потрібній області. Ці біалельні маркери були використані в комбінації з дослідженнями, які проводилися з метою уточнення конкретної потрібної субобласті, містять кандидат на ген шизофренії, g34872. У деяких дослідженнях, що проводяться на різних понуляціях з метою підтвердження асоціації з вказаної субобластю, був визначений генотип цих біалельних маркерів. Дослідження на асоціацію спочатку здійснювали на двох різних скринуючих зразках для випадків шизофренії і на контрольних зразках, взятих від індивідуумів, що проживають у французькій Канаді, з яких 139 чоловік мали шизофренію, а 141 чоловік складали контрольну групу, і 215 чоловік мали шизофренію, а 241 чоловік складали контрольну груп у, відповідно, а також на зразках для випадків біполярного порушення і контрольних зразках, взяти х від індивідуумів, що проживають в Аргентині. Дані, одержані внаслідок декількох досліджень з участю вказаних індивідуумів, виявили геномну область, що має приблизно 150 т.п.н. і виявляє значущу асоціацію з шизофренією. Ця асоціація була потім підтверджена в незалежних дослідженнях з використанням зразків для випадків захворювання і контрольних зразків, взятих від 7 79582 хворих шизофренією, що проживають в США, а також додаткових зразків, взятих від індивідуумів, що проживають в Аргентині і у французькій Канаді. Було виявлено, що геномна область приблизно в 150 т.п.н., асоційована з шизофренією, містить ген-кандидат g34872. Крім того, крім характеризації структури інтрон-екзон гена g34872, був ідентифікований ряд варіантів мРНК-сплайсингу, включаючи тканеспецифічні варіанти мРНКсплайсингу, і була продемонстрована присутність мРНК. Потім пептидний фрагмент, що походить від поліпептидного продукту g34872, амінокислотна послідовність якого показана в SEQ ID NO:5, виявляв, при його внутрішньоочеревинному введенні мишам, зниження частоти локомоторних рухів і збільшення стереотипії. Подальше обговорення ідентифікації гена g34872 приводиться в [заявці на патент США, що одночасно розглядається, реєстр. №09/539333, озаглавленої "Гени, білки і біалельні маркери, асоційовані з шизофренією" ("Schizophrenia associated genes, proteins and biallelic marker") і в міжнародній патентній заявці № РСТ/ІВОО/00435, що одночасно розглядається, які були подані 30 березня 2000 року] і які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання. Надто необхідно ідентифікувати гени, асоційовані з шизофренією і біполярним порушенням. Також необхідно ідентифікувати гени, що бер уть участь у шляху g34872, і гени, продукти яких функціонально взаємодіють з продуктами гена g34872. Ці гени можуть послужити початком нового етану в лікуванні шизофренії або біполярних порушень і також дозволять проводити подальші дослідження і характеризацію гена g34872 і пов'язаного з ним біологічного шляху. Відомості про ці гени і пов'язаний з ними біологічний шлях, відповідальних за шизофренію, можуть допомогти дослідникам зрозуміти етіологію шизофренії і біполярного порушення і сприяти розробці лікарського засобу і медичних препаратів, які будуть направлені на причину, що викликає ці захворювання. Існує також гостра необхідність в розробці нових способів виявлення чутли вості до шизофренії і біполярних порушень, а також способів попередження розвитку шизофренії або контролю за ходом її розвитку. Також надто необхідно розробити засоби для діагностики цих захворювань. Дійсно, рання ідентифікація індивідуумів з ризиком розвитку шизофренії дозволила б провести раннє і/або профілактичне лікування. Крім того, точна оцінка потенційної ефективності лікарського засобу, а також потенційної толерантності до нього пацієнтів, дозволила б клініцистам збільшити відношення користь/ризик при розробці схем лікування шизофренії і біполярного порушення. Таким чином, даний винахід відноситься до нового гена і білка, який взаємодіє з пептидом g34872. Цей новий ген, позначений геном РАРАР, був клонований авторами даного винаходу, які продемонстрували, що продукт гена РАРАР взаємодіє з пептидом g34872. Відомості про партнера по скріпленню з g34872 дають можливість розробити лікарські засоби для лікування захворювань ЦНС, опосередкованих g34872 і/або РАРАР, і про 8 вести дослідження g34872 шляхом одержання засобів для детекції РАРАР, g34872 і комплексів g34872-РАРАР або їх взаємодій. Даний винахід відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що містять геномну послідовність нового гена людини, який кодує білок РАРАР. Геномна послідовність РАРАР включає регуляторну послідовність, розташовану вище (з 5'-кінця) і нижче (з 3-кінця) від транскрибованої частини вказаного гена, і ці регуляторні послідовності також є частиною даного винаходу. Даний винахід також відноситься до повної кДНК-послідовності, що кодує білок РАРАР, а також до поліпептидів РАРАР, і до антитіл, що специфічно розпізнають поліпептид РАРАР. Даний винахід також відноситься до комплексу PAPAPg34872, що не містить білка, з яким він звичайно асоційований, а також до антитіл, що специфічно розпізнають вказаний комплекс. Олігонуклеотидні зонди або праймери, що специфічно гібридизуються з геномною або з кДНК-послідовністю РАРАР, а також способи ДНКампліфікації і детекції з використанням вказаних праймерів і зондів також є частиною даного винаходу. Іншим об'єктом даного винаходу є рекомбінантні вектори, що містять будь-які вищеописані послідовності нуклеїнової кислоти, а зокрема, рекомбінантні вектори, що містять регуляторну послідовність РАРАР або послідовність, що кодує білок РАРАР, а також клітини-хазяї і трансгенні тварини, відмінні від людини, і що містять вказані послідовності нуклеїнової кислоти або рекомбінантні вектори. Даний винахід також відноситься до способів скринінгу речовин або молекул, що інгібують експресію РАРАР, а також до способів скринінгу речовин або молекул, які взаємодіють з поліпептидом РАРАР, і які модулюють активність поліпептиду РАРАР або порушують, попереджають, дестабілізують або посилюють скріплення і/або взаємодію пептидів і/або білків РАРАР і g34872. І нарешті, даний винахід відноситься до використання поліпептиду РАРАР, антитіл проти цього поліпептиду і агоністів і антагоністів активності РАРАР для лікування порушень ЦНС. Короткий опис послідовностей, представлених в списку послідовностей SEQ ID NO:1 містить кДНК-послідовність PAPΑΡ. SEQ ID NO:2 містить амінокислотну послідовність, що кодується кДНК SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:3 містить геномну ДНКпослідовність РАРАР. SEQ ID NO:4 містить ДНК-послідовність, що кодує гібридний білок "пептид g34872 - лужна фосфатаза", описаний в прикладі 1. SEQ ID NO:5 містить ДНК-послідовність, що кодує пептид g34872, що використовується для ідентифікації і клонування гена РАРАР, описаного в прикладі 1. SEQ ID NO:6 містить амінокислотну послідовність, що кодується ДНК SEQ ID NO:4. 9 79582 Ідентифікація гена РАРАР. локалізованого на хромосомі 1р35-р36 Для ідентифікації білка РАРАР авторами даного винаходу був використаний метод експресійного клонування, детально описаний нижче в прикладі 1. Для цього заявниками був створений, із збереженням рамки зчитування, гібрид кДНКпослідовності, що кодує пептидний фрагмент g34872, з С-кінцем секретованої лужної фосфатази (АР) у векторі, що містить секретовану сигнальну послідовність, розташовану вище вставки, яка направляє секрецію цього гібридного білка в дане середовище, де вказане середовище, що містить цей гібридний білок, може бути зібраним, проаналізованим на АР-активність і використаним в аналізі in situ на рецептор/ліганд. Потім авторами даного винаходу був проведений аналіз in situ на рецептор/ліганд. кДНК, виділені з кДНК-бібліотеки головного мозку людини, клонували в експресуючий вектор і трансфікували в клітини COS-1. Секретований АР-гібридний білок використали як зонд для клонування РАРАР шляхом інкубування клітин з середовищем, що містить гібридний білок "пептид g34872-АР". У випадку детекції позитивного клону аналіз повторювали з використанням ще більш дрібних пулів кДНК доти, поки не був ідентифікований єдиний клон. Даний винахід також відноситься до полінуклеотидів і до поліпептидів, асоційованих з геном РАРАР. Частиною даного винаходу також є олігонуклеотидні зонди або праймери, які специфічно гібридизуються з геномною або з кДНКпослідовністю РАРАР. Іншою метою даного винаходу є рекомбінантні вектори, що містять будь-які вищеописані послідовності нуклеїнової кислоти, а зокрема, рекомбінантні вектори, що включають регуляторну послідовність РАРАР або послідовність, що кодує білок РАРАР, а також клітинихазяї, що містять вказані послідовності нуклеїнової кислоти або рекомбінантні вектори. Даний винахід також відноситься до способів скринінгу молекул, які інгібують експресію гена РАРАР, і які модулюють активність білка РАРАР, або які порушують, попереджають, дестабілізують або посилюють скріплення і/або взаємодію пептидів і/або білків РАРАР і g34872. Даний винахід також відноситься до антитіл, які специфічно направлені проти таких поліпептидів, і які можуть бути використані як діагностичні реагенти. Ідентифікований ген і білок РАРАР може бути використаний при розробці аналізів для діагностики шизофренії або біполярних порушень і при розробці аналізів для надійної детекції генетичної схильності до шизофренії, до біполярних порушень і до споріднених захворювань. Для лікування вказаних порушень можуть бути використані нуклеїнові кислоти і поліпептиди РАРАР, а також антитіла проти вказаних поліпептидів. Ген і білок РАРАР і антитіла проти них можуть бути також використані при розробці схем скринінгу лікарських засобів для точної і ефективної оцінки терапевтичного ефекту і побічних ефектів нових або вже наявних лікарських засобів або схем лікування. Крім того, нуклеїнові кислоти і поліпептиди РАРАР 10 можуть бути використані для дослідження g34872 і РАРАР і їх участь в розвитку захворювань ЦНС. Визначення Перед більш докладним описом даного винаходу приводяться нижченаведені визначення, в яких проілюстровані і визначені значення і об'єм термінів, що використовуються в цьому винаході. Терміни "ген РАРАР", що використовуються тут, о хоплюють геномні, мРНК- і кДНКпослідовності, що кодують білок РАРАР, включаючи регуляторні області геномної ДНК, що не транслюються. Термін "гетерологічний білок", що використовується тут, означає будь-який білок або поліпептид, що не є білком РАРАР. Більш конкретно, таким гетерологічним білком є сполука, яка може бути використана як маркер в подальших експериментах з регуляторною областю РАРАР. Термін "виділений" означає, що даний матеріал повинен бути видалений з його природного середовища (наприклад, природного оточення, якщо воно є). Так, наприклад, природний полінуклеотид або поліпептид, присутній в живому організмі, не є виділеним, але ті ж самі полінуклеотид, ДНК або поліпептид, відділені від деяких або всіх матеріалів, що є в природній системі, є виділеними. Такий полінуклеотид може бути частиною вектора, і/або такий полінуклеотид або поліпептид може бути частиною композиції, і у випадку, якщо вони виділені, то даний вектор або композиція не є частиною його природного оточення. Так, наприклад, природний полінуклеотид, присутній в живому організмі, не є виділеним, але той же самий полінуклеотид, відділений від деяких або від всіх речовин, що є в природній системі, є виділеним. Більш конкретно, з поняття "виділений" повинні бути виключені: природні хромосоми (такі як хромосомні препарати), штучні хромосомні бібліотеки, геномні бібліотеки і бібліотеки кДНК, які існують або у вигляді препарату, одержаного на основі нуклеїнової кислоти in vitro, або у вигляді препарату, одержаного на основі трансфікованої/трансформованої клітини-хазяїна, де вказані клітини-хазяї являють собою або гетерогенний препарат in vitro або висіваються у вигляді гетерогенної популяції одиничних колоній. Конкретними виключеннями також є вищезгадані бібліотеки, де конкретний полінуклеотид складає менше, ніж 5% від числа вставок нуклеїнової кислоти у векторних молекулах. Ін шими конкретними виключеннями є геномні ДНК цілих клітин або РНК-препарати цілих клітин (включаючи вказані препарати цілих клітин, які є механічно фрагментованими або ферментативно гідролізованими). Іншими конкретними виключеннями є вищезгадані препарати цілих клітин, одержані або у вигляді in vitro-препарату, або у вигляді гетерогенної суміші, виділеної шляхом електрофорезу (включаючи перенесення блотів цього препарату), де поліпептид даного винаходу надалі не був виділений з гетерологічних полінуклеотидів в середовищі для електрофорезу (наприклад, не був підданий подальшому вирізанню однієї смуги з популяції гетерогенних смуг в агарозному гелі або в найлоновому блоті). 11 79582 Термін "очищений", що використовується тут, необов'язково означає абсолютну чистоту; а швидше, він має відносне тлумачення. У конкретних випадках може передбачатися очищення вихідного матеріалу або природного матеріалу, принаймні, першого порядку, а переважно, другого або третього порядків, а більш переважно, четвертого або п'ятого порядків. Прикладом може служити очищення в межах від 0,1%-ної концентрації до 10%-ної концентрації, що складає очищення другого порядку. Для ілюстрації, окремі кДНК-клони, виділені з бібліотеки кДНК, були очищені стандартним способом до електрофоретичної гомогенності. Послідовності, одержані з цих клонів, не можуть бути безпосередньо одержані ні з бібліотеки, ні з повної ДНК людини. Самі клони кДНК не зустрічаються в природі, і вони можуть бути одержані шляхом модифікації частково очищеної природної речовини (матричної РНК). Перетворення мРНК в бібліотеку кДНК приводить до утворення синтетичної речовини (кДНК), а чисті окремі клони кДНК можуть бути виділені з синтетичної бібліотеки шляхом клонального відбору. Так, наприклад, створення бібліотеки кДНК з матричної РНК і подальше виділення окремих клонів з цієї бібліотеки дає приблизно 104-106-кратне очищення нативного месенджера. Термін "очищений", що використовується тут, відноситься до поліпептиду або до полінуклеотиду даного винаходу, який був виділений з інших сполук, включаючи, але не обмежуючись ними, поліпептиди або полінуклеотиди, вуглеводи, ліпіди і т.п.Термін "очищений" може бути використаний для ідентифікації відділення мономерних поліпептидів даного винаходу від олігомерних форм, таких як гомо- або гетеродимери, тримери і т.п.Термін "очищений" може бути також використаний для ідентифікації відділення ковалентно пов'язаних полінуклеотидів від лінійних полінуклеотидів. Полінуклеотид є, в основному, чистим в тому випадку, якщо, принаймні, 50%, а переважно, 60-75% зразка виявляють одиночну полінуклеотидну послідовність і конформацію (лінійну в порівнянні з ковалентно пов'язаною). В основному, чистий поліпептид або полінуклеотид звичайно становить приблизно 50%, а переважно 60-90% мас. від всього поліпептидного або полінуклеотидного зразка, відповідно, а звичайно його чистота становить приблизно 95%, а переважно, приблизно більше 99%. Чистоту або гомогенність поліпептиду і полінуклеотиду визначають різними способами, добре відомими фахівцям, такими як електрофорез зразка в агарозному або в поліакриламідному гелі, з подальшою візуалізацією одиночної смуги після фарбування геля. Для певної мети може бути використане більш високе застосуванням ВЕРХ або інших способів, добре відомих фа хівцям. Як альтернативний варіант здійснення винаходу, чисто та поліпептидів і полінуклеотидів даного винаходу може бути визначена як "принаймні, процент чистоти" по відношенню до гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів (ДНК, РНК або обидві цих речовини). Як переважний варіант здійснення винаходу, поліпептиди і полінуклеоти 12 ди даного винаходу мають чистоту, принаймні, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99% або 100% по відношенню до гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів, відповідно. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу поліпептиди і полінуклеотиди мають чистоту, що знаходиться в межах від будь-якого числа до тисячних часток, від 90% до 100% (наприклад, поліпептид або полінуклеотид, принаймні, з чистотою 99,995%) по відношенню до гетерологічних поліпептидів або полінуклеотидів, відповідно, або їх чистота може бути виражена як їх масове відношення до всіх сполук і молекул, крім тих, які присутні в носії. Кожне число, що представляє процент чистоти, аж до тисячних часток, може бути заявлене як окремий тип чистоти. Термін "поліпептид" означає полімер, що складається з амінокислот, незалежно від довжини цього полімеру; таким чином, в поняття "поліпептид" входять пептиди, олігопептиди і білки. Цей термін не визначає або не виключає посттрансляційні модифікації поліпептидів, так, наприклад, термін "поліпептид" охоплює поліпептиди, які включають ковалентно пов'язані глікозильні групи, ацетильні групи, фосфа тні групи, ліпідні групи і т.п.В це визначення входять також поліпептиди, що містять один або декілька аналогів амінокислот (включаючи, наприклад, неприродні амінокислоти, амінокислоти, які присутні тільки в неспоріднених біологічних системах, модифіковані амінокислоти, що походять з систем ссавців і т.п.), поліпептиди із заміщеними зв'язками, а також інші модифікації, відомі фахівцям, як природні, так і неприродні. Термін "рекомбінантний поліпептид", що використовується тут, означає поліпептиди, які були штучно сконструйовані, і які містять, принаймні, дві поліпептидних послідовності, не присутні як безперервні поліпептидні послідовності в його природному оточенні, або цей термін означає поліпептиди, які були експресовані рекомбінантним полінуклеотидом. Термін "очищений поліпептид", що використовується тут, означає поліпептид даного винаходу, який був виділений з інших сполук, включаючи, але не обмежуючись ними, нуклеїнові кислоти, ліпіди, вуглеводи і інші білки. Поліпептид є, в основному, чистим в тому випадку, якщо, принаймні, 50%, а переважно, 60-75% зразка складає одиночна поліпептидна послідовність. В основному, чистий поліпептид звичайно становить приблизно 50%, а переважно, 60-90мас.% зразка білка, а звичайно, приблизно 95%, а переважно, приблизно більше 99% по всій масі зразка білка. Чистоту або гомогенність поліпептиду визначають способами, добре відомими фахівцям, такими як електрофорез зразка в поліакриламідному гелі, з подальшою візуалізацією однієї поліпептидної смуги після фарбування геля. Для певної мети може бути використано більш високе розрізнення із застосуванням ВЕРХ або інших добре відомих способів. Термін "тварина, відмінна від людини", що використовується тут, означає будь-яке хребетне, відмінне від людини, птахи і, більш звичайно, ссавці, переважно, примати, сільськогосподарські тваринні, такі як свині, кози, вівці, осли і коні, кро 13 79582 лики або гризуни, а більш переважно, щури або миші. Термін "тварина", що використовується тут, означає будь-яке хребетне, а переважно, ссавець. У поняття "тварина" і "ссавець", крім тварин, перерахованих ви ще при визначенні поняття "тварина, відмінна від людини", входить також і людина. Термін "антитіло", що використовується тут, означає поліпептид або групу поліпептидів, які складаються, принаймні, з одного зв'язуючого домену, де домен, що зв'язується з антитілом, формується внаслідок укладання варіабельних доменів молекули антитіла з утворенням трьохмірних зв'язуючих областей, що мають форму внутрішньої поверхні і розподіл заряду, комплементарні елементам антигенної детермінанти даного антигену, внаслідок чого забезпечується здійснення імунологічної реакції з цим антигеном. Антитілами є рекомбінантні білки, що містять зв'язувальні домени, а також їх фрагменти, включаючи Fab, Fab', F(ab)2 і Р(аb')2-фрагменти. Термін "антигенна детермінанта", що використовується тут, означає частину молекули антигену, а в цьому випадку, поліпептид РАРАР, який визначає специфічність реакції "антиген-антитіло". Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту поліпептиду. Епітоп може містити, принаймні, 3 амінокислоти в просторовій конформації, яка є унікальною для цього епітопу. В основному, епітоп містить, принаймні, 6 таких амінокислот, а звичайно, принаймні, 8-10 таких амінокислот. Методами визначення амінокислот, що є в епітопі, є рентгенівська кристалографія, 2-мірний ядерний магнітний резонанс і картування епітопу, наприклад, [метод Pepscan, описаний Geysen et al. 1984; в публікації РСТ № WO 84/03564; і в п ублікації РСТ № WO 84/03506]. В описі даного винаходу термін "експресійна нуклеотидна послідовність" може означати або полінуклеотид, або нуклеїнову кислоту. Більш точно, термін "експресійна нуклеотидна послідовність" охоплює сам нуклеїновий матеріал, і, таким чином, не обмежується інформацією про послідовність (тобто послідовності букв, вибраної для позначення буквеного коду з чотирьох основ), яка біохімічно характеризує конкретну молекулу ДНК або РНК). Взаємозамінні терміни "нуклеїнові кислоти", "олігонуклеотиди" і "полінуклеотиди", що використовуються тут, означають послідовності РНК, ДНК або гібридні послідовності РНК/ДНК, що складаються з більш ніж одного нуклеотиду, або в одноланцюговій, або в дуплексній формі. Термін "нуклеотидний", що використовується тут як прикметник, означає молекули, що містять РНК, ДНК або гібридні послідовності РНК/ДНК будь-якої довжини в одноланцюговій або в дуплексній формі. Термін "нуклеотид", що використовується тут як іменник, означає окремі нуклеотиди або ряд нуклеотидів, тобто молекулу або окрему ланку в більш великій молекулі нуклеїнової кислоти, що містить пурин або піримідин, рибозну або дезоксирибозну частину і фосфатн у гр уп у, або фосфодіефірний зв'язок у випадку, коли нуклеотиди знаходяться всередині олігонуклеотиду або полінуклеотиду. Хоча термін "нуклеотид", що ви 14 користовується тут, о хоплює "модифіковані нуклеотиди", які містять, принаймні, одну з модифікацій: (а) альтернативну зв'язуючу гр упу, (b) аналогічну форму пурину, (с) аналогічну форму піримідину або (d) аналогічний цукор, наприклад, аналогічні зв'язувальні групи, пурин, піримідин і цукор, [див., наприклад, РСТ-публікацію № W095/04064]. Полінуклеотидні послідовності даного винаходу можуть бути одержані будь-якими відомими методами, включаючи методи синтезу, метод рекомбінантних ДНК, метод ех vivo-генерування або їх комбінації, а також будь-які методи очищення, відомі фахівцям. Послідовність, яка є "функціонально пов'язаною" з регуляторною послідовністю, такою як промотор, означає, що вказаний регуляторний елемент знаходиться в правильній локалізації і орієнтації по відношенню до нуклеїнової кислоти, і тим самим забезпечує регуляцію ініціації РНКполімерази і експресію потрібної нуклеїнової кислоти. Термін "функціонально приєднаний", що використовується тут, відноситься до приєднання полінуклеотидних елементів у функціональній залежності. Так, наприклад, промотор або енхансер вважаються "функціонально приєднаними" до кодуючої послідовності, якщо вони впливають на транскрипцію даної кодуючої послідовності. Терміни "ознака" і "фетотип", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають будь-яку видиму, детектовану або як-небудь інакше визначену властивість організму, таку як, наприклад, симптоми або чутливість до захворювання. Звичайно терміни "ознаку" і "фетотип", що використовуються тут, означають симптоми або чутливість до захворювання, позитивну відповідь на лікування або побічні ефекти, асоційовані з цим лікуванням. Переважно, вказаними ознаками можуть бути, але не обмежуються ними, злоякісні пухлини, онтогенетичні захворювання і нервові хвороби. Термін "алель", що використовується тут, означає варіанти нуклеотидної послідовності. Біалельний поліморфізм має дві форми. Дипольні організми можуть бути гомозиготними або гетерозиготними за алельною формою. Термін "генотип", що використовується тут, означає ідентичність алелей, присутніх у індивідуума або в зразку. У контексті даного винаходу, "генотип" переважно, означає опис біалельних маркерних алелей, присутніх у індивідуума або в зразку. Термін "визначення генотипу" зразка або індивідуума за біалельним маркером означає визначення специфічного алеля або специфічного нуклеотиду, присутнього в біалельному маркері у даного індивідуума. Термін "мутація", що використовується тут, означає відмінність в ДНК-послідовностях між різними геномами або індивідуумами, або в межах одного генома або індивідуума, частота зустрічальності якого складає менше 1%. Термін "поліморфізм", що використовується тут, означає присутність двох або декількох альтернативних геномних послідовностей або алелей в різних геномах або індивідуумах, або в одному геномі або індивідуумі. Термін "поліморфний" відноситься до стану, при якому в популяції можуть 15 79582 бути виявлені два або декілька варіантів специфічної геномної послідовності. Термін "поліморфний сайт" означає локус, в якому є зміна. Однонуклеотидний поліморфізм означає заміну одного нуклеотиду іншим нуклеотидом в поліморфному сайті. Делеція одного нуклеотиду або інсерція одного нуклеотиду також приводить до однонуклеотидного поліморфізму. У контексті даного винаходу термін "однонуклеотидний поліморфізм", переважно, означає заміну в одному нуклеотиді. Звичайно, у різних індивідуумів, поліморфний сайт може бути зайнятий двома різними нуклеотидами. Терміни "біалельний поліморфізм" і "біалельний маркер", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають однонуклеотидний поліморфізм, що має два алелі з високою частотою зустрічальності в даній понуляції. Термін "біалельний макерний алель" означає нуклеотидні варіанти, присутні в біалельному маркерному сайті. Термін "розташований вище", що використовується тут, відноситься до вказівки місцеположення в напрямі до 5'-кінця полінуклеотиду від конкретної вихідної точки. Терміни "пари нуклеотидів" і "пари основ Уотсона і Крику", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають нуклеотиди, які можуть бути пов'язані один з одним водневим зв'язком завдяки ідентичності їх послідовностей так, як це спостерігається в двоспіральній ДНК з тиміновими або урацильними залишками, пов'язаними з аденіновими залишками двома водневими зв'язками і з цитозиновими і гуаніновими залишками, пов'язаними трьома водневими зв'язками [див. Stryer, L., Biochemystry 4-th edition, 1995]. Терміни "комплементарний" або "його комплемент", що використовуються тут, відносяться до послідовностей полінуклеотидів, які здатні утворювати пари основ Уотсона і Крику з іншим конкретним полінуклеотидом протягом всієї комплементарної області. Відповідно до даного винаходу вважається, що перший олігонуклеотид комплементарний іншому полінуклеотиду, якщо кожна основа першого полінуклеотиду спарена з комплементарною йому основою. Звичайно комплементарними основами вважаються А і Τ (або А і U), або С і G. Термін "комплемент", що використовується тут, є синонімом "комплементарного полінуклеотиду", "комплементарної нуклеїнової кислоти" і "комплементарної нуклеотидної послідовності". Ці терміни застосовуються до пар полінукліотидів, виходячи лише тільки з їх послідовностей, але не мають ніякого відношення до умов, за яких ці два полінуклеотиди фактично зв'язуються. Варіанти і фрагменти 1. Полінуклеотиди Даний винахід також відноситься до варіантів і фрагментів описаних тут полінуклеотидів, а зокрема, до гена РАРАР, що містить один або декілька біалельних маркерів даного винаходу. Термін "варіанти полінуклеотидів", що використовується тут, означає полінуклеотиди, які відрізняються від відомого полінуклеотиду. Варіант полінуклеотиду може бути природним варіантом, таким як природний алельний варіант, або він мо 16 же являти собою варіант, який не зустрічається в природі. Такі неприродні варіанти полінуклеотиду можуть бути одержані методами мутагенезу, включаючи методи, що використовуються для мутагенезу полінуклеотидів, клітин або організмів. Звичайно, відмінності між ними є незначними, тобто нуклеотидні послідовності відомого полінуклеотиду і варіанту мають більшу схожість, а на деяких ділянках, вони взагалі ідентичні. Відповідно до даного винаходу, варіантами полінуклеотидів є, але не обмежуються ними, нуклеотидні послідовності, які, принаймні, на 95% ідентичні полінуклеотиду SEQ ID NO:1 або 3, або будь-якому полінуклеотидному фрагменту, що складається з 12 суміжних нуклеотидів полінуклеотиду SEQ ID NO:1 або 3, а переважно, принаймні, на 99%, більш переважно, принаймні, на 99,5%, а найбільш переважно, принаймні, на 99,8% ідентичні полінуклеотиду SEQ ID NO:1 або 3 або будьякому полінуклеотидному фрагменту, що складається з 12 суміжних нуклеотидів полінуклеотиду SEQ ID NO:1 або 3. Нуклеотидні модифікації, присутні у варіанті полінуклеотиду, можуть бути такими, що мовчать, а це означає, що вони не приводять до зміни амінокислот, що кодуються цим полінуклеотидом. Однак, нуклеотидні модифікації можуть також приводити до замін, додавань, делецій, інсерцій і зрізання амінокислот в поліпептиді, що кодується відомою послідовністю. Ці заміни, делеції або додавання можуть включати один або декілька нуклеотидів. Вказані варіанти можуть мати модифікації в кодуючій або некодуючій області, або в тій і іншій. Зміни в кодуючій області можуть приводити до продукування консервативних або неконсервативних амінокислотних замін, делецій або додавань. У контексті даного винаходу, в особливо переважному його варіанті, даний винахід відноситься до полінуклеотидів, що кодують поліпептиди, які, в основному, зберігають ту ж саму біологічну функцію або активність, що і зрілий білок РАРАР, або до полінуклеотидів, що кодують поліпептиди, які зберігають або мають підвищену яку-небудь певну біологічну активність, але знижену яку-небудь іншу біологічну активність. Полінуклеотидний фрагмент означає полінуклеотид, що має послідовність, яка, загалом, ідентична, але не всій даній нуклеотидній послідовності, а переважно, нуклеотидній послідовності гена РАРАР і його варіантів. Цей фрагмент може бути частиною інтрону або екзону гена РАРАР. Він може бути також частиною регуляторних областей РАРАР. Такі фрагменти можуть бути знаходитися у "вільному стані", тобто вони не є частиною інших полінуклеотидів або не пов'язані з іншими полінуклеотидами, або вони можуть знаходитися в одному більш великому полінуклеотиді, частину або ділянку якого вони утворюють. Дійсно, декілька з цих фрагментів можуть бути присутніми в одному більш великому полінуклеотиді. Необов'язково такі фрагменти можуть складатися, або, в основному, складатися з безперервної ділянки, принаймні, з 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 17 79582 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів. 2. Поліпептиди Даний винахід також відноситься до варіантів, фрагментів, аналогів і похідних описаних тут поліпептидів, включаючи мутовані білки РАРАР. Таким варіантом може бути 1) варіант, в якому один або декілька амінокислотних залишків замінені консервативними або неконсервативними амінокислотними залишками, і такі замінені амінокислотні залишки можуть кодуватися, а можуть і не кодуватися генетичним кодом, або 2) варіант, в якому один або декілька амінокислотних залишків включають заміщуючу гр упу або 3) варіант, в якому мутований РАРАР приєднаний до іншої сполуки, такої як сполука, яка збільшує час півжиття поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь), або 4) варіант, в якому до мутованого РАРАР приєднані додаткові амінокислоти, такі як лідерна або секреторна послідовність або послідовність, яка використовується для очищення мутованого РАРАР або передпослідовності білка. Очевидно, що такі варіанти входять в об'єм даного винаходу. Поліпептидний фрагмент являє собою поліпептид, що має послідовність, яка повністю аналогічна частині, але не всій послідовності даного поліпептиду, а переважно, поліпептид, що кодується геном РАРАР і його варіантами. У разі заміни амінокислот в амінокислотній послідовності поліпептиду даного винаходу одна або декілька амінокислот можуть бути замінені "еквівалентними" амінокислотами. Термін експресована "еквівалентна" амінокислота, що використовується тут, використовується для позначення будьякої амінокислоти, яка може бути заміщена однією з амінокислот, що має аналогічні властивості, які, наприклад, як відомо фахівцеві в області пептидної хімії, в основному, не повинні змінювати передбачувану вторинну структур у і гідропатичну природу даного поліпептиду. Звичайно, еквівалентні заміни можуть бути зроблені в межах нижченаведених груп амінокислот: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, He, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His. Конкретними варіантами модифікованої пептидної молекули РАРАР, що представляє інтерес для даного винаходу, є, але не обмежуються ними, пептидна молекула, яка володіє резистентністю до протеолізу; пептид, в якому пептидний зв'язок -CONH- модифікований і замінений на відновлений зв'язок (CH2NH), ретро-інверсозв'язок (NHCO), метиленокси-зв'язок (СН2О), тіометиленовий зв'язок (CH2S), карба-зв'язок (СН2СН2), цетометиленовий зв'язок (СО-СН2), гідроксіетиленовий зв'язок (СНОН-СН2), зв'язок (NN), Е-альценовий зв'язок або також зв'язок СН=СН-. Даний винахід також відноситься до людського поліпептиду РАРАР або до його фрагмента або варіанту, в яких, принаймні, один пептидний зв'язок був модифікований як описано вище. Вказані фрагменти можуть знаходитися у "вільному стані", тобто не є частиною інших поліпептидів або не бути приєднаними до інших поліпептидів, або вони можуть знаходитися в одному 18 більш великому поліпептиді, частину або область якого вони утворюють. Однак, в одному більш великому поліпептиді можуть знаходитися декілька фрагментів. Як репрезентативні приклади поліпептидних фрагментів даного винаходу можуть бути згадані фрагменти, що мають довжину приблизно в 5, 6, 8, 9 або 10-15, 10-20, 15-40 або 30-55 амінокислот. Переважними є фрагменти, що містять, принаймні, одну амінокислотну мутацію в білці РАРАР . Ідентичність між нуклеїновими кислотами або поліпептидами Терміни "процент ідентичності послідовності" і "процент гомології", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають міру ідентичності і гомології полінуклеотидів і поліпептидів, яка визначається шляхом порівняння двох первинних послідовностей, що оптимально зіставляються у "вікні порівняння", де частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності в даному "вікні" порівняння може містити додавання або делеції (тобто пропуски) в порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить цих додавань або делецій), де ці додавання або делеції були внесені для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Процент обчислюють шляхом визначення числа положень, в яких знаходяться ідентичні основи нуклеїнової кислоти або амінокислотні залишки в обох послідовностях, внаслідок чого одержують число відповідних положень, ділять одержане число відповідних положень на загальне число положень у "вікні" порівняння і одержаний результат множать на 100 з одержанням процента ідентичності послідовностей. Гомологію оцінюють з використанням будь-якого ряду алгоритмів і програм для порівняння послідовностей, відомих фахівцям. Такими алгоритмами і програмами є, але не обмежуються ними, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA і CLUSTALW (Pearson & Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altdchul et al., 1990; Altschul et al., 1993). В особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу гомологію послідовностей білків і нуклеїнових кислот оцінюють з використанням програми "Basic Local Alignment Search Tool" ("BLAST") (програми пошуку в базах даних за допомогою локального вирівнювання послідовностей), добре відомої фахівцям (див. наприклад, Karlin & Altschul, 1990; Altschul et al., 1990, 1993, 1997). Зокрема, для рішення нижченаведених задач були використані п'ять конкретних програм BLAST: (1) BLASTP і BLASTS здійснюють порівняння амінокислотної послідовності, що запитується, з послідовностями білка бази даних; (2) BLASTN здійснює порівняння нуклеотидної послідовності, що запитується, з нуклеотидними послідовностями бази даних; (3) BLASTX здійснює порівняння концептуальних продуктів трансляції в шести рамках зчитування нуклеотидної послідовності (обох ланцюгів), що запитується, з послідовностями білка бази даних; (4) TBLASTN здійснює порівняння послідовності білка нуклеотидних послідовностей, що запитується, з нуклеотидними послідовностями бази да 19 79582 них, що транслюються у всіх шести рамках зчитування; і (5) TBLASTX здійснює порівняння продуктів трансляції в шести рамках зчитування нуклеотидної послідовності, що запитується, з продуктами трансляції нуклеотидних послідовностей бази даних в шести рамках зчитування. Програми BLAST дозволяють ідентифікувати гомологічні послідовності шляхом ідентифікації аналогічних сегментів, названих тут "пари сегментів з високою оцінкою", для амінокислотної послідовності, що запитується, або послідовності нуклеїнової кислоти і тест-послідовності, яка була одержана, переважно, з бази даних послідовностей білка або нуклеїнової кислоти. Пари сегментів з високою оцінкою переважно ідентифікують (тобто зіставляють) методами, в яких використовують оціночну матрицю, і багато які з яких відомі фахівцям. Переважно, оціночною матрицею, що використовується, є матриця BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff & Henikoff, 1993). Можуть бути також використані матриці РАМ або РАМ250, але вони є менш переважними (див. наприклад, Schwartz & Dayhoff, eds., 1978). Програми BLAST дозволяють оцінювати статистичну значущість всі х ідентифікованих пар сегментів з високою оцінкою, і переважно, відбирати ті сегменти, які задовольняють визначеному користувачем порогу значущості, такому як визначений користувачем процент гомології. Переважно, статистичну значущість пари сегментів з високою оцінкою визначають за формулою статистичної значущості Кагііп (див. наприклад, Karlin & Altschul, 1990). Програми BLAST можуть бути використані з параметрами за умовчанням або з модифікованими параметрами, введеними користувачем. Жорсткі умови гібридизації Для визначення нуклеїнової кислоти, що гібридизується, даного винаходу, були використані наступні жорсткі умови гібридизації: стадію гібридизації здійснюють при 65°С в присутності буфера 6×SSC, 5×розчину Денхардта, 0,5% ДСН і 100мкг/мл ДНК сперми лосося. Після стадії гібридизації здійснюють чотири стадії промивання: - два промивання протягом 5 хвилин, переважно, при 65°С в буфері 2×SSC і 0,1% ДСН; - одне промивання протягом 30 хвилин, переважно, при 6 5 °С в буфері 2×SSC і 0,1% ДСН; - одне промивання протягом 10 хвилин, переважно, при 65°С в буфері 0,1×SSC і 0,1% ДСН, ці умови гібридизації є відповідними для молекули нуклеїнової кислоти довжиною приблизно в 20 нуклеотидів. Немає необхідності пояснювати, що описані вище умови гібридизації повинні бути адаптовані відповідно до довжини потрібної нуклеїнової кислоти методами, добре відомими фахівцям. Відповідні умови гібридизації можуть бути, наприклад, адаптовані відповідно до методів, описаних в книзі Hames & Higgins (1985). Геномні послідовності гена РАРАР Даний винахід відноситься до геномної послідовності РАРАР. Даний винахід охоплює ген РАРАР або геномні послідовності РАРАР, що складаються або в основному складаються з 20 послідовності SEQ ID NO:3, або що містять вказану послідовність; комплементарну їй послідовність; а також її фрагменти і варіанти. Вказані полінуклеотиди можуть бути очищеними, виділеними або рекомбінантними. Нуклеїновими кислотами РАРАР є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або в основному складаються або складаються з вказаної безперервної ділянки, що