Спосіб профілактики і лікування амілоїдогенних хвороб

1. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А b в мозку пацієнта, який включає у себе введення пацієнту ефективної дози фармацевтичної композиції, що містить антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом на залишках 1-10A b , причому антитілом є ізотип IgG1 людини. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад. 2 (19) 1 3 81215 16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло специфічно зв'язується з епітопом, який містить вільний Мкінцевий залишок А b . 17. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло зв'язується з епітопом на залишках 1-10А b , де залишком 1 і/або залишком 7 А b є ізоаспартанова кислота. 18. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що пацієнтом є пацієнт, який не виказує симптомів хвороби. 19. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що вік пацієнта є менше 50 років. 20. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що пацієнт має успадкований фактор ризику, який вказує на його схильність до хвороби Альцгеймера. 21. Спосіб за будь-яким з пп. 1-20, який відрізняє ться тим, що пацієнт не має відомих факторів ризику хвороби Альцгеймера. 22. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитілом є антитіло людини. 23. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняє ться тим, що антитілом є гуманізоване антитіло. 24. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняє ться тим, що антитілом є химерне антитіло. 25. Спосіб за будь-яким з пп. 1-21, який відрізняє ться тим, що антитілом є антитіло миші. 26. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитілом є поліклональне антитіло. 27. Спосіб за будь-яким з пп. 1-25, який відрізняє ться тим, що антитілом є моноклональне антитіло. 28. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що він включає у себе також введення ефективної дози принаймні одного іншого антитіла, що зв'язується з іншим епітопом Аb. 29. Спосіб за будь-яким з пп. 1-28, який відрізняє ться тим, що антитіло містить дві копії одної і тої самої пари легкого і важкого ланцюгів. 30. Спосіб за будь-яким з пп. 1-28, який відрізняє ться тим, що антитілом є біспецифічне антитіло, яке містить першу пару легкого і важкого ланцюгів, яка специфічно зв'язується з епітопом А b , і другу пару легкого і важкого ланцюгів, яка специфічно зв'язується з Fc-рецептором на мікрогліальних клітинах. 31. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що ланцюг антитіла злитий з гетерологічним поліпептидом. 32. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що доза антитіла складає принаймні 1 мг/кг маси тіла пацієнта. 33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що доза антитіла складає принаймні 10 мг/кг маси тіла пацієнта. 4 34. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло вводять з носієм як фармацевтичну композицію. 35. Спосіб за пп. 1-22, 26, 27-34, який відрізняє ться тим, що антитілом є антитіло людини до Ар, приготоване із В-клітин людини, імунізованої пептидом А b . 36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що людина, імунізована пептидом А b , є пацієнтом. 37. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло специфічно зв'язується з пептидом А b , не зв'язуючись з амілоїдним прекурсорним білком повної довжини (АРР). 38. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло вводять інтраперитонеально, перорально, інтраназально, підшкірно, внутрішньом'язово, місцевим шляхом або внутрішньовенно. 39. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло вводять шляхом уведення полінуклеотиду, що кодує принаймні один ланцюг антитіла, пацієнтові, де полінуклетид експресується для продукування ланцюга антитіла в пацієнті. 40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що полінуклеотид кодує важкий і легкий ланцюги антитіла, де полінуклеотид експресується для продукування важкого і легкого ланцюгів в пацієнті. 41. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що він включає у себе також моніторинг рівня введеного антитіла в крові пацієнта. 42. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що антитіло вводять багатьма дозами протягом часу, який складає принаймні 6 місяців. 43. Спосіб за будь-яким з пп. 1-41, який відрізняє ться тим, що антитіло вводять як композицію з підтримуваним звільненням. 44. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А b в мозку пацієнта, який відрізняється тим, що він включає у себе введення пацієнту ефективної дози поліпептиду, що містить N-кінцевий сегмент принаймні на залишках 1-5 А b , де перший залишок А b є N-кінцевим залишком поліпептиду, а поліпептид не містить С-кінцевого сегмента А b . 45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом. 46. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера. 47. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна. 48. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад. 49. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями Ар в мозку пацієнта, який відрізняється тим, що він включає у себе введення пацієнту ефективної дози поліпептиду, що містить N-кінцевий сегмент 5 81215 А b , де сегмент починається на залишках 1-3 А b і закінчується на залишках 7-11 А b . 50. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом. 51. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера. 52. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна. 53. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад. 54. Спосіб за будь-яким з пп. 44-53, який відрізняє ться тим, що N-кінцевий сегмент А b зв'язаний на його С-кінці з гетерологічним поліпептидом. 55. Спосіб за п. 54, який відрізняється тим, що Nкінцевий сегмент складається із амінокислотної послідовності DAEFRHD (SEQ. ID. No 77). 56. Спосіб за п. 55, який відрізняється тим, що поліпептид містить амінокислотну послідовність DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID. No 52). 57. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що Nкінцевий сегмент А b зв'язаний на його N-кінці з гетерологічним поліпептидом. 58. Спосіб за п. 57, який відрізняється тим, що поліпептид містить амінокислотну послідовність AKXVAAWTLKAAAD AEFRHD (SEQ. ID. No 56). 59. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що Nкінцевий сегмент А b зв'язаний на його N- і Скінцях з першим і другим гетерологічними пептидами. 60. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що Nкінцевий сегмент Ар зв'язаний на його N-кінці з гетерологічним поліпептидом і зв'язаний на його С-кінці принаймні з однією додатковою копією Nкінцевого сегмента. 61. Спосіб за будь-яким з пп. 54-58 і 60, який відрізняє ться тим, що гетерологічний поліпептид викликає Т-клітинну реакцію проти гетерологічного поліпептиду і тим самим В-клітинну реакцію проти N-кінцевого сегмента. 62. Спосіб за будь-яким з пп. 44-58 і 61, який відрізняє ться тим, що поліпептид також містить принаймні одну додаткову копію N-кінцевого сегмента. 63. Спосіб за п. 49, який відрізняється тим, що поліпептид містить від N-кінця до С-кінця Nкінцевий сегмент А b , множину додаткових копій N-кінцевого сегмента і гетерологічний амінокислотний сегмент. 64. Спосіб за будь-яким з пп. 44-63, який відрізняє ться тим, що N-кінцевий сегмент складається із А b 1-7. 65. Спосіб за будь-яким з пп. 44-54, 57 і 59, який відрізняє ться тим, що N-кінцевий сегмент складається із А b 3-7. 66. Спосіб за будь-яким з пп. 44-53, який відрізняє ться тим, що поліпептид складається із А b 1-7. 67. Спосіб за будь-яким з пп. 44-53, який відрізняє ться тим, що поліпептид складається із А b 3-7. 6 68. Спосіб за будь-яким з пп. 44-63, який відрізняє ться тим, що поліпептид не містить принаймні 5 С-кінцевих амінокислот в А b 43. 69. Спосіб за будь-яким з пп. 44-67, який відрізняє ться тим, що поліпептид уводять з ад'ювантом, який підсилює імунну реакцію на Nкінцевий сегмент. 70. Спосіб за п. 69, який відрізняється тим, що ад'ювант і поліпептид уводять разом як композицію. 71. Спосіб за п. 69, який відрізняється тим, що ад'ювант уводять перед поліпептидом. 72. Спосіб за п. 69, який відрізняється тим, що ад'ювант уводять після поліпептиду. 73. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняє ться тим, що ад'ювантом є сіль алюмінію. 74. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняє ться тим, що ад'ювантом є MPL. 75. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняє ться тим, що ад'ювантом є QS-21. 76. Спосіб за будь-яким з пп. 69-72, який відрізняє ться тим, що ад'ювантом є неповний ад'ювант Фрейнда. 77. Спосіб за будь-яким з пп. 44-76, який відрізняє ться тим, що доза поліпептиду є більшою, ніж 10 мкг. 78. Спосіб профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А b в мозку пацієнта, який включає у себе введення пацієнту е фективної дози агента, який викликає імуногенну реакцію на N-кінцевий сегмент А b , де сегмент починається на залишках 1-3 А b і закінчується на залишках 7-11 А b , не викликаючи імунну реакцію проти епітопу на залишках 12-43 А b 43. 79. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хвороба характеризується когнітивним розладом. 80. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хворобою є хвороба Альцгеймера. 81. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хворобою є синдром Дауна. 82. Спосіб за п. 78, який відрізняється тим, що хворобою є м'який когнітивний розлад. 83. Фармацевтична композиція, яка містить поліпептид згідно з визначенням за будь-яким з пп. 44-67 і ад'ювант. 84. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло згідно з визначенням за будь-яким з пп. 117, 22-27, 29-31, 35 і 36 і фармацевтично прийнятний носій. 85. Спосіб скринінгу антитіла за активністю в лікуванні хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями А b в мозку пацієнта, який відрізняє ться тим, що включає у себе приведення в контакт антитіла з поліпептидом, що містить принаймні п'ять суміжних амінокислот Nкінцевого сегмента А b , який починається на залишку між 1 і 3 А b , де поліпептид не має Скінцевого сегмента А b , і визначення того, чи зв'язується антитіло специфічно з поліпептидом, де специфічне зв'язування служить ознакою того, що дане 7 антитіло є активним 81215 у лікуванні хвороби Дана заявка являє собою часткове продовження заявки USSN 09/322,289, поданої 28 травня 1999р. і включеної тут в усій її повноті шляхом посилання для всіх цілей. Даний винахід стосується галузей імунології і медицини. Хвороба Альцгеймера є прогресуючою хворобою, що призводить до старечого недоумства, див. [Selkoe, TINS 16,403-409 (1993); Hardy et a!., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol Exp. Neurol. 53,438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995)]. Взагалі кажучи, ця хвороба поділяється на дві категорії': пізнього виникнення, що спостерігається в літньому віці (65 плюс декілька років) і раннього виникнення, що розвивається задовго до старечого періоду життя, тобто між 35 і 60 роками. Хвороби обох цих категорій мають однакову патологію, але аномалії виказують тендецію до більш тяжких і поширених станів, якщо хвороба розпочалася у більш ранньому віці. Для цієї хвороби характерними є два типи ушкоджень в мозку - старечі бляшки і нейрофібрілярні клубки. Старечі бляшки являють собою ділянки неупорядкованого нейропіля поперечним розміром до 150мкм зі зовнішньоклітинними амілоїдними відкладеннями в центрі, що спостерігаються під мікроскопом на зрізах мозкової тканини. Нейрофібрілярні клубки являють собою внутрішньоклітинні відкладення асоційованого з мікротрубочками тау-білка, що складається з двох сплетених в пари ниток. Головною складовою бляшок є пептид, що зветься Αβ або β-амілоїдний пептид. Пептид Αβ складається із амінокислот 39-43 і являє собою внутрішній фрагмент прекурсорного білка, що зветься амілоідним прекурсорним білком (АРР: amyloid precursor protein). Була виявлена кореляція декількох мутацій в білку АРР з хворобою Альцгеймера, див., наприклад, [Goate et al., Nature 349,704 (1991) (валін 717 на ізолейцин); Chartier Harlan et al. Nature, 353, 844 (1991)) (валін 717 на гліцин); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (валін 717 на фенілаланін); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345 (1992) (подвійна мутація зі зміною лізин 595-метіоніну596 на аспарагін 595596 лейцин ). Вважається, що такі мутації викликають хворобу Альцгеймера шляхом збільшеного або зміненого процесінгу АРР на Αβ, і особливо процесінгу АРР на збільшені кількості довгої форми Αβ (тобто Αβ1-42 і Αβ1-43). Мутації в інших генах, таких, як пресенільні гени PS1 і PS2, очевидно, зачеплюють процесінг АРР непрямим чином з генерацією збільшених кількостей довгомірного Αβ, див., наприклад, [Hardy, TINS 20, 154 (1997)]. Ці спостереження вказують на те, що Αβ, і особливо його довга форма, є каузальним елементом хвороби Альцгеймера. В патенті ЕР 526511 (автор McMichael) пропонується вводити пацієнтам з діагнозом 8 Альцгеймера. хвороби Альцгеймера гомеопатичні дози Αβ (до 10-2мг/день). У звичайної людини, організм якої містить приблизно 5л плазми, навіть максимальний рівень цієї дози навряд чи створить концентрацію більше 2пг/мл. Нормальна концентрація Αβ в людській плазмі знаходиться, як правило, в межах 50-200пг/мл [Seubert et al., Nature 359, 325-327 (1992)]. Таким чином, оскільки запропонована в ЕР 526,511 доза не дозволяє сподіватися на досягнення суттєви х змін рівня циркулюючого Αβ, і оскільки в ЕР 526,511 не пропонується використання ад'юванту у якості імуностимулятора, здається малоймовірним одержання таким шляхом відчутного терапевтичного результату. У протилежність цьому даний винахід спрямований, поряд з іншим, на лікування хвороби Альцгеймера та інших амілоїдогенних хвороб шляхом уведення фрагментів Αβ або антитіла проти певних епітопів в Αβ пацієнту в умовах, що викликають у нього відчутн у імунну реакцію. Таким чином, даний винахід задовільняе давно назрілу потребу у визначенні терапевтичних режимів профілактики або поліпшення нейропатології і, у деяких випадках, когнітивного розладу, пов'язаного з хворобою Альцгеймера. Дана заявка має своїми попередниками такі матеріали: W099/27944 від 30 листопада 1998p., USSN 60/067,740 від 2 грудня 1997р., USSN 60/080,970 від 7 квітня 1998р. і USSN 09/201,430 від 30 листопада 1998p., включені тут в усій їхній повноті шляхом посилання для всіх цілей. В одному зі своїх аспектів даний винахід стосується способів профілактики або лікування хвороб, пов'язаних із амілоїдними відкладеннями білка Αβ в мозку пацієнта. До таких хвороб належать хвороба Альцгеймера, синдром Дауна і когнітивний розлад. Останній може виникати як супроводжуваний характерними ознаками амілоїдогенного захворювання, так і без них. У деяких способах згідно з даним винаходом застосовується введення ефективних доз антитіла, що специфічним чином зв'язується з компонентом амілоїдного відкладення у пацієнта. Такі способи є особливо ефективними у профілактиці або лікуванні хвороби Альцгеймера у людей. У деяких запропонованих способах застосовується введення ефективних доз антитіла, що зв'язується з Αβ. Деякі способи базуються на введенні ефективних доз антитіла, що специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-10 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічним чином зв'язується з епітопом у межах залишків 1-6 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічним чином зв'язується з епітопом у межах залишків 1-5 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-7 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епгтопом у 9 81215 межах залишків 3-7 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-3 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епітопом у межах залишків 1-4 пептиду Αβ. У деяких способах антитіло зв'язується з епітопом, що містить вільний N-кінцевий залишок пептиду Αβ. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з епгтопом у межах залишків 1-10 пептиду Αβ, де залишком 1 і/або залишком 7 пептиду Αβ є аспартанова кислота. У деяких способах антитіло специфічно зв'язується з пептидом Αβ, не зв'язуючись при цьому з амілоідним прекурсорним білком АРР повної довжини. У деяких способах ізотипом антитіла є lgG1 людини. У деяких способах антитіло зв'язується з амілоідним відкладенням у пацієнта і викликає реакцію видалення амілоідного відкладення. Наприклад, така реакція видалення може здійснюватися шляхом фагоцитозу, опосередкованого Fc-рецептором. Ці способи можуть застосовуватися як до пацієнтів, що не мають симптомів хвороби, так і до пацієнтів, які на даний час виказують її симптоми. Антитілами, застосовуваними в даних способах, можуть бути людські, пристосовані до людей (гуманізовані), химерні та іншого походження антитіла, які можуть бути моноклональними або поліклональними. У деяких способах антитіло беруть у людини, імунізованої пептидом Αβ, причому такою людиною може бути сам пацієнт, для лікування якого призначене це антитіло. У деяких способах антитіло вводять разом із фармацевтичним носієм у формі фармацевтичної композиції. У деяких способах антитіло вводять дозою від 0,0001 до 100мг/кг, краще, якщо принаймні 1 мг/кг маси тіла пацієнта. У деяких способах антитіло вводять багатократними дозами протягом тривалого часу, наприклад, принаймні 6 місяців. У деяких способах антитіло вводять у формі композиції з підтримуваним виділенням. Антитіло може вводитися, наприклад, інтраперитонеальним, пероральним, підшкірним, інтракраніальним, внутрішньом'язовим, місцевим, інтраназальним і внутрішньовенним шляхами. У деяких способах антитіло вводять шляхом уведення полінуклеотиду, що кодує у пацієнта принаймні один ланцюг антитіла. Цей полінуклеотид експресується на продукування у пацієнта ланцюга антитіла. У разі протреби цей полінуклеотид кодує