охоплює, принаймні, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів послідовності SEQ ID NO:3 або комплементарної послідовності. Нуклеїновими кислотами РАРАР можуть бути також виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або в основному складаються або складаються з вказаної безперервної ділянки, що о хоплює, принаймні, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів, вибраних з групи нуклеотидів в положеннях 1-3038, 1421, 422-557, 2158-2218 і 2620-3039 послідовності SEQ ID NO:3 або комплементарної послідовності. Даний винахід також охоплює очищений, виділений або рекомбінантний полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка, принаймні, на 70, 75, 80, 85, 90 або 95% ідентична нуклеотидній послідовності SEQ ID NO:3 або комплементарній послідовності або її фрагменту. Відмінності в нуклеотидах по відношенню до нуклеотидної послідовності SEQ ID N0:3 можуть бути , в основному, випадково розподілені по всій довжині нуклеїнової кислоти. Проте переважними нуклеїновими кислотами є нуклеїнові кислоти, в яких відмінності в нуклеотидах по відношенню до нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:3 переважно локалізовані за межами кодуючих послідовностей, що містяться в екзонах. Ці нуклеїнові кислоти, а також їх фрагменти і варіанти можуть бути використані як олігонуклеотидні праймери або зонди для детекції присутності копії гена РАРАР в зразку, що тестується, або альтернативно, для ампліфікації потрібної нуклеотидної послідовності в послідовностях РАРАР. Ін шим об'єктом даного винаходу є очищена, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота, яка гібридизується в жорстких умовах гібридизації, описаних вище, з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:3 або з її комплементарною послідовністю або з її варіантом. Хоча цей розділ озаглавлений Теномні послідовності РАРАР", однак, потрібно зазначити, що фрагменти нуклеїнової кислоти, що мають будьякий розмір і будь-яку послідовність, можуть також охоплювати описані в цьому розділі полінуклеотиди, що фланкують геномні послідовності РАРАР на будь-якій стороні вказаних геномних послідовностей або між двома або декількома такими послідовностями. кДНК-послідовності РАРАР Було показано, що експресія гена РАРАР приводить до продукування, принаймні, однієї молекули мРНК, нуклеотидна послідовність якої представлена в SEQIDNO:1. Іншим об'єктом даного винаходу є, очищена, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота, 21 79582 що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1; комплементарні їй послідовності, а також її алельні варіанти і фрагменти. Крім того, переважними полінуклеотидами даного винаходу є очи щені, виділені або рекомбінантні кДНК РАРАР , що складаються або в основному складаються з послідовності SEQ ID NO:1, або містять цю послідовність. Особливо переважними нуклеїновими кислотами даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або в основному складаються або складаються з безперервної ділянки, що о хоплює, принаймні, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів послідовності SEQ ID NO:1 або комплементарної послідовності. Нуклеїновими кислотами також є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів SEQ ID NO:1 або комплементарної послідовності, де вказана безперервна ділянка включає, принаймні, 1, 2, 3, 3 або 10 з нижченаведених нуклеотидних положень SEQ ID NO:1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 і 691-1104. Іншими переважними варіантами здійснення даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних н уклеотидів SEQ ID NO:1 або комплементарну послідовність, де вказана безперервна ділянка охоплює біалельний маркер. Даний винахід також відноситься до виділеної або очищеної нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що має, принаймні, 95%-ну ідентичність нуклеотидів з полінуклеотидом SEQ ID NO:1, переважно, 99%-ну ідентичність, переважно, 99,5%-ну ідентичність, а найбільш переважно, 99,8%-ну ідентичність нуклеотидів з полінуклеотидом SEQ ID NO:1, або з комплементарною послідовністю або з її біологічно активним фрагментом. Іншим об'єктом даного винаходу є очищені, виділені або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що містять полінуклеотид, який гібридизується у вищезгаданих жорстких умовах гібридизації з полінуклеотидом SEQ ID NO:1 або з комплементарною послідовністю або з його варіантом або з біологічно активним фрагментом. кДНК SEQ ID NO:1 включає 5'UTR-oблacть, що починається від нуклеотиду в положенні 1 і закінчується нуклеотидом в положенні 86 SEQ ID NO:1. кДНК SEQ ID NO:1 включає 3'UTR-область, що починається від нуклеотиду в положенні 347 і закінчується нуклеотидом в положенні 1104 SEQ ID NO:1. Сигнал поліаденілування починається від нуклеотиду в положенні 1085 і закінчується нуклеотидом в положенні 1104 SEQ ID NO:1. Отже, даний винахід відноситься до очищеної, виділеної або рекомбінантої нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність 5'UTR кДНК РАРАР, комплементарну їй послідовність або її алельний варіант. Даний винахід також відноситься до очищеної, виділеної або нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність 3'UTR 22 кДНК РАРАР, комплементарну їй послідовність або її алельний варіант. Хоча цей розділ озаглавлений "кДНК послідовності РАРАР", однак, потрібно зазначити, що фрагменти нуклеїнової кислоти, що мають будьякий розмір і будь-яку послідовність, можуть також охоплювати описані в цьому розділі полінуклеотиди, що фланкують геномні послідовності РАРАР на будь-якій стороні вказаних геномних послідовностей або між двома або декількома такими послідовностями. Кодуючі послідовності Відкрита рамка зчитування РАРАР міститься у відповідній мРНК SEQ ID NO:1. Більш точно, е фективна кодуюча послідовність РАРАР (CDS) включає область, розташовану між нуклеотидом в положенні 87 (перший нуклеотид кодона АТС) і нуклеотидом в положенні 346 (кінцевий нуклеотид кодона TGA) SEQ ID NO:1. Даний винахід також відноситься до виділених, очищених і рекомбінантних полінуклеотидів, що кодують безперервну ділянку, принаймні, з 6 суміжних амінокислот, переважно, принаймні, 8 або 10 суміжних амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 суміжних амінокислот послідовності SEQ ID NO:2. Вищеописаний полінуклеотид, який містить кодуючу послідовність гена РАРАР, може бути експресований в потрібній клітині-хазяїні або в потрібному організмі-хазяїні при вміщенні цього полінуклеотиду під контроль відповідних сигналів експресії. Сигналами експресії можуть бути або сигнали, що містяться в регуляторних областях в гені РАРАР даного винаходу, або, навпаки, цими сигналами можуть бути екзогенні регуляторні послідовності нуклеїнової кислоти. Такий полінуклеотид, що вміщується під контроль відповідних сигналів експресії, може бути також вбудований у вектор для його експресії і/або ампліфікації. Регуляторні послідовності РАРАР Як згадувалося вище, геномна послідовність гена РАРАР містить регуляторні послідовності в некодуючій 5'-фланкуючій області і в некодуючій 3'-фланкуючій області, яка межує з кодуючою областю РАРАР, що містить три екзони цього гена. Полінуклеотиди, що походять від 5'- і 3'регуляторних областей, можуть бути використані для детекції присутності, принаймні, однієї копії нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:3 або її фрагмента в зразку, що тестується. Промоторна активність 5'-регуляторних областей, що знаходяться в РАРАР, може бути оцінена, як описано нижче. Для ідентифікації відповідних біологічно активних полінуклеотидних фрагментів або варіантів SEQ ID NO:3 потрібно звернутися до книги Sambrook et al. (Sambrook, 1989), де описано використання рекомбінантного вектора, що несе маркерний ген (тобто ген бета-галактозидази, хлорамфеніколацетилтрансферази і т.п.), експресія якого може детектуватись при його вміщенні під контроль біологічно активних полінуклеотидних фрагментів або варіантів SEQ ID NO:3. Геномні 23 79582 послідовності, локалізовані вище першого екзону гена РАРАР, клонували в репортерний вектор з відповідним промотором, таким як pSEAP-основа, pSEAP-енхансер, pPgal-ocнова, pPgal-eнxaнcep, або в репортерні вектори з відповідним промотором, pEGFP-1, що ви готовляються Clontech, або вектор "pGL2-ocновa" або pGL3-основа з репортерним геном люциферази без промотору, що виготовляється Promega. Коротко, кожний з цих векторів з промотором включає сайти множинного клонування, розташовані вище репортерного гена, що кодує білок, який легко оцінюється, такий як секретована лужна фосфатаза, люцифераза, βгалактозидаза або білок, який флуоресціює в "зеленому" діапазоні спектра. Послідовності, розташовані вище кодуючої області РАРАР , вбудовують в сайти клонування вище від репортерного гена в обох орієнтаціях, і вводять у відповідну клітинухазяїна. Рівень репортерного білка аналізують і порівнюють з рівнем, одержаним від вектора, у якого відсутня вставка в сайті клонування. Підвищений рівень експресії у векторі, що містить цю вставку, в порівнянні з контрольним вектором, вказує на присутність промотору в даній вставці. Якщо необхідно, то вищерозташовані послідовності можуть бути клоновані у вектори, що містять енхансер для підвищення рівня транскрипції, здійснюваної під контролем послідовностей слабкого промотору. Значний рівень вищезгаданої експресії, що спостерігається у векторі, у якого відсутня вставка, вказує на те, що промоторна послідовність присутня у вбудованій вищерозташованій послідовності. Промоторна послідовність у вищерозташованій геномній ДНК може бути потім визначена шляхом конструювання гніздових 5' і/або 3' делецій у вищерозташованій ДНК з використанням стандартної техніки, такої як гідроліз екзонуклеазою III або відповідною рестриктуючою ендонуклеазою. Одержані делеційні фрагменти можуть бути вбудовані в репортерний вектор з промотором для того, щоб визначити, чи надає ця делеція ослабляючий або повністю інгібуючий вплив на активність промотору, такий, як, наприклад, описано в роботі Coles et al. (1998), опис якої у всій своїй повноті вводиться в дану заявку за допомогою посилання. Таким чином, можуть бути визначені межі цих промоторів. Якщо це необхідно, то потенційні окремі регуляторні сайти всередині цього промотору можуть бути ідентифіковані з використанням сайтнаправленого мутагенезу або лінкерного сканування або окремо, або в комбінації для елімінації потенційних сайтів скріплення з факторами транскрипції всередині цього промотору. Вплив цих мутацій на рівні транскрипції може бути визначений шляхом введення мутацій в сайти клонування в репортерні вектори з промотором. Аналізи такого типу добре відомі фахівцям і [описані в WO 97/17359, в патенті СІЛА №5374544; в ЕР 582796; в патенті США №5698389; в патенті США №5643746; в патенті США №5502176 і в патенті США №5266488]; опис яких у всій своїй повноті вводяться в дану заявку за допомогою посилання. Сила і специфічність промотору гена РАРАР може бути оцінена за рівнями експресії детектова 24 ного полінуклеотиду, функціонально пов'язаного з промотором РАРАР, в клітинах і тканинах різних типів. Детектований полінуклеотид може бути або полінуклеотидом, який специфічно гібридизується із заздалегідь визначеним олігонуклеотидним зондом, або з полінуклеотидом, що кодує детектований білок, включаючи поліпептид РАРАР або його фрагмент або варіант. Цей тип аналізу добре відомий фахівцям і [описаний в патенті США № 5502176 і в патенті США № 5266488], опис яких у всій своїй повноті вводяться в дану заявку за допомогою посилання. Деякі з цих методів більш детально описані нижче. Полінуклеотиди, що несуть регуляторні елементи, локалізовані у 5'-кінця і у 3'-кінця кодуючої області РАРАР, можуть бути використані переважно для регуляції транскрипційної і трансляційної активності потрібного гетерологічного полінуклеотиду. Таким чином, даний винахід також відноситься до очищеної або виділеної нуклеїнової кислоти, що включає полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з 5'- і 3'-регуляторних областей, або до комплементарної послідовності або до її біологічно активного фрагмента або варіанту. У одному з своїх аспектів "5'-регуляторна область" містить нуклеотидну послідовність, локалізовану між положеннями 1 і 421 SEQ ID NO:3. У одному з аспектів даного винаходу "3'-регуляторна область" містить нуклеотидну послідовність, локалізовану між положеннями 3040 і 3189 SEQ ID NO:3. Даний винахід також відноситься до очищеної або виділеної нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що має, принаймні, 95%-ну ідентичність нуклеотидів з полінуклеотид ом SEQ ID NO:1, вибраним з групи, що складається з 5'- і 3'регуляторних областей, переважно, 99%-ну ідентичність, переважно, 99,5%-ну ідентичність, а найбільш переважно, 99,8%-ну ідентичність з полінуклеотидом SEQ ID NO:1, вибраним з групи, що складається з 5'- і 3'-регуляторних областей, або з комплементарною послідовністю або його біологічно активним фрагментом. Іншим об'єктом даного винаходу є очи щена або виділена нуклеїнова кислота, що містить полінуклеотид, який гібридизується в описаних тут жорстких умовах гібридизації, описаних вище, з полінуклеотидом, вибраним з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей 5'- і 3'регуляторних областей, або з комплементарною послідовністю або з його варіантом або біологічно активним фрагментом. Переважні фрагменти 5'-регуляторної області мають довжину приблизно 1500 або 1000 нуклеотидів, а переважно, приблизно 500 нуклеотидів, більш переважно, приблизно 400 нуклеотидів, ще більш переважно, 300 нуклеотидів, а найбільш переважно, приблизно 200 нуклеотидів. Переважні фрагменти 3'-регуляторної області мають довжину, принаймні, 50, 100,150, 200, 300 або 400 основ. "Біологічно активними" похідними полінуклеотидів SEQ ID NO:3 є полінуклеотиди, що містять фрагмент, або, альтернативно, які містяться у фрагменті вказаного полінуклеотиду, який є функ 25 79582 ціональною регуляторною областю, що контролює експресію рекомбінантного поліпептиду або рекомбінантного полінуклеотиду в рекомбінантній клітині-хазяїні. Він може діяти як енхансер або як репресор. Відповідно до даного винаходу, н уклеїнова кислота або полінуклеотид є "функціональними" як регуляторна область, що контролює експресію рекомбінантного поліпептиду або рекомбінантного полінуклеотиду, в тому випадку, якщо вказаний регуляторний полінуклеотид має нуклеотидні послідовності, які містять транскрипційні і трансляційні регуляторні послідовності, і такі послідовності є "функціонально приєднаними" до нуклеотидних послідовностей, які кодують потрібний поліпептид або потрібний полінуклеотид. Регуляторні полінуклеотиди даного винаходу можуть бути одержані з нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:3 шля хом розщеплення відповідними рестриктуючими ферментами, як описано, наприклад, в книзі Sambrook et al. (1989). Регуляторні полінуклеотиди можуть бути також одержані шляхом гідролізу SEQ ID NO:3 ферментом екзонуклеазою, такою як Ва131 (Wabiko et al., 1986). Ці регуляторні полінуклеотиди можуть бути також одержані шляхом хімічного синтезу нуклеїнових кислот, як описано в даній заявці. Регуляторні полінуклеотиди даного винаходу можуть бути частиною рекомбінантного експресуючого вектора, який може бути використаний для експресії кодуючої послідовності в потрібній клітині-хазяїні або в організмі-хазяїні. Рекомбінантні експресуючі вектори даного винаходу описані в даній заявці. Переважно, 5'-регуляторний полінуклеотид даного винаходу включає 5'-нетрансльовану область (5'UTR) кДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант. Переважно, 3'-регуляторний полінуклеотид даного винаходу включає 3'-нетрансльовану область (3'UTR) кДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант. Іншим об'єктом даного винаходу є очи щена або виділена нуклеїнова кислота, що включає: a) нуклеїнову кислоту, що містить регуляторну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: (і) нуклеотидної послідовності, що містить полінуклеотид 5'-регуляторної області, або комплементарної їй послідовності; (іі) нуклеотидної послідовності, що містить полінуклеотид, що має, принаймні, 95%-ну ідентичність з нуклеотидною послідовністю 5'регуляторної області, або комплементарної їй послідовності; (ііі) нуклеотидної послідовності, що містить полінуклеотид, який гібридизується в жорстких умовах гібридизації з нуклеотидною послідовністю 5'регуляторної області, або з комплементарною послідовністю; і (iv) біологічно активного фрагмента або варіанту полінуклеотидів в (і), (іі) і (iiі); b) полінуклеотид, що кодує потрібний поліпептид або потрібну нуклеїнову кислоту і функціона 26 льно приєднаний до нуклеїнової кислоти, визначеної вище в (а); c) необов'язково, нуклеїнову кислоту, що містить 3'-регуляторний полінуклеотид, переважно, 3'регуляторний полінуклеотид гена ΡАРАР. У конкретному варіанті визначеної вище нуклеїнової кислоти вказана нуклеїнова кислота включає 5'-нетрансльовану область (5'UTR) кДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант. У другому конкретному варіанті визначеної вище н уклеїнової кислоти вказана нуклеїнова кислота включає 3'-нетрансльовану область (3'UTR) кДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант. Регуляторний полінуклеотид 5'-регуляторної області або його біологічно активні фрагменти або варіанти функціонально приєднані у 5'-кінця полінуклеотиду, що кодує потрібний поліпептид або полінуклеотид. Регуляторний полінуклеотид 3'-регуляторної області або його біологічно активні фрагменти або варіанти функціонально приєднані переважно у 3'кінця полінуклеотиду, що кодує потрібний поліпептид або полінуклеотид. Потрібний поліпептид, що кодується вищеописаною нуклеїновою кислотою, може мати будь-яку природу або будь-яке походження, включаючи білки прокаріотів або еукаріотів. Поліпептидами, експресованими під контролем регуляторної області РАРАР, є бактеріальні, грибкові або вірусні антигени. Такі поліпептиди також охоплюють еукаріотичні білки, такі як внутрішньоклітинні білки, наприклад, білки "домашнього господарства", мембрано-асоційовані білки, такі, як рецептори, і секретовані білки, наприклад, ендогенні медіатори, такі як цитокіни. Потрібним поліпептидом може бути білок РАРАР, а зокрема, білок амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2 або її фрагмент або варіант. Потрібні нуклеїнові кислоти, що кодуються вищезгаданим полінуклеотидом, звичайно РНКмолекула, можуть бути комплементарні потрібному кодуючому полінуклеотиду, наприклад, РАРАРкодуючій послідовності, а тому вони можуть бути використані як антисмисловий полінуклеотид. Такий полінуклеотид може бути включений в рекомбінантний експресуючий вектор для експресії потрібного поліпептиду або потрібної нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні або організмі-хазяїні. Відповідні рекомбінантні вектори, які містять визначений тут полінуклеотид, описані в інших розділах даної заявки. Полінуклеотидні конструкції Терміни "полінуклеотидна конструкція" і "рекомбінантний полінуклеотид", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають лінійний або кільцевий, очищений або виділений полінуклеотид, який був штучно сконструйований, і який містить, принаймні, дві нуклеотидних послідовності, що не є суміжними нуклеотидними послідовностями в їх природному оточенні. ДНК-конструкція, яка регулює тимчасову і просторову експресію гена РАРАР в рекомбінантних клітинах-хазяях і в трансгенних тваринах 27 79582 Для дослідження фізіологічних і фенотипічних наслідків відсутності синтезу білка РАРАР, як на клітинному рівні, так і в багатоклітинному організмі, даний винахід також охоплює ДНК-конструкції і рекомбінантні вектори, що забезпечують залежну від зовнішніх умов експресію специфічного алеля геномної послідовності або кДНК-послідовності гена РАРАР, а також копії цієї геномної послідовності або кДНК, що має заміни, делеції або додавання однієї або декількох основ, в порівнянні з нуклеотидною послідовністю РАРАР SEQ ID NO:1 і 3, або її фрагментом, де вказані заміни, делеції або додавання основ є або в екзоні, або в інтроні, або в регуляторній послідовності, але переважно, в 5'-регуляторній послідовності або в екзоні геномної послідовності РАРАР або в кДНК РАРАР SEQ ID NO:1. У переважному варіанті здійснення винаходу послідовність РАРАР містить біалельний маркер. Даний винахід відноситься до рекомбінантних векторів, що містять будь-який з полінуклеотидів, описаних в даному винаході. Більш конкретно, полінуклеотидні конструкції даного винаходу можуть включати будь-який полінуклеотид, описаний в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", "кДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі області" і "Олігонуклеотидні зонди і праймери". Перша переважна ДНК-конструкція основана на опероні резистентності до тетрацикліну tet, що походить від транспозону Τn10 E.coli, і що використовується для регуляції експресії гена РАРАР, як описано Gossen et al. (1992, 1995) і Furth et al. (1994). Така ДНК-конструкція містить сім операторних послідовностей tet від Tn10 (tetop), які приєднані або до мінімального промотору, або до 5'регуляторної послідовності гена РАРАР, де вказаний мінімальний промотор або вказана регуляторна послідовність гена РАРАР функціонально приєднана до потрібного полінуклеотиду, який кодує смисловий або антисмисловий олігонуклеотид, або поліпептид, включаючи поліпептид РАРАР або його пептидний фрагмент. Ця ДНК-конструкція є функціональною відносно залежною від зовнішніх умов експресії потрібної нуклеотидної послідовності, в тому випадку, коли та ж сама клітина також містить нуклеотидну послідовність, що кодує репресор дикого типу (tTA) або мутантний репресор (rТА), приєднаний до активуючого домену вірусного білка VP16 вірусу простого герпеса, що знаходиться під контролем промотору, такого як енхансер/промотор HCMVIE1 MMTV-LTR. Дійсно, переважна ДНК-конструкція даного винаходу включає полінуклеотид, що містить послідовності оператора tet, і полінуклеотид, що містить послідовність, що кодує репресор tTA або rТА. У конкретному варіанті здійснення винаходу ДНК-конструкція із залежною від зовнішніх умов експресією містить послідовність, що кодує мутантний тетрацикліновий репресор rТА, де експресія потрібного полінуклеотиду не відбувається у відсутності тетрацикліну і індукується в його присутності. ДНК-конструкції. що сприяють гомологічній рекомбінації: вектори заміщення 28 Друга переважна ДНК-конструкція містить від 5'-кінця до 3'-кінця: (а) першу нуклеотидну послідовність, яка міститься в геномній послідовності РАРАР; (Ь) нуклеотидну послідовність, що містить маркер позитивного відбору, такий як маркер резистентності до неоміціну (nео); і (с) другу н уклеотидну послідовність, яка знаходиться в геномній послідовності РАРАР і розташована на геномі нижче першої нуклеотидної послідовності РАРАР (а). У переважному варіанті здійснення винаходу ця ДНК-конструкція також включає маркер негативного відбору, розташованого вище нуклеотидної послідовності (а) або нижче нуклеотидної послідовності (с). Маркер негативного відбору, переважно, містить ген тимідинкінази (tk) (Thomas et al., 1986), ген гігроміцину-бета (Те Riele et al., 1990), ген hprt (Van der Lugt et al., 1991; Reid et al., 1990) або ген фрагмента дифтерійного токсину A (Dt-A) (Nada et al., 1993; Yagi et al., 1990). Маркер позитивного відбору, переважно, локалізований в послідовності екзону РАРАР, так, що він перериває послідовність, що кодує білок РАРАР. Ці вектори заміщення описані, наприклад, Thomas et al. (1986; 1987), Mansour et al. (1988) і Roller etal. (1992). Перша і друга н уклеотидні послідовності (а) і (с) можуть бути незалежно локалізовані в регуляторній послідовності РАРАР, в інтронній послідовності, в екзонній послідовності або в послідовності, що містить регуляторну і/або інтронну і/або екзонну послідовності. Розмір нуклеотидних послідовностей (а) і (с) складає в межах від 1 до 50 т.п.н., переважно, від 1 до 10 т.п.н., більш переважно, від 2 до 6 т.п.н., а найбільш переважно, від 2 до 4 т.п.н. ДНК-конструкції, що сприяють гомологічній рекомбінації: система Сrе-1охР Ці нові ДНК-конструкції дозволяють використати сайт-специфічну рекомбінантну систему фага Р1. Цей фаг Р1 має рекомбіназу, позначену Сrе, яка специфічно взаємодіє з 34 парами основ сайта 1οхΡ. Сайт 1οхΡ складається з двох паліндромних послідовностей у 13 п.н., розділених консервативною послідовністю у 8 п.н. (Hoess et. al., 1986). Рекомбінація під дією ферменту Сге між двома сайтами 1οхΡ, що мають ідентичну орієнтацію, приводить до делеції ДНК-фрагмента. Система Cre-1oxP, що використовується в комбінації з технікою гомологічної рекомбінації, була вперше описана Gu et al. (1993, 1994). Коротко, потрібна нуклеотидна послідовність, що вбудовується в потрібне положення геному, має, принаймні, два сайти 1охР в тій же самій орієнтації і розташована у відповідних кінців нуклеотидної послідовності, що вирізається з рекомбінантного геному. Для такого вирізання потрібна присутність ферменту рекомбінази (Сrе) в ядрі рекомбінантної клітини-хазяїна. Фермент рекомбіназа може "занускатися" в потрібний час або за допомогою (а) інкубування рекомбінантних клітин-хазяїв в культуральному середовищі, що містить цей фермент, шляхом ін'єкції ферменту Сrе безпосередньо в потрібну клітину, як описано Araki et al (1995), або шляхом ліпофекції цього ферменту в клітини, як описано Baubonis et al. (1993); (b) трансфекції клі 29 79582 тини-хазяїна вектором, що містить послідовність, що кодує Сrе і функціонально приєднану до промотору, що є функціональним в рекомбінантній клітині-хазяїні і необов'язково індуцибельним, де вказаний вектор вводять в рекомбінантну клітинухазяїна, як описано Gu et al. (1993) і Sauer et al. (1988); (с) введення в геном клітини-хазяїна полінуклеотиду, що містить послідовність, що кодує Сrе і функціонально приєднану до промотору, що є функціональним в рекомбінантній клітині-хазяїні і необов'язково індуцибельним, де вказаний полінуклеотид вбудовують в геном клітини-хазяїна або шляхом довільної інсерції, або гомологічної рекомбінації, як описано Gu et al. (1994). У конкретному варіанті здійснення винаходу вектор, що містить послідовність, що вбудовується в ген РАРАР шляхом гомологічної рекомбінації, конструюють так, щоб селективні маркери були фланковані сайтами 1охР в тій же самій орієнтації, якщо це можливе, шляхом обробки ферментом Сге для елімінації селективних маркерів, ще присутніх в потрібних послідовностях РАРАР , які були інсертовані шляхом гомологічної рекомбінації. І в цьому випадку необхідні два селективних маркери: маркер позитивного відбору для відбору на подію рекомбінації і маркер негативного відбору для відбору на подію гомологічної рекомбінації. Вектори і методи з використанням системи Cre-1oxP описані Zou et al. (1994). Таким чином, третя переважна ДНКконструкція включає від 5'-кінця до 3'-кінця: (а) першу нуклеотидну послідовність, яка міститься в геномній послідовності PAP АР; (b) нуклеотидну послідовність, що містить полінуклеотид, що кодує маркер позитивного відбору, де вказана нуклеотидна послідовність містить дві додаткові послідовності, що визначають сайт, розпізнаваний рекомбіназою, такою як сайт 1οхΡ, причому два цих сайти знаходяться в одній і тій же орієнтації; і (с) другу н уклеотидну послідовність, яка знаходиться в геномній послідовності РАРАР і розташована нагеномі нижче першої нуклеотидної послідовності РАРАР (а). Послідовності, що визначають сайт, розпізнаваний рекомбіназою, такою як сайт ΙοχΡ, переважно, локалізовані в нуклеотидній послідовності (b) у відповідних положеннях, що фланкують нуклеотидну послідовність, яка повинна бути вирізана в залежності від оточуючи х умов. В одному з варіантів здійснення винаходу два сайти 1οхΡ локалізовані з кожної сторони послідовності маркера позитивного відбору так, щоб її вирізання відбувалося в потрібний час після події гомологічної рекомбінації. У переважному варіанті способу, що передбачає використання третьої ДНК-конструкції, описаної вище, вирізання полінуклеотидного фрагмента, фланкованого двома сайтами, розпізнавані рекомбіназою, переважно, двома сайтами 1οхΡ, здійснюється в потрібний час, завдяки присутності в геномі рекомбінантної клітини-хазяїна послідовності, що кодує фермент Сrе, функціонально приєднаний до промоторної послідовності, а переважно, до індуцибельного промотору, більш переважно, до тканеспецифічної промоторної послідовності, а 30 найбільш переважно до промоторної послідовності, яка є індуцибельною і тканиноспецифічною, як описано Gu et al. (1994). Присутність ферменту Сrе в геномі рекомбінантної клітини-хазяїна може бути результатом схрещування двох трансгенних тварин, першої трансгенної тварини, що несе потрібну послідовність, яка походить від РАРАР і містить сайти 1охΡ, як описано вище, і другої трансгенної тварини, що несе послідовність, яка кодує Сrе і функціонально приєднана до відповідної промоторної послідовності, як описано Gu et al. (1994). Просторово-часова регуляція експресії ферменту Сrе може бути також досягнута з використанням вектора на основі аденовірусу, що містить ген Сrе, який дозволяє інфікувати клітини або in vi vo інфікувати органи для доставки ферменту Сrе, як описано Anton & Graham (1995) і Kanegae et al. (1995). ДНК-конструкції, описані вище, можуть бути використані для введення потрібної нуклеотидної послідовності даного винаходу, переважно, геномної послідовності РАРАР або кДНК-послідовності РАРАР, а найбільш переважно модифікованої копії геномної або кДНК-послідовності РАРАР в заздалегідь визначене положення в цільовому геномі, що приводить до генерування модифікованої копії цільового гена ("відключення" гомологічної рекомбінації) або до заміни копії потрібного гена іншою копією достатньою мірою гомологічною для того, щоб відбувалася подія гомологічної рекомбінації ("включення" гомологічної рекомбінації). У конкретному варіанті здійснення винаходу ДНКконструкції, описані вище, можуть бути використані для введення геномної послідовності РАРАР або кДНК-послідовності РАРАР, що включає, принаймні, один біалельний маркер. Ядерні антисмислові ДНК-конструкції Інші композиції, що містять вектор даного винаходу, що включає олігонуклеотидний фрагмент нуклеотидної послідовності кДНК SEQ ID NO, переважно, фрагмент, що включає старт-кодон гена РАРАР, можуть бути використані як антисмислова послідовність, яка інгібує експресію відповідного гена РАРАР. Переважними методами з використанням антисмислового полінуклеотиду даного винаходу є процедури, описані Sczakiel et al (1995), або процедури, описані в заявці РСТ № WO 95/24223, опис яких у всій своїй повноті вводиться в дану заявку за допомогою посилання. Антисмислові послідовності переважно вибирають з полінуклеотидів (довжиною 15-200 п.н.), комплементарних 5'-кінцю мРНК РАРАР. В одному з варіантів здійснення винаходу використовується комбінація різних антисмислових полінуклеотидів, комплементарних різним частинам потрібного гена. Переважні антисмислові полінуклеотиди даного винаходу комплементарні послідовності мРНК РАРАР, яка містить або кодон ініціації трансляції ATG, або сайт сплайсингу. Інші переважні антисмислові полінуклеотиди даного винаходу комплементарні сайту сплайсингу мРНК РАРАР. Антисмислові полінуклеотиди даного винаходу, переважно, мають сигнал 3' -поліаденілування, 31 79582 який був замінений послідовністю рибозиму, яка сама розщеплюється, так, щоб транскрипти РНКполімерази II продукувались без poly(A) на своїх 3'-кінцях, причому ці антисмислові полінуклеотиди нездатні транспортуватись з ядра, як описано Liu et al. (1994). У переважному варіанті здійснення винаходу ці антисмислові полінуклеотиди РАРАР також включають, в кластері рибозиму, гістонну структур у "стебло-петля" для стабілізації розщеплених транскриптів з метою їх захисту від 3'-5'екзонуклеолітичного розщеплення, наприклад, структур у, описану Eckner et al. (1991). Олігонуклеотидні зонди і праймери Полінуклеотиди, що походять від гена РАРАР, можуть бути використані для детекції присутності, принаймні, копії нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:1 або 3, або її фрагмента, комплементу або варіанту в зразку, що тестується. Особливо переважними зондами і праймерами даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів послідовності SEQ ID NO:3 або комплементарні послідовності. Зондами і праймерами також є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів SEQ ID NO:3 або його комплементарні послідовності, де вказана безперервна ділянка включає нуклеотид, принаймні, один з нижченаведених нуклеотидів в положеннях SEQ ІD NO:3: 13038, 1-421, 422-557, 2158-2218 і 2620-3039. Іншими переважними зондами і праймерами даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів SEQ ID NO:1 або її комплементарної послідовності. Іншими переважними зондами і праймерами даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів SEQ ID NO:1 або її комплементарної послідовності, де вказана безперервна ділянка містить нуклеотид, принаймні, в одному з нижченаведених положень послідовності SEQ ID NO:1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 і 691-1104. Таким чином, даний винахід також відноситься до нуклеїново кислотних зондів, які відрізняються тим, що вони специфічно гібридизуються в описаних вище жорстких умовах гібридизації з нуклеїновою кислотою, вибраною з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO:1 і 3 або їх варіантів або їх комплементарних послідовностей. В одному з варіантів свого здійснення даний винахід охоплює виділені, очищені і рекомбінантні полінуклеотиди, що складаються, або, в основному, складаються з безперервної ділянки, що охоплює 8-50 суміжних нуклеотидів будь-які з послідовностей SEQ ID NO:1, 3 і їх комплементів, де 32 вказана безперервна ділянка включає РАРАРасоційований біалельний маркер у вказаній послідовності, або біалельний маркер нерівноважності із зчеплення з РАРАР, і де вказана безперервна ділянка має, але необов'язково, довжину в 18-35 суміжних нуклеотидів, а вказаний біалельний маркер знаходиться на відстані 4 нуклеотидів від центра вказаного полінуклеотиду, де вказаний полінуклеотид необов'язково складається з вказаної безперервної ділянки, і вказана безперервна ділянка має довжину в 25 суміжних нуклеотидів, а вказаний біалельний маркер знаходиться в центрі вказаного полінуклеотиду; при цьому, необов'язково, 3'-кінець вказаної безперервної ділянки розташований у 3'-кінця вказаного полінуклеотиду, і, необов'язково, 3'-кінець вказаної безперервної ділянки локалізований у 3'-кінця вказаного полінуклеотиду, а вказаний біалельний маркер розташований у 3'-кінця вказаного полінуклеотиду. В іншому варіанті свого здійснення даний винахід охоплює виділені, очищені і рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або складаються, або, в основному, складаються з вказаної безперервної ділянки, що охоплює 8-50 суміжних нуклеотидів будь-яких послідовності SEQ ID NO:1, 3 або їх комплементів, де 3'-кінець вказаної безперервної ділянки розташований у 3'-кінця вказаного полінуклеотиду і де 3'-кінець вказаного полінуклеотиду локалізований в області в 20 нуклеотидів, розташованих вище РАРАРасоційованого біалельного маркера у вказаній послідовності, або біалельного маркера нерівноважності із зчеплення з РАРАР. В іншому варіанті свого здійснення даний винахід охоплює полінуклеотиди, що використовуються в гібридизаційних аналізах, секвенуючих аналізах і у ферментативних аналізах, що проводяться для детекції невідповідності основ з метою визначення ідентичності нуклеотидів в РАРАРасоційованому біалельном маркері в SEQ ID NO:1, 3 або в комплементарних послідовностях; а також полінуклеотиди, що використовуються для ампліфікації сегментів нуклеотидів, що містять РАРАРасоційований біалельний маркер в SEQ ID NO:1, 3 або в комплементарних послідовностях. Даний винахід відноситься до використання полінуклеотидів даного винаходу для визначення ідентичності нуклеотидів в РАРАР-асоційованому біалельному маркері, переважно, в гібридизаційних аналізах, секвенуючих аналізах, мікросеквенуючи х аналізах або у ферментативних аналізах, що проводяться для детекції невідповідності основ і для ампліфікації сегментів нуклеотидів, що містять РАРАР-асоційований біалельний маркер. Зонд або праймер даного винаходу має довжину від 8 до 1000 нуклеотидів, або, зокрема, довжину, принаймні, в 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 нуклеотидів. Більш конкретно, довжина цих зондів і праймерів може складати в межах від 8, 10, 15, 20 або 30 до 100 нуклеотидів, а переважно, від 10 до 50, а більш переважно, від 15 до 30 нуклеотидів. Більш короткі зонди і праймери мають тенденцію до втрати специфічності по відношенню до послідовності-мішені нуклеїнової кислоти і звичайно 33 79582 вимагають більш низьких температур для утворення досить стабільних гібридних комплексів з матрицею. Більш довгі зонди і праймери є такими, що дорого коштують, і іноді вони можуть зазнавати самогібридизації з утворенням "шпилькових" структур. Відповідна довжина праймерів і зондів в конкретній сукупності аналітичних умов може бути визначена емпірично самим фахівцем. Утворення стабільних гібридів залежить від температури плавлення (Тm) ДНК. Тm залежить від довжини праймера або зонда, іонної сили розчину і вмісту G+C. Чим вище вміст G+C в праймері або зонді, тим вище температура плавлення, оскільки пари G:C мають три водневих зв'язки, а пари А:Т мають тільки два зв'язки. Вміст GC в зондах даного винаходу звичайно складає в межах від 10 до 75%, переважно, від 35 до 60%, а більш переважно, від 40 до 55%. Вказані праймери і зонди можуть бути одержані будь-яким відповідним методом, включаючи, наприклад, клонування і рестрикцію відповідних послідовностей і прямий хімічний синтез наприклад, фосфодіефірним методом Narang et al. (1979), фосфодіефірним методом Brown et al. (1979), діетилфосфорамідитним методом Beaucage et al. (1981) і методом з використанням твердого носія, описаним в ЕР 0707592. Детектуючими зондами звичайно є послідовності нуклеїнової кислоти або незаряджені аналоги нуклеїнової кислоти, такі як, наприклад, пептидвмісні нуклеїнові кислоти, [описані в Міжнародній патентній заявці WO 92/20702, і морфолінові аналоги, описані в патентах США №№ 5185444, 5034506 і 5142047]. Цей зонд можна зробити "неподовжуваним", так, щоб до цього зонда не могли додаватися інші dNTP. Самі аналоги, як всередині, так і зовні, звичайно не подовжуються, а нуклеїновокислотні зонди можуть бути зроблені неподовжуваними шляхом модифікації 3'-кінця зонда, так, щоб гідроксильна група не могла більше брати участь в подовженні. Наприклад, 3'-кінець зонда може бути функціоналізований захоплюючою або детектуючою міткою, так, щоб, він міг захоплювати або як-небудь інакше блокувати гідроксильну групу. Альтернативно, 3'-гідроксильна група може бути просто відщеплена, замінена або модифікована, причому, в [заявці на патент США, реєстр. № 07/049061, поданої 19 квітня 1993 року], описані модифікації, які можуть бути використані для створення "неподовжуваного" зонда. Будь-який з полінуклеотидів даного винаходу може бути позначений, якщо це необхідно, шляхом включення будь-якої мітки, відомої фахівцям, і яка визначається спектроскопічними, фотохімічними, біохімічними, імунохімічними або хімічними методами. Так, наприклад, відповідними мітками є радіоактивні речовини (включаючи 32Р, 35S, 3H, 125 І), флуоресцентні барвники (включаючи 5бромдезоксиуридин, флуоресцеїн, ацетиламінофлуорен, дигоксигенін) або біотин. Полінуклеотиди переважно мітять у 3'- і 5'-кінців. Прикладами методів нерадіоактивного мічення фрагментів нуклеїнової кислоти є методи, описані в патенті Франції № FR-7810975 або Urdea et al (1988) або SanchezPescador et al (1988). Крім того, зонди даного ви 34 находу можуть мати структурні властивості, які дозволяють здійснювати ампліфікацію сигналу, причому такими структурними властивостями володіють, наприклад, розгалужені ДНК-зонди, описані Urdea et al., 1991 або в Європейському патенті № ЕР 0225807 (Chiron). Мітка може бути також використана для захоплення праймера з метою полегшення іммобілізації або праймера, або продукту подовження праймера, такого як ампліфікована ДНК, на твердому носії. Мітка-пастка приєднується до праймерів або зондів і може специфічно зв'язуватися з членом, який утворює пару скріплення з членом, що специфічно зв'язується з твердофазним реагентом (наприклад, з біотином і стрептавідином). Тому, в залежності від типу мітки, яку несе полінуклеотид або зонд, вона може бути використана для захоплення або для детекції ДНК-мішені. Крім того, потрібно зазначити, що описані тут полінуклеотиди, праймери або зонди самі можуть служити міткоюпасткою. Так, наприклад, у випадку, коли членом, що зв'язується з твердофазним реагентом, є послідовність нуклеїнової кислоти, то вона може бути вибрана так, щоб вона зв'язувалася з комплементарною частиною праймера або зонда, і, тим самим, і мобілізувала праймер або зонд на твердій фазі. У випадках, коли сам полінуклеотидний зонд служить зв'язувальним членом, для кожного фахівця очевидно, що цей зонд буде містити послідовність або "хвіст", які не є комплементарними даної мішені. У випадку, коли сам полінуклеотидний праймер служить міткою-пасткою, то, принаймні, частина цього праймера буде вільно гібридизуватись з нуклеїновою кислотою на твердій фазі. Техніка мічення ДНК добре відома фахівцям. Зонди даного винаходу можуть бути використані в різних цілях. А саме, вони можуть бути використані в Саузерн-гібридизації з геномною ДНК. Ці зонди можуть бути також використані для детекції продуктів ПЛР-ампліфікації. Вони можуть бути також використані для детекції невідповідностей в гені РАРАР або мРНК з використанням іншої техніки. Будь-який з полінуклеотидів, праймерів і зондів даного винаходу може бути відповідним чином іммобілізований на твердому носії. Тверді носії відомі фахівцям, і ними є стінки ямок реакційного планшета, тест-пробірки, полістиролові сфери, магнітні сфери, нітроцелюлозні смужки, мембрани, мікрочастинки, такі як латексні частинки, баранячі еритроцити (або еритроцити інших тварин), дурацити і т.п.Вибір твердого носія не грає вирішальної ролі і може бути здійснений на розсуд фа хівця. Таким чином, найбільш відповідними прикладами є латексні частинки, мікрочастинки, магнітні або немагнітні сфери, мембрани, пластикові пробірки, стінки ямок для мікротування, скло або кремнієві чипи, баранячі еритроцити (або еритроцити інших тварин) і дурацити. Відповідними методами іммобілізації нуклеїнових кислот на твердих фазах є іонні, гідрофобні, ковалентні взаємодії і т.п.Термін "твердий носій", що використовується тут, означає будь-який матеріал, який є нерозчинним, або який може бути зроблений нерозчинним внаслідок подальшої реакції. Цей твердий носій може бути ви 35 79582 браний так, щоб він володів властивою йому здатністю захоплювати та іммобілізувати захоплений реагент. Альтернативно, тверда фаза може містити додатковий рецептор, який здатний захоплювати та іммобілізувати захоплений реагент. Таким додатковим рецептором може бути заряджена речовина, яка має заряд, протилежний заряду самого реагенту, що захоплюється, або заряджена речовина, кон'югована з реагентом, що захоплюється. У ще одному альтернативному способі молекулою рецептора може бути будь-який член, що специфічно зв'язується, який іммобілізований на твердому носії (приєднаний до твердого носія), і який здатний іммобілізувати захоплений реагент за допомогою реакції специфічного скріплення. Молекула рецептора здатна опосередковано зв'язувати захоплений реагент з твердим носієм перед проведенням аналізу або в процесі проведення аналізу. Так, наприклад, твердою фазою може бути пластик, дериватизований пластик, магнітний або немагнітний метал, скляна або кремнієва поверхня тест-пробірки, мікротитраційні ямки, листи, сфери, мікрочастинки, чипи, баранячі еритроцити (або еритроцити інших тварин), дурацити® та інші конфігурації, відомі фахівцям. Полінуклеотиди даного винаходу можуть бути приєднані до твердого носія або іммобілізовані на твердому носії окремо або групами, що складаються, принаймні, з 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 або 25 різних полінуклеотидів даного винаходу на одному твердому носії. Крім того, полінуклеотиди, що не є полінуклеотидами даного винаходу, можуть бути приєднані до того ж самого твердого носія таким же чином, як один або декілька полінуклеотидів даного винаходу. Отже, даний винахід також відноситься до способу детекції присутності нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид SEQ ID NO:1 або 3, його фрагмент або варіант і комплементарну послідовність, в зразку, де вказаний спосіб включає наступні стадії: а) контактування нуклеїновокислотного зонда або множини нуклеїновокислотних зондів, які можуть гібридизуватись з нуклеотидною послідовністю, включеною в нуклеїнову кислоту SEQ ID NO:1 або 3, або її фрагментом або варіантом і комплементарною послідовністю, із зразком, що аналізується; і b) детекції гібридного комплексу, що утворився між зондом і нуклеїновою кислотою в даному зразку. Крім того, даний винахід відноситься до набору для детекції присутності нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 або 3, її фрагмент або варіант, і комплементарну послідовність, в зразку, де вказаний набір включає: a) нуклеїновокислотний зонд або множину нуклеїновокислотних зондів, які можуть гібридизуватись з нуклеотидною послідовністю, включеною в нуклеїнову кислоту SEQ ID NO:1 або 3, або з її фрагментом або варіантом і комплементарною послідовністю, і b) необов'язково, реагенти, необхідні для здійснення реакції гібридизації. 36 У першому переважному варіанті винаходу, що відноситься до способу детекції і до набору, вказаний нуклеїновокислотний зонд або множину нуклеїновокислотних зондів мітять детектованою молекулою. У другому переважному варіанті винаходу, що відноситься до способу детекції і до набору, вказаний нуклеїновокислотний зонд або множину нуклеїновокислотних зондів іммобілізують на субстрат. Олігонуклеотидні масиви Субстрат, що містить множину олігонуклеотидних праймерів або зондів даного винаходу, може бути використаний для детекції або ампліфікації потрібних послідовностей в гені РАРАР, і він може бути також використаний для детекції мутацій в кодуючих або в некодуючих послідовностях гена РАРАР. Будь-який описаний тут полінуклеотид може бути приєднаний в областях, що перекриваються, або в довільних ділянках до твердого носія. Альтернативно, полінуклеотиди даного винаходу можуть бути приєднані у впорядкованих масивах, де кожний полінуклеотид приєднаний в тому місці твердого носія, яке не перекривається з місцем приєднання будь-якого іншого полінуклеотиду. Переважно, такий впорядкований масив полінуклеотидів називають "адресованим", де різні місцеположення реєструються і можуть бути використані як частина аналітичної процедури. Масиви адресованих полінуклеотидів звичайно містять множину різних олігонуклеотидних зондів, які зв'язуються з поверхнею субстрату в різних відомих положеннях. Знання точного положення кожного полінуклеотиду дає можливість використати ці "адресовані" масиви в гібридизаційних аналізах. Для полінуклеотидів даного винаходу може бути застосований будь-який відомий метод з використанням адресованих масивів. Одним з конкретних варіантів таких полінуклеотидих масивів є масив, відомий як Genechips™, який, в основному, [описаний в патенті США №5143854; в публікаціях РСТ WO 90/15070 і 92/10092]. В основному, ці масиви можуть бути продуковані методами механічного синтезу або прямого світлонапрямленого синтезу, які являють собою комбінацію фотолітографічних методів і твердофазного синтезу олігонуклеотидів (Fodor et al., 1991). Іммобілізація масивів олігонуклеотидів на твердих носіях стала можливою завдяки розробці технології, що звичайно ідентифікується як "Крупномасштабний синтез іммобілізованих полімерів" ("Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis") (VLSIPS™), в якому зонди звичайно іммобілізовані в масиві високої щільності на твердій поверхні чипу. Приклади VLSIPS™ представлені [в патентах США №№5143854 і 5412087 і в нублікаціях РСТ WO 90/15070, WO 92/10092 і WO 95/11995], де описані методи формування олігонуклеотидних масивів з використанням такої техніки як світлонапрямлений синтез. При розробці стратегій для одержання масивів олігонуклеотидів, іммобілізованих на твердих носіях, в спробі максимізувати рівні гібридизації і інформації про послідовності були розроблені додаткові стратегії представлення для упорядкування і відображення масивів на чипах. 37 79582 Приклади таких стратегій представлення [описані в публікаціях РСТ WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 і WO 97/31256], описи яких у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання. В іншому варіанті олігонуклеотидних масивів даного винаходу, матриця олігонуклеотидних зондів може бути переважно використана для детекції мутацій, присутніх в гені РАРАР, а переважно в його регуляторної області. Для цих конкретних цілей спеціально конструювали зонди, що мають послідовність, що дозволяє їм гібридизуватись з генами, які несуть відомі мутації (делецію, інерцію або заміну одного або декількох нуклеотидів). Термін "відомі мутації" означає мутації в гені РАРАР, який був ідентифікований, наприклад, методом, використаним Huang et al. (1996) або Samson et al. (1996). Іншим методом, який застосовується для детекції мутацій в гені РАРАР, є використання ДНКмасивів високої щільності. Кожний олігонуклеотидний зонд, що складає одиничний елемент ДНКмасиву високої щільності, був сконструйований так, щоб він відповідав специфічній послідовності геномної ДНК або кДНК РАРАР. Таким чином, масив, що складається з олігонуклеотидів, комплементарних підпослідовностей послідовності генамішені, використовується для визначення ідентичності послідовності-мішені з послідовністю гена дикого тину з метою вимірювання його кількості і детекції відмінностей між послідовністю-мішенню і послідовністю гена РАРАР дикого тину, що порівнюється. В одну таку конструкцію, позначену 4Lмасивом "черепичного" типу, введена серія з чотирьох зондів (А, С, G, Т), а переважно, 15нуклеотидні олігонуклеотиди. У кожній серії з чотирьох зондів абсолютний комплемент буде гібридизуватись більш сильно, ніж зонди з невідповідностями. Потім нуклеїновокислотну мішень довжиною L сканують на мутації з використанням масиву "черепичного" типу, що містить 4L,-зонди, де весь набір зондів має всі можливі мутації у відомій еталонній послідовності. Гібридизаційні сигнали від серії 15-мірного зонда "черепичного" масиву спотворюються зміною лише однієї основи в послідовності-мішені. Внаслідок цього відбувається характерна втрата сигналу або "футпринт" для зондів, що фланкують положення мутації. Ця техніка описана Chee et al., 1996. Таким чином, даний винахід відноситься до масиву молекул нуклеїнової кислоти, що містить, принаймні, один полінуклеотид, описаний вище і використовується як зонд або праймер. У переважному варіанті даний винахід відноситься до масиву молекул нуклеїнової кислоти, що містить, принаймні, два полінуклеотиди, описані вище і що використовуються як зонди або праймери. Білки і поліпептидні фрагменти РАРАР Термін "поліпептиди РАРАР", що використовується тут, о хоплює всі білки і поліпептиди даного винаходу. Частиною даного винаходу також є поліпептиди, що кодуються полінуклеотидами даного винаходу, а також гібридні поліпептиди, що містять вказані поліпептиди. Даний винахід відноситься до людських білків РАРАР, включаючи виділені або 38 очищені білки РАРАР, що складаються з, або, в основному, складаються з послідовності SEQ ID NO:2, або містять цю послідовність. Як описано в даній заявці, авторами даного винаходу було продемонстровано, що білок РАРАР асоційований з білком або пептидом g34872, який розглядається як фактор генетичної схильності до шизофренії і біполярних порушень, а також до споріднених порушень ЦНС. Даний винахід відноситься до поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NО:1 або 3 або комплементарною послідовністю або її фрагментом. Даний винахід відноситься до виділених, очищених рекомбінантних поліпептидів, що містить безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 суміжних амінокислот SEQ ID NO:2. В інши х переважних варіантах здійснення винаходу вказана безперервна ділянка з суміжних амінокислот містить сайт мутації або функціональної мутації, включаючи делецію, додавання, заміну або усікання амінокислот в послідовності білка РАРАР. Даний винахід також охоплює очищений, виділений або рекомбінантний полінуклеотид, що містить амінокислотну послідовність, що має, принаймні, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 або 99%-ну ідентичність амінокислот з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:2 або її фрагментом. Такі варіанти поліпептидів входять в даний винахід незалежно від того, чи мають вони нормальну біологічну активність чи ні. Навіть в тому випадку, якщо конкретна поліпептидна молекула не володіє біологічною активністю, для кожного фахівця очевидно, яким чином може бути використаний даний поліпептид, наприклад, як вакцина або для продукування антитіл. Іншими застосуваннями поліпептидів даного винаходу, які не володіють РАРАРактивністю, є, inter alia, їх використання як епітопних міток для епітопного картування, і як маркерів молекулярної маси на ДСН-ПААГ-гелях або на колонках для гель-фільтрації з молекулярним ситом, здійснюваної методами, відомими фахівцям. Як описано нижче, поліпептиди даного винаходу можуть бути також використані для продукування поліклональних і моноклональних антитіл, які можуть бути використані в аналізах на детекцію експресії білків РАРАР або як агоністи і антагоністи, здатні посилювати або інгібувати функції білка РАРАР. Крім того, такі поліпептиди можуть бути використані в дріжджовій двогібридній системі для "захоплення" білків, що зв'язуються з білком РАРАР, які також є агоністами і антагоністамикандидатами даного винаходу. В інших варіантах свого здійснення даний винахід також відноситься до комплексів, утворених поліпептидами РАРАР і g34872. Таким чином, даний винахід відноситься до очищених, виділених або рекомбінантно продукованих комплексів, що складаються, принаймні, з одного поліпептиду РАРАР, і принаймні, з одного поліпептиду g34872, де вказаний поліпептид РАРАР містить, принаймні, 6 амінокислот, переважно, принаймні, 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, 39 79582 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот SEQ ID NO:2. У переважному варіанті здійснення винаходу вказаний поліпептид g34872 містить, принаймні, 6, переважно, принаймні, 8-10 амінокислот SEQ ID NO:5. Крім того, як було передбачено, виходячи з додаткового аналізу структури поліпептиду РАРАР, поліпептид РАРАР даного винаходу може містити сайт N-глікозилювання (ASP) в положеннях амінокислот 69-72 (амінокислоти NNTD). Крім того, поліпептид РАРАР даного винаходу може містити сайт фосфорилювання протеїнкінази С в положеннях амінокислот 26-28 (SCR), 53-55 (SKR), 71-73 (TDK) і 80-82 (SPK). Крім того, поліпептид РАРАР може містити сайт N-міристоїлювання в положеннях амінокислот 18-23 (GGDZGQ), 22-27 (GQIFSC) і 37-42 (GAGQNK). Іншими структурними аспектами є мотиви рацемази ASP & GLU в положеннях амінокислот 8-16 і 9-16 (амінокислоти DPYG). Крім своєї асоціації з шизофренією і біполярним порушенням за допомогою взаємодії з g34872, поліпептид РАРАР також має послідовність, гомологічну кальцій/кальмодулінзалежного білка протеїнкінази II (САМКИ) (реєстр. № AS2711561), участь якого в нейротрансмісії була продемонстрована раніше. В одному з аспектів даного винаходу РАРАР може діяти як молекулярний шаперон; так, наприклад, РАРАР може посилювати або запобігати взаємодії або скріпленню g34872 з рецептором g34872. В іншому аспекті винаходу РАРАР може функціонально взаємодіяти з білками g34872 на шляху передачі сигналу. Білки РАРАР, переважно, виділяють із зразків тканини людини або ссавця або експресують з генів людини або ссавця. Поліпептиди РАРАР даного винаходу можуть бути одержані рутинними методами експресії, відомими фахівцям. Полінуклеотид, що кодує потрібний поліпептид, лігують в експресуючий вектор, придатний для будь-якого стандартного хазяїна. Для одержання рекомбінантних поліпептидів можуть бути використані як еукаріотичні, так і прокаріотичні системи хазяїв, і сукупність деяких найбільш поширених систем. Потім поліпептид виділяють з лізованих клітин або з культурального середовища і очищають до певної міри, необхідної для використання. Очищення проводять будь-яким відомим методом, таким як, наприклад, диференціальна екстракція, фракціонування солями, хроматографія, центрифугування і т.п.Різні методи очищення білків можна знайти, наприклад, в "Методах ензимології" (Methods in Enzymology). Крім того, більш короткі фрагменти білка продукують методами хімічного синтезу. Альтернативно, білки даного винаходу екстрагують з клітин або тканин людини або інших тварин. Методи очищення білків відомі фахівцям, і такими методами є використання детергентів або хаотропних агентів для дизрупції частинок з подальшою диференціальною екстракцією і розділенням поліпептидів за допомогою іонообмінної хроматографії, афінної хроматографії, седиментації в градієнті щільності і гель-електрофорезу. 40 Для експресії білків і поліпептидів РАРАР може бути використана будь-яка кДНК РАРАР , включаючи SEQ ID NO:1. Нуклеїнову кислоту, що кодує експресований білок або поліпептид РАРАР, функціонально приєднують до промотору в експресуючому векторі з використанням стандартної техніки клонування. Вставка РАРАР в експресуючому векторі може включати повну кодуючу послідовність для білка РАРАР або його частини. Так, наприклад, РАРАР-вставка може кодувати поліпептид, що містить, принаймні, 10 суміжних амінокислот білка РАРАР SEQ ID NO:2. Експресуючим вектором є будь-які експресійні системи ссавця, дріжджів, комах або бактерій, відомі фахівцям. Комерційно доступні вектори і експресійні системи постачаються рядом фірмпостачальників, включаючи Genetic Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin) і Invitrogen (San Diego, California). Якщо це необхідно, то для посилення експресії і полегшення правильного укладання білка, оточення кодона і спаровування послідовностей кодонів оптимізують для конкретного експресуючого організму, в який вводять експресуючий вектор, як описано, в патенті США, Hatfield et al., №5082767, опис якого у всій своїй повноті вводиться в дану заявку за допомогою посилання. В одному з варіантів здійснення винаходу повну кодуючу послідовність кДНК РАРАР функціонально приєднують до промотору в експресуючому векторі за допомогою роlу(А)-сигналу кДНК. Альтернативно, якщо нуклеїнова кислота, що кодує частин у білка РАРАР, у якого відсутній метіонін, служить як сайт ініціації, то ініціюючий метіонін може бути введений після першого кодона нуклеїнової кислоти з використанням стандартної техніки. Аналогічним чином, якщо у вставці з кДНК РАРАР відсутній роlу(А)-сигнал, то ця послідовність може бути введена в конструкцію, наприклад, за допомогою сплайсингу з роlу(А)-сигналу від pSG5 (Stratagene) з використанням рестриктуючих ендонуклеаз Bg1l і Sa11, і вбудована в експресуючий вектор ссавця pXTl (Stratagene). pXT1 містить LTR і частину гена gag мишачого вірусу лейкозу Молоні. Положення LTR в даній конструкції дозволяє здійснювати стабільну трансфекцію. Вказаний вектор включає промотор тимідинкінази вірусу простого герпеса і селективний ген неоміцину. Нуклеїнову кислоту, що кодує білок РАРАР або його частину, одержують з бактеріального вектора, що містить кДНК РАРАР SEQ ID NO:2, за допомогою ПЛР з використанням олігонуклеотидних праймерів, комплементарних кДНК РАРАР або його частини, де вказаний вектор містить послідовності рестриктуючої ендонуклеази PstI, вбудованої в 5'праймер, і рестриктуючої ендонуклеази Bg1ll у 5'кінця відповідного кДНК-3'-праймера, для гарантії того, що послідовність, що кодує білок РАРАР або його частину, буде правильно розташована по відношенню до poly Α-сигналу. Очищений фрагмент, одержаний внаслідок ПЛР-реакції, гідролізують PstI, затупляють по кінцях екзонуклеазою, гідролізують Bglll, очищають і лігують з вектором pXT1, що вже містить poly Α-сигнал і гідролізований Bg1ll. 41 79582 Лігований продукт трансфікують в мишачі клітини NIH3T3 з використанням ліпофектину (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) в умовах, вказаних в описі продукту. Позитивні трансфектанти відбирають після культивування трансфікованих клітин в 600мкг/мл G418 (Sigma, St.Louis, Missouri). Вищеописані процедури можуть бути також використані для експресії мутантного білка РАРАР, відповідального за детектований фенотип, або його частини. Експресований білок очищають стандартними методами очищення, такими як осадження сульфатом амонію або хроматографічне розділення за розміром або зарядом. Білок, що кодується нуклеїновокислотною вставкою, може бути також очищений стандартними імунохроматографічними методами. У таких процедурах розчин, що містить експресований білок РАРАР або його частину, такий як клітинний екстракт, наносять на колонку, що містить антитіла проти білка РАРАР або його частини, нанесені на хроматографічну матрицю. Експресований білок зв'язується з імунохроматографічною колонкою. Потім колонку промивають для видалення неспецифічно пов'язаних білків. Цей специфічно пов'язаний експресований білок видаляють з колонки і виділяють стандартними методами. Для підтвердження експресії білка РАРАР або його частини білки, експресовані з клітин-хазяїв і які містять експресуючий вектор, що включає вставку, яка кодує білок РАРАР або його частину, можуть бути піддані порівнянню з білками, експресованими в клітинах-хазяях, що містять експресуючий вектор без вставки. Присутність смуги в зразках клітин, що містять експресуючий вектор з вставкою, яка відсутня в зразках клітин, що містять експресуючий вектор без вставки, вказує на те, що був експресований білок РАРАР або його частина. В основному, ця смуга буде мати рухливість, очікувану для білка РАРАР або його частини. Однак, ця смуга може також мати рухливість, відмінну від очікуваної рухливості, у разі модифікацій, таких як глікозилювання, убіхітинізація або ферментативний гідроліз. Антитіла, здатні специфічно розпізнавати експресований білок РАРАР або його частину, описані нижче. Якщо продукування антитіла неможливе, то нуклеїнові кислоти, що кодують білок РАРАР або його частину, вбудовують в експресуючі вектори, сконструйовані для одержання схем очищення із застосуванням химерних поліпептидів. У таких стратегіях нуклеїнову кислоту, що кодує білок РАРАР або його частину, вбудовують в тій же самій рамці зчитування, яку має ген, що кодує іншу половину химери. Іншою половиною цієї химери є послідовність, що кодує β-глобін або нікелезв'язувальний поліпептид. Потім для очищення химерного білка використовують хроматографічну матрицю, що має антитіло проти β-глобіну або антитіло, що зв'язується з нікелем. Між геном βглобіну або нікелезв'язувальним поліпептидом і геном білка РАРАР або його частини конструюють сайти розщеплення протеазою. Таким чином, дві 42 поліпептиди химери можуть бути відділені один від одного за допомогою розщеплення протеазою. Одним з експресуючих векторів, що використовуються для генерування β-глобінових химерних білків, є pSG5 (Stratagene), який кодує кролячий βглобін. Інтрон II гена кролячого β-глобіну полегшує сплайсинг експресованого транскрипту, а сигнал поліаденілювання, введений в дану конструкцію, підвищує рівень експресії. Ці способи добре відомі фа хівцям з молекулярної біології. Стандартні методи опубліковані в методичному керівництві, такому як David et ah, (1086), і багато які з них розроблені Stratagene, Life Technologies, Inc., або Promega. Крім того, поліпептид може бути продукований з даної конструкції з використанням систем трансляції in vitro, таких як набір для експрестрансляції™ in vitro (Stratagene). Антитіла, які зв'язуються з поліпептидами РАРАР даного винаходу Для генерування антитіл, здатних зв'язуватися з експресованим білком РАРАР або його фрагментами, може бути використаний будь-який описаний поліпептид або цілий білок РАРАР. Одна з композицій антитіла даного винаходу здатна до специфічного скріплення або специфічно зв'язується з білком РАРАР SEQ ID NO:2. Композиція антитіла, що специфічно зв'язується з білком РАРАР, повинна мати афінність скріплення для першого повнорозмірного варіанту білка РАРАР, яка, принаймні, на 5%, 10%, 15%, 20%, 50% або 100% перевищує а фінність скріплення для другого повнорозмірного варіанту білка РАРАР в ELISA або іншому аналізі, основаному на скріпленні з антитілом. У переважному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до композицій антитіла, поліклонального або моноклонального, яке здатне до селективного скріплення або селективно зв'язується з епітопвмісним поліпептидом, що включає безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-Ю амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 суміжних амінокислот SEQ ID NO:2. У переважному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до композицій антитіла, поліклонального або моноклонального, яке здатне до селективного скріплення або селективно зв'язуватися з комплексом поліпептидів РАРАР і g34872, де вказаний поліпептид РАРАР містить, принаймні, 6 амінокислот, переважно, принаймні, 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот SEQ ID NO:2. У переважному варіанті здійснення винаходу, вказаний поліпептид g34872 містить, принаймні, 6 амінокислот, а переважно, принаймні, 810 амінокислот SEQ ID NO:5. Епітоп може містити, щонайменше, 3 амінокислоти в просторовій конформації, яка є унікальною для даного епітопу. Звичайно, епітоп складається, принаймні, з 6 таких амінокислот, а частіше, принаймні, з 8-10 таких амінокислот. У переважному варіанті здійснення винаходу антигенні епітопи містять декілька амінокислот, число яких складає від 3 до 50. Фрагменти, які діють як епітопи, можуть бути одержані стандартними методами. Епі 43 79582 топи можуть бути визначені за допомогою аналізу Джеймсона-Вольфа, який здійснюють, наприклад, за допомогою комп'ютерної програми PROTEAN з використанням параметрів за умовчанням (Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI). Передбачені антигенні епітопи представлені нижче. Потрібно зазначити, що в списку імуногенних епітопів представлені тільки амінокислотні залишки, що містяться в епітопах, які, як було передбачено відповідно до конкретного алгоритму, мають найвищу міру імуногенності. Поліпептиди даного винаходу, які конкретно не описані як імуногенні, вважаються неантигенними. При цьому, вони все ж можуть бути антигенними in vivo, але вони просто не розпізнаються алгоритмом, що конкретно використовується. Альтернативно, ці поліпептиди, можливо, є антигенними in vitro, як було визначено методами фагового представлення. Таким чином, перераховані нижче амінокислотні залишки являють собою амінокислотні залишки, що містять лише переважні епітопи, але цей список є неповним. Дійсно, всі фрагменти поліпептидів даного винаходу, що мають, принаймні, 6 амінокислот, входять в об'єм даного винаходу, і використовуються як антигенний епітоп.Крім того, перераховані нижче амінокислотні залишки є лише критичними залишками епітопів, визначених за допомогою аналізу Джеймсона-Вольфа. Так, наприклад, в перераховані послідовності можуть бути додані додаткові фланкуючі залишки або на N-кінці, або на С-кінці, або на обох N- і С-кінцях для генерування епітопвмісної частини, що має довжину, принаймні, в 6 залишків. Амінокислотні залишки, що містять інші імуногенні епітопи, можуть бути визначені за допомогою алгоритмів, аналогічних аналізу Джеймсона-Вольфа, або за допомогою in vivo-тестування на антигенну відповідь описаними тут методами або методами, відомими фахівцям. Епітопвмісні фрагменти даного винаходу, переважно, включають 6-50 амінокислот (тобто, ціле число від 6 до 50, включно) поліпептиду даного винаходу. Крім того, даний винахід включає антигенні фрагменти, що мають довжину, починаючи від 6 амінокислот і закінчуючи повнорозмірною послідовністю РАРАР. Переважні імуногенні епітопи ΡАРАР: Gly-8 - L ys-11 Asp-31 - Asn-33 Gln-40 - Leu-47 Gly-51 - L ys-54 Glu-59 - Arg-62 і Ser-80 - Thr-83. Даний винахід також відноситься до виділеного або очищеного антитіла, здатного специфічно зв'язуватися з мутованим білком РАРАР або з його фрагментом або варіантом, що містить епітоп мутованого білка РАРАР. В іншому своєму переважному варіанті даний винахід відноситься до антитіла, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що містить, принаймні, 10 суміжних амінокислот білка РАРАР, і включає, принаймні, одну амінокислоту, яка може кодуватися мутаціями, що приводять до появи конкретної ознаки. 44 Для одержання антитіл бажано використати тварин або ссавців, дикого тину або трансгенних, що не відносяться до людини, які експресують тип РАРАР, відмінний від типу РАРАР, з яким зв'язується антитіло, а особливо переважними є тварини, які не експресують РАРАР (тобто описані тут тварини, у яких відсутній РАРАР). Тварини, у яких відсутній РАРАР, будуть розпізнавати всі області або більшість доступних областей білка РАРАР як чужорідних антигенів, а тому вони будуть продукувати антитіла для більш широкого спектра епітопів РАРАР. Крім того, більш короткі поліпептиди, що мають тільки 10-30 амінокислот, можуть бути використані для забезпечення специфічного скріплення з будь-яким білком РАРАР. Крім того, імунна система гуморальної відповіді тварин, які продукують молекули РАРАР, які є схожими з антигенною послідовністю, будуть переважно розпізнавати відмінності між нативними РАРАР-молекулами тварини і антигенною послідовністю і продукувати антитіла проти цих унікальних сайтів в послідовності антигену. Така техніка може бути, зокрема, використана для одержання антитіл, що специфічно зв'язуються з будь-яким одним з білків РАРАР . Препарати антитіл, одержані відповідно до будь-якого протоколу, можуть бути використані в кількісних імуноаналізах, в яких визначають концентрації ангигенвмісних речовин в біологічних зразках; і крім того, вони можуть бути використані в напівкількісному або якісному аналізі для ідентифікації присутності антигену в біологічному зразку. Ці антитіла можуть бути також використані в терапевтичних композиціях для цитолізу клітин, які експресують даний білок або для зниження рівня цього білка в організмі. Антитіла даного винаходу можуть бути помічені будь-якими радіоактивними, флуоресцентними або ферментними мітками, відомими фахівцям. Тому даний винахід також відноситься до способу специфічної детекції присутності поліпептиду РАРАР даного винаходу в біологічному зразку, де вказаний спосіб включає наступні стадії: a) контактування біологічного зразка з поліклональним або моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з поліпептидом РАРАР, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2, або з його пептидним фрагментом або варіантом, і b) детекції комплексу "антиген-антитіло", що утворився. Даний винахід також відноситься до діагностичного набору для детекції in vitro присутності поліпептиду РАРАР даного винаходу в біологічному зразку, де вказаний набір включає: a) поліклональне або моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з поліпептидом РАРАР, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:2, або з його пептидним фрагментом або варіантом, необов'язково мічені, і b) реагент, що забезпечує детекцію утворених комплексів антиген-антитіло, де вказаний реагент, необов'язково, несе мітку, або сам може розпізнаватися міченим реагентом, а більш конкретно, це відбувається у випадку, коли вищезазначене моноклональне або поліклональне антитіло саме не є міченим. 45 79582 Таким чином, даний винахід відноситься до антитіл і Т-клітинних антигенних рецепторів (TCR), які специфічно зв'язуються з поліпептидами, а більш конкретно, з епітопами вказаних поліпептидів даного винаходу, включаючи, але не обмежуючись ними, IgG (включаючи IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4), Ig A (включаючи Ig A1 і IgA2), IgD, IgE або IgM і Ig Y. У переважному варіанті антитілами даного винаходу є фрагменти антитіл, що зв'язуються з людським антигеном, включаючи, але не обмежуючись ними Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fd, одноланцюговий Fv (одFv), одноланцюгові антитіла, дисульфідпов'язаний Fv (oцFv) і фрагменти, що містять або домен VL, або домен VH. Вказані антитіла можуть бути одержані від будь-якої тварини, включаючи птахів і ссавців. Переважно, вказаними антитілами є антитіла людини, миші, кролика, кози, морської свинки, верблюда, коня або курок. Антигензв'язувальні фрагменти антитіл, включаючи одноланцюгові антитіла, можуть містити варіабельну область (області), окремо або в комбінації з наступними повними або неповними областями: шарнірною областю, доменами СН1, СН2 і СН3. В об'єм даного винаходу також входять будь-які комбінації з варіабельних областей і шарнірних областей і доменів СН1, СН2 і СН3. В об'єм даного винаходу також входять химерні, гуманізовані і людські моноклональні і поліклональні антитіла, що специфічно зв'язуються з поліпептидами даного винаходу. В об'єм даного винаходу також входять антитіла, які є антиідіотипічними по відношенню до антитіл даного винаходу. Антитіла даного винаходу можуть бути моноспецифічними, біспецифічними, триспецифічними, або вони можуть мати мультиспецифічність більш високого порядку. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними для інших епітопів поліпептиду даного винаходу, або вони можуть бути специфічними як для поліпептиду даного винаходу, так і для гетерологічних композицій, таких як гетерологічний поліпептид або матеріал твердого носія. [Див., наприклад, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt A. et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; патенти США №№5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; Kostelny S.A. et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553]. Антитіла даного винаходу можуть бути описані або охарактеризовані за їх взаємодією з епітопом(ами) або епітопнесучою частиною(ами) поліпептиду даного винаходу, які розпізнаються або специфічно зв'язуються цими антитілами. У разі білків даного винаходу і секретованих білків, вказані антитіла можуть специфічно зв'язуватися з повнорозмірним білком, що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, зі зрілим білком (тобто білком, що генерується шляхом розщеплення сигнального пептиду), що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, з сигнальним пептидом, що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, або з будь-яким іншим поліпептидом даного винаходу. Тому, епітоп(и) або епітопвмісна поліпептидна частина(и) можуть бути визначені як описано в даній заявці, наприклад, за N-кінцевими і С 46 кінцевими положеннями, за розміром в суміжних амінокислотних залишках або яким-небудь іншим описаним тут послідовностям (вхідних в список послідовностей). Антитіла, які специфічно зв'язуються з будь-яким епітопом або поліпептидом даного винаходу, можуть бути також виключені як окремий вид. Тому, даний винахід відноситься до антитіл, які специфічно зв'язуються з певними поліпептидами даного винаходу, що дозволяє виключити вищезазначені антитіла. Антитіла даного винаходу можуть бути також описані і охарактеризовані з точки зору їх перехресної реактивності. Антитіла, які специфічно не зв'язуються з будь-яким іншим аналогом, ортологом або гомологом поліпептидів даного винаходу, входять в об'єм даного винаходу. У об'єм даного винаходу також входять антитіла, які не зв'язуються з поліпептидами, що мають менше ніж 95%, менше ніж 90%, менше ніж 85%, менше ніж 80%, менше ніж 75%, менше ніж 70%, менше ніж 65%, менше ніж 60%, менше ніж 55% і менше ніж 50%ну ідентичність (обчислену відомими і описаними тут методами) з поліпептидом даного винаходу. Крім того, даний винахід відноситься до антитіл, що зв'язуються лише з поліпептидами, які кодуються полінуклеотидами, що гібридизуються з полінуклеотидом даного винаходу в жорстких умовах гібридизації (як описано в даній заявці). Антитіла даного винаходу можуть бути також описані або охарактеризовані з точки зору їх а фінності скріплення. Переважними афінностями скріплення є афінності скріплення з константою дисоціації або Kd, що складає менше 5×10-6М, 10-6 М, 5×10-7М, 10-7М, 5×10-8М, 10-8М, 5×10-9М, 10-9М, 5×10-10 М, 10-10М, 5×10-11М, 10-11 М, 5×10-12 М, 10-12 М, 5×10-13 М, 10-13М, 5×10-14М, 10-14 М, 5×10 х10-15 M і 10-15 M. Антитіла даного винаходу використовуються в методах, якими є, але не обмежуються ними, відомі методи очищення, детекції і націлювання на поліпептиди даного винаходу, включаючи діагностичні in vivo і in vitro методи і терапевтичні методи. Так, наприклад, ці антитіла використовуються в імуноаналізах для якісного і кількісного вимірювання рівнів поліпептидів даного винаходу в біологічних зразках. Див. наприклад, роботу Harlow et al., ANTIBODIES: A L ABOR ATOR Y MANU AL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) (яка у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання). Антитіла даного винаходу можуть бути використані окремо або в комбінації з іншими композиціями. Ці антитіла можуть бути потім рекомбінантно приєднані до гетерологічногоу поліпептиду у Nабо С-кінця, або вони можуть бути хімічно кон'юговані (включаючи ковалентне або нековалентне кон'югування) з поліпептидами або іншими композиціями. Так, наприклад, антитіла даного винаходу можуть бути рекомбінантно пов'язані або кон'юговані з молекулами, що використовуються як мітки в детектуючих аналізах, і з ефекторними молекулами, такими як гетерологічні поліпептиди, лікарські засоби або токсини. [Див. наприклад, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США №5314995; і ЕР 0396387]. 47 79582 Антитіла даного винаходу можуть бути одержані будь-яким відповідним методом, відомим фахівцям. Так, наприклад, поліпептид даного винаходу або його антигенний фрагмент може бути введений тварині для стимуляції продукування сироватки, що містить поліклональні антитіла. Термін "моноклональне антитіло" не обмежується антитілами, продукованими за допомогою гібридомної техніки. Термін "антитіло" означає поліпептид або групу поліпептидів, що складаються, принаймні, з одного зв'язуючого домену, де цей зв'язувальний домен утворюється внаслідок укладання варіабельних доменів молекули антитіла з утворенням трьохмірних зв'язуючи х областей, що мають внутрішню форму поверхонь і розподіл заряду, які комплементарні відповідним ознакам антигенної детермінанти, і, тим самим, забезпечують можливість імунологічної реакції з антигеном. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, яке походить від одного клону, включаючи еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, але не відноситься до методу його одержання. Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням багатьох методів, відомих фа хівцям, включаючи використання гібридомної техніки, техніки рекомбінантних ДНК і техніки фагового представлення. Гібридомна техніка добре відома фахівцям (див., наприклад, роботи Harlow et al. (1998); Hammerling et al. (1981) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання). Fab і F(аb')2-фрагменти можуть бути одержані, наприклад, з продукованих гібридомою антитіл шляхом протеолітичного розщеплення ферментами, такими як папаїн (для продукування Fabфрагментів) або пепсин (для продукування F(аb')2фрагментів). Альтернативно, антитіла даного винаходу можуть бути продуковані за допомогою техніки рекомбінантних ДНК або шляхом хімічного синтезу методом, відомим фахівцям. Так, наприклад, антитіла даного винаходу можуть бути одержані методами фагового представлення, відомими фахівцям. У методах фагового представлення домени функціональних антитіл представлені на поверхні фагової частинки, яка несе полінуклеотидні послідовності, які кодують ці частинки. Фаг з потрібними зв'язувальними властивостями вибирають з набору антитіл або з комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людських або мишачих) шля хом прямого відбору з використанням безпосередньо антигену, звичайно антигену, пов'язаного або іммобілізованого на твердій поверхні або сфері. Фагом, що використовується в ци х методах, звичайно є нитчастий фаг, включаючи fd і Μ13, з Fabдоменом, Fv-доменом або стабілізованим дисульфідом Fv-доменом антитіла, рекомбінантно приєднаними до фагового білка, що кодується або геном III, або геном VIII. Прикладами методів фагового представлення, які можуть бути використані для продукування антитіла даного винаходу, можуть служити методи, [описані в роботах Brinkman U. et al. (1995); Ames, R.S. et al. (1995); Kettleborough C.A. et al. (1994); Persic L. et al. (1997); Burton D.R. et al. (1994); PCT/GB91/01134; 48 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; і в патентах США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 і 5733743 (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)]. Як описано у вищезгаданих роботах, після фагового відбору, антитіло-кодуючі області даного фага можуть бути виділені і використані для генерування цілих антитіл, включаючи людські антитіла або будь-який інший потрібний антигензв'язувальний фрагмент, і експресовані в будь-якому відповідному хазяїні, включаючи клітини ссавців, клітини комах, клітини рослин, дріжджі і бактерії. Так, наприклад, рекомбінантне продукування Fab, Fab', F(ab)2 і F (аb')2-фрагментів може бути також здійснено відомими методами, такими як методи, [описані в WO 92/22324; Mullinax R.L. et al. (1992), Sawai Η. et al., (1995) і Better Μ. et al. (1988) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)]. Прикладами методів, які можуть бути використані для продукування одноланцюгових Fvфрагментів і антитіл, є методи, [описані в патентах США №№4946778 і 5258498; Huston et al. (1991); Shu L. et al. (1993); і Skerra A. et al. (1988)]. Для деяких цілей, включаючи in vivo-використання антитіл у людини і використання в детектуючих in vitro аналізах, переважно, можуть бути використані химерні, гуманізовані або людські антитіла. Методи продукування химерних антитіл відомі фахівцям. [Див. наприклад, Morrison (1985); Оі et al. (1986); Gillies S.D. et al., (1989) і патент США №5807715. Антитіла можуть бути гуманізовані з використанням ряду методів, включаючи CDR"щеплення" (ЕР 0239400; WO 91/09967; патенти США №№5530101 і 5585089), маскування або модифікацію поверхні (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Padlan E.A. (1991); Studnicka G.M. et al. (1994); Roguska M.A. et al. (1994) і "перестановку" ланцюгів (патент США №5565332). Людські антитіла можуть бути одержані рядом методів, відомих фахівцям, включаючи методи фагового представлення, описані вище. Див. також патенти США №№4444887, 4716111, 5545806 і 5814318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24983; WO 96/34096; WO 96/33735; і WO 91/10741 (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)]. Крім того, даний винахід відноситься до антитіл, рекомбінантно приєднаних або хімічно кон'югованих (включаючи ковалентне або нековалентне кон'югування) з поліпептидом даного винаходу. Ці антитіла можуть бути специфічними до антигенів, що не є поліпептидами даного винаходу. Так, наприклад, антитіла можуть бути використані для доставки поліпептидів даного винаходу в клітини конкретних типів, або in vitro, або in vivo, шляхом скріплення або кон'югування поліпептидів даного винаходу з антитілами, специфічними до конкретних рецепторів клітинної поверхні. Антитіла, пов'язані або кон'юговані з поліпептидами даного винаходу можуть бути також використані в in vitro імуноаналізах і в методах очищення, відомих фа 49 79582 хівцям. [Див. наприклад, Harbor et al., див. вище і WO 93/21232; ЕР 0439095; Naramura Μ. et al. (1994); патент США №5474981; Gillies S.O. et al. (1992); Fell H.P. et al. (1991) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)]. Даний винахід також відноситься до композицій, що містять поліпептиди даного винаходу, пов'язані або кон'юговані з доменами антитіл, що не є варіабельними областями. Так, наприклад, поліпептиди даного винаходу можуть бути пов'язані або кон'юговані з Fc-областю антитіла або з його частиною. Ця частина антитіла, сполучена з поліпептидом даного винаходу, може містити шарнірну область, домен СНІ, домен СН2 і домен СНЗ або будь-яку комбінацію цілих доменів або їх частин. Поліпептиди даного винаходу можуть бути пов'язані або кон'юговані з вищезгаданими частинами антитіл для збільшення часу півжиття поліпептидів in vivo або для використання в імуноаналізах відповідно до методів, відомих фахі вцям. Ці поліпептиди можуть бути також злиті або кон'юговані з вищезгаданими частинами антитіл з утворенням мультимерів. Так, наприклад, Fc-частини, сполучені з поліпептидами даного винаходу, можуть утворювати димери за допомогою дисульфідного зв'язку між цими Fc-частинами. Більш великі мультимерні форми можуть бути одержані шляхом сполучення поліпептидів з частинами IgA і IgM. Методи злиття або кон'югування поліпептидів даного винаходу з частинами антитіл відомі фахівцям. [Див. наприклад, патенти США №№5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5112946; ЕР 0307434; ЕР 0367166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi A. et al. (1991); Zheng X.X. et al. (1995) і Vil Η. et al. (1992) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)]. Крім того, даний винахід відноситься до антитіл, які діють як агоністи або антагоністи для поліпептидів даного винаходу. Так, наприклад, даний винахід відноситься до антитіл, які порушують взаємодію рецептор/ліганд з поліпептидами даного винаходу, або частково, або повністю. В об'єм даного винаходу входять рецепторспецифічні антитіла і лігандспецифічні антитіла. В об'єм даного винаходу входять рецепторспецифічні антитіла, які не запобігають скріпленню з лігандом, але запобігають активації рецептора. Активація рецептора (тобто передача сигналу) може бути визначена методами, описаними в даній заявці, або якиминебудь іншими відомими методами. Даний винахід також включає рецепторспецифічні антитіла, які запобігають скріпленню з лігандом і активації рецептора. Аналогічним чином, в об'єм даного винаходу входять нейтралізуючі антитіла, які зв'язуються з лігандом і запобігають скріпленню ліганду з рецептором, а також антитіла, які зв'язуються з лігандом і тим самим запобігають активації рецептора, але не запобігають скріпленню ліганду з рецептором. Даний винахід також відноситься до антитіл, які активують цей рецептор. Вказані антитіла можуть діяти як агоністи по відношенню до всіх, або не до всіх біологічних активностей, що підпадають під вплив лігандопосередкованої активації рецептора. Вказані антитіла можуть бути ви 50 значені як агоністи або антагоністи біологічних активностей, що включають описані тут питомі активності. Вищезгадані антитіла-агоністи можуть бути одержані методами, відомими фахівцям. [Див. наприклад, WO 96/40281; патент США №5811097; Deng В. et al. (1988); Chen Z. et al. (1998); Harrop J.A. et al. (1998); Zhu Z. et al. (1998), Yoon D.Y. et al. (1998); Prat M. et al., (1998); PitardV. et al. (1997); Liautard J. et al. (1997); Carlson N.G. et al. (1997); Taryman R.E. et al. (1995); Muller Y.A. et al. (1998); Bartunek P. et al. (1996) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)]. Як обговорювалося вище, антитіла для поліпептидів даного винаходу можуть бути, в свою чергу, використані для генерування антиідіотипічних антитіл, які "імітують" поліпептиди даного винаходу, методами, добре відомими фахівцям. [Див. наприклад, Greenspan & Воnа (1989); Nissinoff (1991)]. Так, наприклад, антитіла, які зв'язуються з поліпептидом і конкурентно інгібують мультимеризацію поліпептиду або скріплення поліпептиду даного винаходу з лігандом, можуть бути використані для генерування антиідіотипічних антитіл, які "імітують" мультимеризацію або скріплення домену, а, о тже, скріплення і нейтралізацію поліпептиду або його ліганду. Такі нейтралізуючі антиідіотипічні антитіла можуть бути використані для скріплення поліпептиду даного винаходу або для скріплення з його лігандом/рецептором, і тим самим блокування його біологічної активності. Рекомбінантні вектори Термін "вектор", що використовується тут, означає кільцеву або лінійну молекулу ДНК або РНК, яка є або дволанцюговою, або одноланцюговою, і яка містить, принаймні, один потрібний полінуклеотид, призначений для його перенесення в клітину-хазяїна, або в одноклітинний або в багатоклітинний організм хазяїна. Даний винахід охоплює сімейство рекомбінантних векторів, що включають регуляторний полінуклеотид, що походить від геномної послідовності РАРАР, і/або кодуючий полінуклеотид, що походить або від геномної послідовності, або від кДНКпослідовності РАРАР. У загальних рисах, рекомбінантний вектор даного винаходу може містити будь-який з описаних тут полінуклеотидів, включаючи регуляторні послідовності, що кодують послідовності і полінуклеотидні конструкції, а також будь-який праймер або зонд РАРАР, визначений вище. Більш конкретно рекомбінантні вектори даного винаходу можуть містити будь-який з полінуклеотидів, описаних в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", "кДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі області", "Полінуклеотидні конструкції" і "Олігонуклеотидні зонди і праймери". У першому переважному варіанті здійснення винаходу рекомбінантний вектор даного винаходу використовується для ампліфікації вбудованого полінуклеотиду, що походить від геномної послідовності РАРАР SEQ ID NO:3 або кДНК РАРАР, наприклад, кДНК SEQ ID NO:1 у відповідній клітині-хазяїні, причому, цей полінуклеотид ампліфіку 51 79582 ється кожний раз, коли реплікується рекомбінантний вектор. У другому переважному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до рекомбінантних векторів, що містять або регуляторний полінуклеотид, або кодуючу н уклеїнову кислоту даного винаходу, або і те і інше. У деяких варіантах здійснення винаходу експресуючі вектори використовуються для експресії поліпептиду РАРАР, який може бути потім очищений або, наприклад, використаний в лігандскринуючих аналізах або як імуноген для вироблення специфічних антитіл проти білка РАРАР. В інши х варіантах здійснення винаходу експресуючі вектори використовуються для конструювання трансгенних тварин, а також для генної терапії. Для експресії необхідно, щоб в даних векторах вироблялися відповідні сигнали, де вказаними сигналами є різні регуляторні елементи, такі як енхансери/промотори, що походять від вірусів або ссавців і регулюють експресію потрібних генів в клітинах-хазяях. Звичайно, в експресуючі вектори даного винаходу вводять маркери домінантного відбору за лікарським засобом для одержання перманентних, стабільних клітинних клонів, що експресують дані продукти, оскільки вони являють собою елементи, які здійснюють зчеплення експресії маркера відбору за лікарським засобом з експресією даного поліпептиду. Більш конкретно, даний винахід відноситься до експресуючих векторів, що включають нуклеїнові кислоти, які кодують білок РАРАР, а переважно, білок РАРАР амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2 або його варіанти або фрагменти. Даний винахід також відноситься до рекомбінантного експресуючого вектора, що використовується для експресії кодуючої послідовності РАРАР, де вказаний вектор містить нуклеїнову кислоту SEQ ID NO:1. Деякі з елементів, які можуть бути присутніми у векторах даного винаходу, більш детально описані у наступних розділах. 1. Загальні ознаки експресуючих векторів даного винаходу Рекомбінантним вектором даного винаходу є, але не обмежуються ними, YAC (штучна дріжджова хромосома), ВАС (штучна бактеріальна хромосома), фаг, фагміда, косміда, плазміда або навіть лінійна ДНК-молекула, яка може являти собою хромосомну, нехромосомну, напівсинтетичну і синтетичну ДНК. Такий рекомбінантний вектор може містити одиницю транскрипції, до складу якої входять: (1) генетичний елемент або елементи, що регулюють експресію, наприклад, промотори або енхансери. Енхансери являють собою цис-діючі елементи ДНК, звичайно довжиною приблизно 10300 п.н., які впливають на промотор, і тим самим посилюють транскрипцію; (2) структурна або кодуюча послідовність, яка транскрибується в мРНК і, зрештою, транслюється в поліпептид, причому вказана структурна або кодуюча послідовність функціонально приєднана до регуляторних елементів, описаних в (1);і (3) відповідна послідовність ініціації і термінації транскрипції. Структурні одиниці, призначені 52 для використання в дріжджових або еукаріотичних експресуючих системах, переважно, включають лідерну послідовність, що забезпечує позаклітинну секрецію трансльованого білка клітиною-хазяїном. Альтернативно, якщо рекомбінантний білок експресується за відсутності лідерної або транспортної послідовності, то він може включати N-кінцевий залишок. Потім цей залишок може, або не може, відщеплюватись від експресованого рекомбінантного білка з утворенням кінцевого продукту. В основному, рекомбінантні експресуючі вектори включають сайти ініціації реплікації, селективні маркери, що здійснюють трансформацію клітини-хазяїна, і промотор, що походить від високоекспресованого гена, для регуляції транскрипції розташованої нижче структурної послідовності. Гетерологічна структурна послідовність зазнає укладання у відповідній фазі з послідовностями ініціації і термінації трансляції, а переважно, з лідерною послідовністю, здатною регулювати секрецію білка, що транслюється в периплазматичний простір або у позаклітинне середовище. У конкретному варіанті здійснення винаходу, де вектор адаптований для трансфекції і експресії потрібних послідовностей в клітинаххазяях ссавця, переважні вектори містять сайти ініціації реплікації в потрібному хазяїні, відповідні промотор і енхансер, а також будь-які необхідні сайти скріплення з рибосомою, сигнал поліаденілювання, донорні і акцепторні сайти сплайсингу, послідовності термінації транскрипції і 5'фланкуючі нетранскрибовані послідовності. ДНКпослідовності, що походять від вірусного геному SV40, наприклад, ранній промотор, енхансер, сигнали сплайсингу і поліаденілювання, можуть бути використані для одержання необхідних не транскрибованих генетичних елементів. In vi vo-експресія поліпептиду ΡАРАР SEQ ID NO:2 або його фрагментів або варіантів може бути використана для корекції генетичного дефекту, асоційованого з експресією нативного гена в організмі хазяїна або для продукування біологічно неактивного білка ΡАРАР. Отже, даний винахід також відноситься до рекомбінантних експресуючих векторів, сконструйованих, головним чином, для продукування in vivo поліпептиду РАРАР SEQ ID NO:2 або його фрагментів або варіантів шляхом введення відповідного генетичного матеріалу в організм пацієнта, що піддається лікуванню. Цей генетичний матеріал може бути введений in vitro в клітину, яка була заздалегідь екстрагована з цього організму, після чого вказану модифіковану клітину-хазяїна знов вводять у вказаний організм, безпосередньо in vi vo у відповідну тканину. 2. Регуляторні елементи Промотори Відповідні промоторні області, що використовуються в експресуючих векторах даного винаходу, вибирають з урахуванням клітини-хазяїна, в якій повинен експресуватись гетерологічний ген. Який саме промотор використовується для регуляції експресії потрібної послідовності нуклеїнової кислоти не має вирішального значення, якщо тільки він здатний регулювати експресію нуклеїнової 53 79582 кислоти в клітинах-мішенях. Таким чином, якщо клітиною-мішенню є людська клітина, то переважно, щоб положення даної кодуючої області нуклеїнової кислоти було суміжним з даним промотором і знаходилося під контролем вказаного промотору, здатного регулювати її експресію в людській клітині, наприклад, людського або вірусного промотору. Відповідний промотор може бути ге терологічним по відношенню до нуклеїнової кислоти, експресію якої він регулює, або альтернативно, він може бути ендогенним по відношенню до нативного полінуклеотиду, що містить експресовану кодуючу послідовність. Крім того, вказаний промотор є, в основному, гетерологічним по відношенню до рекомбінантних векторних послідовностей, в які була вбудована конструкція "промотор-кодуюча послідовність". Промоторні області можуть бути вибрані з будь-якого потрібного гена з використанням, наприклад, векторів CAT (хлорамфенІколтрансферази), а більш переважно, векторів рКК232-8 і рСМ7. Переважними бактеріальними промоторуми є промотори Lad, LacZ, промотори РНК-полімерази бактеріофага Т3 або Т7, промотори gpt, лямбда PR, PL і trp (ЕР 0036776), промотор поліедрину або промотор білка ρ 10 бакуловірусу (Kit Novagen) (Smith et al, 1983; O'Reilly et al., 1992), промотор лямбда PR або також промотор trc. Еукаріотичними промоторуми є передранній промотор CMV, промотор тимідинкінази HSV, ранній і пізній промотор SV40, LTR від ретровірусу і промотор мишачого металотіонеїну-L. Вибір відповідного вектора і промотору може бути зроблений будь-яким фахівцем. Вибір промотору може бути зроблений будьяким фахівцем в області генної інженерії. Для цього фа хівець може, наприклад, звернутися до книги Sambrook et al. (1989), або також до опису відповідних процедур, приведеного в роботі Fuller et al. (1996). Інші регуляторні елементи Якщо використовується кДНК-вставка, то для ефективного здійснення поліаденілювання генного транскрипту необхідно ввести сигнал поліаденілювання. Природа сигналу поліаденілювання не має вирішального значення для успішного здійснення даного винаходу, і для цих цілей може бути використана будь-яка послідовність, така як сигнали гормону зростання людини і сигнали поліаденілювання SV40. Елементом експресійного кластера може бути також термінатор. Ці елементи можуть служити для збільшення рівнів транскрипту і для мінімізації зчитування інформації з кластера в інші послідовності. 3. Селектовані маркери Вказані маркери повинні вводити в дану клітину зміни, що ідентифікуються, які дозволяють легко ідентифікувати клітини, що містять експресійну конструкцію. Такими селективними маркерними генами для відбору трансформованих клітинхазяїв є, переважно, ген дигодрофолат-редуктази або ген резистентності до неоміцину для еукаріотичної клітинної культури, TRP1 для S.cerevisiae або ген резистентності до тетрацикліну, рифампі 54 цину або ампіциліну для Е.соіі, або ген левансахарази для мікобактерій, причому цей останній маркер є маркером негативного відбору. 4. Переважні вектори Бактеріальні вектори Як репрезентативний, але необмежувальний приклад, можуть служити вектори, що використовуються в бактеріях, які містять селективний маркер і бактеріальний сайт ініціації реплікації, і які можуть бути одержані з комерційно доступних плазмід, що містять генетичні елементи pBR322 (ATCC 37017). Такими комерційно доступними векторами є, наприклад, рКК223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) і GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Фахівцям відоме велике число інших відповідних і комерційно доступних векторів, таких як наступні бактеріальні вектори: pQE70, pQEGO, pQE9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNHSA, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia), pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAe xpress). Бактеріофагові вектори Вектор на основі бактеріофага Р1 може містити великі вставки, що складають приблизно від 80 до 100 т.п.н. Конструювання векторів на основі бактеріофагу Р1, таких як p158 або р158/nео8, конкретно описані у Steinberg (1992, 1994). Рекомбінантні клони Р1, що містять нуклеотидні послідовності РАРАР, можуть бути сконструйовані шляхом вбудовування великих нуклеотидів, що складають більш ніж 40 т.п.н. (Linton et al. 1993). Для генерування ДНК PI з метою проведення трансгенних експериментів, переважним протоколом такого генерування є протокол, описаний McCormick et al. (1994). Коротко, Е.соіі (переважно, штам NS3529), що містить плазміду Р1, культивують протягом ночі у відповідному поживному середовищі, що містить 25мкг/мл канаміцину. ДНК Р1 виділяють з Е.соіі шляхом лужного лізису з використанням набору Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) відповідно до інструкцій виробників. Потім ДНК PI очищають від бактеріального лізату на двох колонках Qiagen-tip 500 з використанням промивальних і елююючих буферів, що містяться в даному наборі. Після екстракції фенолом/етанолом здійснюють преципітацію ДНК 70%ним етанолом. Після солюбілізації ДНК в ТЕ (10мМ Трис-НСІ, рН 7,4, 1мМ EDTA), концентрацію ДНК оцінюють на спектрофотометрі. Якщо метою є експресія клону Р1, що містить нуклеотидні послідовності РАРАР, в трансгенній тварині, звичайно в трансгенній миші, то бажано видалити векторні послідовності з ДНК-фрагменту Р1, наприклад, шляхом відщеплення ДНК PI в сайтах, що рідко розрізаються, в полілінкері PI (Sfil, NotI або Sail). Потім вставку Р1 виділяють з векторних послідовностей на агарозному гелі в імпульсному полі методами, аналогічними методам, які були нещодавно описані для виділення ДНК з YAC (Schedl et al., 1993a; Peterson et al., 1993). На цій стадії одержану очищену ДНК-вставку концентру 55 79582 ють, якщо це необхідно, на міліпористому фільтрі Millipore Ultrafree-MC Filter Unit (Millipore, Bedford, MA, USA - гранична молекулярна маса 30000), а потім діалізують проти буфера для мікроінжекції (10мМ Трис-НСІ, рН 7,4; 250мкМ EDTA), що містить 100мМ NaCl, 30мкМ сперміну, 70мкМ спермідину, на мембрані для мікродіалізу (тип VS, 0,025мкМ від Millipore). Цілісність очищеної ДНКвставки Р1 оцінюють за допомогою електрофорезу в імпульсному полі на 1% агарозному гелі (Sea Kern GTG; FMC Bio-products) і з фарбуванням етидійбромідом. Бакуловірусні вектори Відповідним вектором для експресії поліпептиду РАРАР SEQ ID NO:2 або його фрагментів або варіантів є вектор на основі бакуловірусу, який розмножується в клітинах комахи або в клітинних лініях комах. Особливо придатною векторною системою хазяїна є бакуловірусний вектор перенесення pVL1392/1393 (Pharmingen), який використовують для трансфекції клітинної лінії SF9 (АТСС №CRL 1711), що походить від Spodoptera frugiperda. Відповідно до даного винаходу, інши х відповідних векторів для експресії поліпептиду РАРАР SEQ ID NO:2 або його фрагментів або варіантів в бакуловірусній системі експресії є вектори, описані Chai et al. (1993), Vlasak et al. (1983)iLenhardetal.(1996). Вірусні вектори В одному конкретному варіанті здійснення винаходу вектор одержують з аденовірусу. Переважними аденовірусними векторами даного винаходу є вектори, описані Feldman & Steg (1996) або Ohno et al. (1994). Відповідно до даного винаходу іншим переважним рекомбінантним аденовірусом є аденовірус людини тину 2 або 5 (Ad 2 або Ad 5) або аденовірус, що походить від тварини [заявка на патент Франції №FR-93.05954]. Як системи доставки рекомбінантного гена для перенесення екзогенних полінуклеотидів in vivo, зокрема, ссавцям, включаючи людину, звичайно використовуються вектори, одержані на основі ретровірусів і аденоасоційованих вірусів. Ці вектори забезпечують ефективну доставку генів в клітини, і перенесені нуклеїнові кислоти стабільно інтегруються в хромосомну ДНК хазяїна. Особливо переважними ретровірусами для одержання або конструювання ретровірусних носіїв для in vi vo або in vitro для доставки гена даного винаходу є ретровіруси, вибрані з групи, що складається з фокус-індукуючого вірусу клітин норки, вірусу саркоми миші, вірусу ретикулоендотеліозу і вірусу саркоми Рауса. Особливо переважними вірусами мишачого лейкозу є штами 4070А і 1504А, віруси Абельсона (АТСС № VR-999), Фрейнда (АТСС № VR-245), Гросса (АТСС № VR-590), Раушера (АТСС № VR-998) і вірус мишачого лейкозу Молоні (АТСС № VR-190; заявка РСТ № WO 94/24298). Особливо переважними вірусами саркоми Рауса є вірус Бріана з високим титром (АТСС № VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 і VR-728). Іншими переважними ретровірусними векторами є вектори, описані Roth et al. (1996), в заявці РСТ № 56 WO 93/25234, в заявці РСТ № WO 94/06920, Roux et al., 1989, Julan et al, 1992, і Neda et al, 1991. Інша система вірусних векторів, яка може бути використана в даному винаході, містить аденоасоційований вірус (AAV). Цей аденоасоційований вірус є природним дефектним вірусом, якому, для його ефективної реплікації і для продуктивного клітинного циклу, потрібний інший вірус-помічник, такий як аденовірус або герпесвірус (Muzyczka et al, 1992). Він також є одним з декількох вірусів, які можуть інтегрувати свою ДНК в неподільні клітини і виявляють високу частоту стабільної інтеграції (Flotte et al, 1992; Samulski et al, 1989; McLaughlin et al, 1989). Однією з переважних ознак AAV є те, що його ефективність трансдукції в первинні клітини менше, ніж в трансформовані клітини. ВАС-вектори Система клонування штучної бактеріальної хромосоми (ВАС) (Shizuya et al., 1992) була розроблена для стабільного підтримання великих фрагментів геномної ДНК (100-300 т.п.н.) в Е.соіі. Переважним ВАС-вектором є вектор рВеlоВАСll, описаний Kirn et al. (1996). ВАС-бібліотеки, що містять цей вектор, одержують з використанням відібраної за розміром геномної ДНК, частково гідролізованої ферментами, які дозволяють її лігувати або в BamHI-сайт, або в HindIII-сайт в даному векторі. Ці сайти клонування фланкуються сайтами ініціації транскрипції РНК-полімерази Т7 і SP6, які можуть бути використані для генерування кінцевих зондів або шляхом транскрипції РНК, або ПЛР-методами. Після конструювання ВАСбібліотеки в Е.соіі, ВАС-ДНК виділяють з клітинихазяїна у вигляді суперспіралізованого кільця. Після перетворення цих кільцевих молекул в їх лінійну форму визначають їх розмір і ці ВАС вводять в клітини реципієнта. Клонуючий сайт фланкований двома Notl-сайтами, що дозволяє вирізати ці клоновані сегменти з вектора за допомогою Notlгідролізу. Альтернативно, ДНК-вставка, що міститься у векторі рВеlоВАСll, може бути лінеаризована шляхом обробки ВАС-вектора комерційно доступним ферментом лямбда-терміназою, що приводить до його розрізання в унікальному cosNсайті, але цей метод гідролізу дає повнорозмірний ВАС-клон, що містить як ДНК-вставку, так і ВАСпослідовності. 5. Доставка рекомбінантних векторів Для здійснення експресії полінуклеотидів і полінуклеотидних конструкцій даного винаходу ці конструкції повинні бути доставлені в клітину. Така доставка може бути здійснена in vitro лабораторними процедурами, що проводяться для трансформації клітинних ліній, in vivo або ex vi vo, а також для лікування деяких патологічних станів. Одним з таких механізмів є інфікування вірусом, де експресійна конструкція інкапсульована в інфекційну вірусн у частинку. У даному винаході також розглядається декілька невірусних способів перенесення полінуклеотидів в клітини ссавців, що культивуються, і такими способами є, але не обмежуються ними, преципітація фосфатом кальцію (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987); DEAE-декстранова трансфекція (Gopal et al., 1985), електропорація (Tur-Kaspa et 57 79582 al., 1986; Potter et al., 1984), пряма мікро інжекція (Harland et al., 1985), використання ДНКнавантажених ліпосом (Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979) і опосередкована рецептором трансфекція (Wu & Wu, 1987; 1988). Деякі з цих методів можуть бути успішно адаптовані для використання in vivo або e x vi vo. Після доставки експресованого полінуклеотиду в клітину, він може стабільно інтегруватися в геном клітини-реципієнта. Ця інтеграція може відбуватися в когнатній локалізації і орієнтації за допомогою гомологічної рекомбінації (заміни гена), або вона може відбуватися у випадковому неспецифічному положенні (додавання гена). У інших варіантах здійснення винаходу нуклеїнова кислота може стабільно підтримуватися в клітині як окремий, епісомний сегмент ДНК. Такі сегменти нуклеїнової кислоти або "епісоми" кодують послідовності, придатні для їх збереження і реплікації незалежно або синхронізовано з циклом клітинихазяїна. Один з конкретних варіантів здійснення методу доставки білка або пептиду всередину клітини хребетного in vivo включає стадію введення препарату, що містить фізіологічно прийнятний носій і "голий" полінуклеотид, що функціонально кодує потрібний поліпептид в інтерстиціальному просторі тканини, що містить дану клітину, внаслідок чого цей "голий" полінуклеотид проникає всередину клітини і володіє фізіологічною дією. Цей спосіб, зокрема, застосовується для перенесення in vitro, але він може бути також застосований і для перенесення in vivo. Композиції для використання in vitro і in vivo, що включають "голий" полінуклеотид, описані в заявці РСТ № WO 90/11092 (Vical Inc.), а також в заявці РСТ № WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa) і в статтях Tacson et al. (1996) і Huygen et al. (1996). В іншому варіанті здійснення винаходу перенесення "голого" полінуклеотиду даного винаходу, включаючи полінуклеотидну конструкцію даного винаходу, в клітини може бути здійснений шляхом бомбардування частинками (біобалістики), де вказані частинки являють собою "мікроснаряди", покриті ДНК і що прискорюються з високою швидкістю, яка дозволяє їм "пробивати" клітинні мембрани і проникати в клітини, не викликаючи їх загибель, так, як описано Klein etal. (1987). В іншому варіанті здійснення винаходу полінуклеотид даного винаходу може бути інкапсульований в ліпосому (Ghosh & Bacchawat 1991; Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987). У конкретному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до композиції для in vivo продукування описаного тут білка або поліпептиду РАРАР. Ця композиція містить "голий" полінуклеотид, що функціонально кодує вказаний поліпептид, в розчині, у фізіологічно прийнятному носії, і придатний для введення в тканину, так, щоб клітини цієї тканини експресували вказаний білок або поліпептид. Кількість вектора, який ін'єкується в потрібний організм хазяїна, варіюється в залежності від ділянки ін'єкції. Як приклад, вказаний вектор може 58 бути ін'єкований в дозі, що складає від 0,1 до 100мкг, в організм тварини, переважно, ссавця, наприклад, миші. В іншому варіанті вектора даного винаходу цей вектор може бути введений в клітину-хазяїна in vitro, а переважно, в клітину-хазяїна, заздалегідь виділену з організму обробленої тварини, а більш переважно, в соматичну клітину, таку як м'язова клітина. У подальшій стадії клітину, яка була трансформована вектором, що кодує потрібний поліпептид РАРАР або його потрібний фрагмент, знов вводять в організм тварини для місцевої або системної доставки рекомбінантного білка в даний організм. Клітини-хазяї Іншим об'єктом даного винаходу є клітинахазяїн, яка була трансформована або трансфіковані одним з описаних тут полінуклеотидів, а зокрема, полінуклеотидом, що містить або регуляторний полінуклеотид РАРАР, або кодуючу область поліпептиду РАРАР SEQ ID N0:1 або 3, або його фрагментом або варіантом. Даний винахід також відноситься до клітин-хазяїв, які були трансформовані (прокаріотичні клітини) або трансфіковані (еукаріотичні клітини) рекомбінантним вектором, таким як один з векторів, описаних вище. Більш конкретно, клітини-хазяїв даного винаходу можуть включати будь-який з полінуклеотидів, описаних в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", "кДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі області", "Полінуклеотидні конструкції" і "Олігонуклеотидні зонди і праймери". Інша рекомбінантна клітина-хазяїн даного винаходу містить будь-який з описаних тут векторів, а більш конкретно, будь-який з векторів, описаних в розділі "Рекомбінантні вектори". Переважними клітинами-хазяїнами, що використовуються як реципієнти для експресуючих векторів даного винаходу, є: a) прокаріотичні клітини-хазяї: штами Escherichia coli (штам I.E. DH5a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, і штами таких видів як Pseudomonas, Streptomyces і Staphylococcus. b) еукаріотичні клітини-хазяї: клітини HeLa (ATCC №CCL2; №CCL2.1; №CCL2.2), клітини Cvl (ATCC №CCL70), клітини COS (ATCC №CRL1650; №CRL1651), клітини Sf-9 (ATCC №CRL1711), клітини С127 (ATCC №CRL-1804), клітини ЗТЗ (ATCC №CRL-6361), клітини СНО (ATCC №CCL-61), клітини нирок людини 293 (ATCC №45504; №CRL1573) і клітини ВНК (ЕСАСС №84100501; №84111301). c) інші клітини-хазяї ссавців. Експресія гена РАРАР в клітинах ссавців, а звичайно людини, може бути зроблена дефектною, або альтернативно, вона може бути здійснена шляхом інсерції геномної або кДНКпослідовності РАРАР із заміною відповідного генааналога РАРАР в геномі клітини ссавця полінуклеотидом РАРАР даного винаходу. Ці генетичні альтерації можуть бути генеровані за допомогою подій гомологічної рекомбінації з використанням специфічних ДНК-конструкцій, які були заздалегідь описані раніше. 59 79582 Одним з видів клітин-хазяїв, що використовуються, є зиготи ссавців, такі як мишачі зиготи. Так, наприклад, в мишачі зиготи може бути введена, шляхом мікроінжекції, очищена молекула ДНК, що представляє інтерес, наприклад, очищена молекула ДНК, яка заздалегідь була доведена до концентрації в межах від 1нг/мл, для ВАС-вставок, і до 3нг/мкл, для вставок бактеріофага Р1, в 10мМ Трис-НСІ, рН 7,4, 250мкМ EDTA, що містить 100мМ NaCl, 30мкМ сперміну, і 70мкМ спермідину. Якщо вказана мікроін'єкована ДНК має великий розмір, то, щоб уникнути механічного пошкодження цієї ДНК, можуть бути використані поліаміни і високі концентрації солей, як описано Schedl et al (1993b). Будь-який з полінуклеотидів даного винаходу, включаючи описані тут ДНК-конструкції, можуть бути введені в лінію ембріональних стовбурових клітин (ЕСК), а переважно, мишачу лінію ЕСК. Лінії ЕСК походять від плюрипотентних некомітованих клітин внутрішньої клітинної маси бластоцистів перед імплантацією. Переважними лініями ЕСК є: ES-E14TG2a (ATCC №CRL-1821), ES-D3 (АТСС №CRL 1934 і №CRL-11632), YS001 (АТСС №CRL11776), 36,5 (АТСС №CRL-11116). Для підтримки ЕСК в некомітованому стані, їх культивують в присутності живильних клітин з інгібованим зростанням, які передають відповідні сигнали для збереження цього ембріонального фенотипу і служать як матриця для адгезії ЕСК. Переважними живильними клітинами є первинні ембріональні фібробласти, які одержують з тканини 13-денних 14 ембріонів фактично будь-якого мишачого штаму, що підтримуються в культурі, як описано Abbondanzo et al. (1993), і зростання яких інгібується шляхом їх опромінення, як описано Robertson (1987), або завдяки присутності інгібуючої концентрації LIF, як описано Pease & Williams (1990). Ці конструкції в клітинах-хазяїнах можуть бути використані відповідним чином для продукування генного продукту, що кодується рекомбінантною послідовністю. Після трансформації відповідного хазяїна і культивування хазяїна до відповідної клітинної щільності, вибраний промотор індукується відповідними способами, такими як зміна температури або хімічна індукція, і клітини культивують ще протягом деякого часу. Клітини звичайно збирають шляхом центрифугування, руйнують фізичними або хімічними методами і одержаний неочищений екстракт зберігають для подальшого очищення. Мікробні клітини, що використовуються для експресії білків, можуть бути зруйновані стандартними способами, включаючи проведення циклів заморожування-відтавання, обробку ультразвуком, механічну дизрупцію або використання агентів для лізису клітин. Ці методи добре відомі фахівцям. Активація гена РАРАР Даний винахід також відноситься до первинних, вторинних і іммобілізованих рекомбінантних клітин, одержаних за допомогою гомологічної рекомбінації з клітин хребетних, переважно, клітин ссавців, а особливо переважно, з клітин людини, які були сконструйовані для: а) вбудовування екзо 60 генних (гетерологічних) полінуклеотидів в ендогенну хромосомну ДНК потрібного гена, (b) делетування ендогенних хромосомних ДНК, і/або (с) заміни ендогенної хромосомної ДНК екзогенними полінуклеотидами. Інсерції, делеції і/або заміни полінуклеотидних послідовностей можуть бути здійснені в кодуючи х послідовностях цільового гена і/або в регуляторних областях, таких як промоторні і енхансерні послідовності, функціонально асоційовані з цільовим геном. Даний винахід також відноситься до способу одержання рекомбінантних клітин-хазяїв, продукованих за допомогою гомологічної рекомбінації in vitro або in vivo, де експресія цільового гена, аномально експресованого в даній клітині, є зміненою. Така зміна, переважно, приводить до експресії цільового гена в нормальних умовах зростання або в умовах, відповідних для продукування поліпептиду, що кодується цільовим геном. Цей спосіб включає стадії: (а) трансфекції клітини in vitro або in vivo полінуклеотидною конструкцією, яка містить (і) послідовність для доставки; (іі) регуляторну послідовність і/або кодуючу послідовність; і (ііі) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо необхідно, з продукуванням трансфікованої клітини; (b) підтримки трансфікованої клітини in vitro або in vivo в умовах, відповідних для гомологічної рекомбінації. Даний винахід також відноситься до способу зміни експресії цільового гена в клітині in vitro або in vivo, де вказаний ген аномально експресується, причому вказаний спосіб включає стадії: (а) трансфекції клітини in vitro або in vivo полінуклеотидною конструкцією, яка містить (1) послідовність для доставки; (іі) регуляторну послідовність і/або кодуючу послідовність; і (ііі) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо це необхідно, з продукуванням трансфікованої клітини; (b) підтримку трансфікованої клітини in vitro або in vivo в умовах, відповідних для гомологічної рекомбінації, з продукуванням рекомбінантної клітини за допомогою гомологічної рекомбінації; і (с) підтримання вказаної рекомбінантної клітини in vitro або in vivo в умовах, відповідних для експресії даного гена. Даний винахід також відноситься до способу одержання поліпептиду даного винаходу шляхом зміни експресії цільового ендогенного гена в клітинах-хазяїнах in vitro або in vivo, де вказаний ген аномально експресується в даній клітині; причому вказаний спосіб включає стадії: (а) трансфекції клітини in vitro або in vivo полінуклеотидною конструкцією, яка містить (і) послідовність для доставки; (іі) регуляторну послідовність і/або кодуючу послідовність; і (ііі) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо необхідно, з продукуванням трансфікованої клітини; (b) підтримку трансфікованої клітини in vitro або in vivo в умовах, відповідних для гомологічної рекомбінації, з продукуванням гомологічно рекомбінантної клітини; і (с) підтримання рекомбінантної клітини, продукованої за допомогою гомологічної рекомбінації in vitro або in vivo, в умовах, відповідних для експресії даного гена, з одержанням вказаного поліпептиду. Даний винахід також відноситься до полінуклеотидої конструкції, яка змінює експресію цільового гена в клітині певного типу, в якій він анома