важкі і легкі ланцюги антитіла. Такий полінуклеотид експресується на продукування у пацієнта важких і легких ланцюгів. У деяких способах здійснюється моніторинг рівня введеного антитіла в крові пацієнта. В іншому своєму аспекті даний винахід пропонує способи профілактики або лікування хвороби, пов'язаної з амілоїдними відкладеннями пептиду Αβ в мозку пацієнта. Такі способи можуть застосовуватися, наприклад, у лікуванні хвороби Альцгеймера або синдрому Дауна, або когнітивного розладу. Такі способи передбачають уведення фрагментів Аβ або його аналогів, що викликають імуногенну реакцію на деякі епітопи в Аβ. В деяких способах передбачається введення 10 пацієнту ефективної дози поліпептиду, який містить N-кінцевий сегмент, принаймні, із залишків 1-5 пептиду Аβ, де перший залишок пептиду Аβ є N-кінцевим залишком поліпептиду, а поліпептид не має С-кінцевого сегмента Аβ. В деяких способах застосовується введення пацієнту ефективної дози поліпептиду, що містить N-кінцевий сегмент пептиду Аβ, де цей сегмент починається на залишку 1-3 Аβ і закінчується на залишках 7-11 Аβ. В деяких способах передбачається введення пацієнту ефективної дози агента, що викликає імуногенну реакцію на N-кінцевий сегмент пептиду Аβ, де цей сегмент починається на залишку 1-3 Аβ і закінчується на залишках 7-11 Аβ, не спричиняючи імуногенну реакцію на епітоп у межах залишків 12-43 пептиду Αβ43. У деяких з вищезазначених способів Nкінцевий сегмент пептиду Аβ зв'язується на його С-кінці з гетерологічним поліпептидом. У деяких з вищезазначених способів Ν-кінцевий сегмент пептиду Аβ зв'язується на його N-кінці з гетерологічним поліпептидом. У деяких з вищезазначених способів N-кінцевий сегмент пептиду Аβ зв'язується на його Ν- і С-кінцях з першим і другим гетерологічними поліпептидами. У деяких з вищезазначених способів N-кінцевий сегмент пептиду Аβ зв'язується на його N-кінці з гетерологічним поліпептидом, а на його С-кінці принаймні з однією додатковою копією N-кінцевого сегмента. У деяких з вищезазначених способів гетерологічний поліпептид, а отже і В-клітина, реагують на N-кінцевий сегмент. У деяких з вищезазначених способів поліпептид містить також, принаймні, одну додаткову копію Nкінцевого сегмента. У деяких з вищезазначених способів поліпептид містить від N-кінця до С-кінця N-кінцевий сегмент пептиду Аβ, численні додаткові копії N-кінцевого сегмента і гетерологічний амінокислотний сегмент. У деяких з вищезазначених способів N-кінцевий сегмент складається із Аβ 1-7. У деяких з вищезазначених способів N-кінцевий сегмент складається із Аβ 3-7. У деяких способах згаданий фрагмент не містить, принаймні, 5 С-кінцевих амінокислот в Αβ43. У деяких способах згаданий фрагмент містить до 10 суміжних амінокислот із Аβ. Фрагменти зазвичай вводяться пацієнту у кількості більше 10 мікрограмів на дозу. У деяких способах фрагмент уводять з ад'ювантом, що підсилює імунну реакцію на пептид Аβ. Ад'ювант і фрагмент можуть уводитися у будь-якому порядку або разом один з одним у формі композиції. У якості ад'юванту можуть застосовуватися, наприклад, гідроксид алюмінію, фосфа т алюмінію, MPL™, QS-21 (Stimulon™) або неповний ад'ювант Фрейнда. Винаходом пропонуються також фармацевтичні композиції', що складаються із фрагментів пептиду Аβ або інших а гентів, які викликають імуногенну реакцію на такі самі епітопи Аβ, як описано вище, і ад'юванту. Винаходом пропонуються також фармацевтичні композиції, що містять будь-яке з вищеописаних антитіл і фармацевтично прийнятий носій. 11 81215 В іншому своєму аспекті даний винахід пропонує способи скринінгу антитіла за його активністю у лікуванні хвороби, пов'язаної з відкладеннями пептиду Αβ в мозку пацієнта (наприклад, хвороби Альцгеймера). Такі способи передбачають приведення в контакт антитіла з поліпептидом, що містить, принаймні, п'ять суміжних амінокислот N-кінцевого сегмента пептиду Αβ, починаючи із залишку в межах від 1 до 3 пептиду Αβ, де поліпептид не містить Скінцевого сегмента пептиду Αβ. Після цього визначають, чи зв'язується антитіло специфічно з поліпептидом, причому специфічне зв'язування є показником того, що дане антитіло є активним у лікуванні даної хвороби. В іншому своєму аспекті даний винахід пропонує способи скринінгу антитіла за його активністю у видаленні зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу. Такі способи передбачають комбінування зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу з антитілом і фагоцитами, що несуть Fc-рецептори у певному середовищі. При цьому ведуть моніторинг кількості зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу, що залишається в цьому середовищі. Зменшення кількості зв'язаного з антигеном біологічного матеріалу є показником того, що дане антитіло здатне видаляти зв'язаний з антигеном біологічний матеріал. Антиген може постачатися у формі зразка тканини або в ізольованій формі. Наприклад, антиген може постачатися у формі зразка тканини із мозку пацієнта, що старждає на хворобу Альцгеймера, або ссавця з патологією Альцгеймера. До інших зразків тканин, по відношенню до яких антитіла можуть бути тестовані на їхню очищувальну активність, належать зразки ракових тканин, зразки вірусінфікованих тканин, зразки тканин, що містять клітини зони запалення, культури неракових аномальних клітин або зразки тканини, що містять аномальну зовнішньоклітинну матрицю. Ще в одному своєму аспекті даний винахід пропонує способи виявлення у пацієнта амілоїдних відкладень. Такі способи передбачають уведення пацієнту антитіла, що специфічно зв'язується з епітопом на проміжку амінокислот 1-10 пептиду Αβ, і виявлення наявності цього антитіла в мозку пацієнта. В деяких способах дане антитіло зв'язується з епітопом в межах залишків 4-10 пептиду Αβ. В деяких способах антитіло мітять парамагнітною міткою і виявляють його за допомогою ядерномагнітної резонансної томографії. Винаходом також пропонуються діагностичні набори, підхожі для застосування у вищезазначених способах. В таю набори входять антитіло, що специфічно зв'язується з епітопом в межах залишків 1-10 пептиду Αβ. Деякі набори містять інформаційні матеріали з інструкціями щодо використання антитіла в in vivo діагностиці або моніторингу хвороби Альцгеймера. Фіг.1. Титр антитіл після ін'єкції Αβ1-42 трансгенній миші. Фіг.2. Амілоїдне навантаження в гіпокампі. Виражена у відсотках частина площі ділянки 12 гіпокампу, зайнята амілоїдними бляшками і визначена за взаємодією з Αβ-специфічним моноклональним антитілом 3D6 шляхом комп'ютерного кількісного аналізу зображень зрізів мозку в місцях імунних реакцій. Величини, отримані від кожної з піддослідних мишей, показані по групах обробки. Горизонтальна лінія в кожній із груп відповідає середній величині розподілу. Фіг.3. Нейритна дистрофія в гіпокампі. Виражена у відсотках частина площі ділянки гіпокампу, зайнята дистрофічними нейритами і визначена за Їхньою реакцією на людське АРРспецифічне моноклональне 8Е5 шляхом кількісного комп'ютерного аналізу зображень зрізів мозку в місцях імунних реакцій. Величини, одержані від кожної з піддослідних мишей подані по групах, одна з яких була оброблена AN 1792, а інша являла собою контрольну фуп у, оброблену фізіологічним розчином PBS. Горизонтальна лінія в кожній із груп відповідає середній величині розподілу. Фіг.4. Астроцитоз у ретроспленіальному кортикальному шарі. Виражена у відсотках частина площі кортикальної ділянки, зайнята астроцитами з позитивною реакцією на гліальний фібрилярний кислотний білок (GFAP: glial fibrillary acidic protein) і визначена шляхом кількісного комп'ютерного аналізу зображень зрізів мозку в місцях імунних реакцій. Величини, одержані від кожної піддослідної миші, показані по групах обробки, а середні величини в кожній із фуп позначені горизонтальними лініями. Фіг.5. Середні геометричні титрів антитіл проти Αβ1-42 після імунізації низкою із восьми доз AN 1792 у кількостях 0,14, 0,4,1,2, 3,7, 11, 33, 100 або 300мкг. Фіг.6. Кінетика реакції антитіла на імунізацію AN 1792. Титри виражені через середні геометричні величини по шести тваринах в кожній групі. Фіг.7. Кількісний аналіз зображень кортикального амілоїдного навантаження у мишей, оброблених PBS і AN 1792. Фіг.8. Кількісний аналіз зображень нейритного бляшкового навантаження у мишей, оброблених PBS і AN1792. Фіг.9. Кількісний аналіз зображень частини (у відсотках) ретроспленіального кортикального шару, зайнятої астроцитозом у мишей, оброблених PBS і AN1792. Фіг.10. Аналіз проліферації лімфоцитів в клітинах селезінки тварин, оброблених AN 1792 (верхній графік) і оброблених PBS (нижній графік). Фіг.11. Загальні рівні Αβ в кортикальному шарі. Діаграма розсіяння індивідуальних профілів Αβ у мишей, імунізованих Αβ або похідними АРР у комбінації з ад'ювантом Фрейнда. Фіг.12. Амілоїдне навантаження в кортикальному шарі, визначене шляхом кількісного аналізу зображень зрізів мозку в місцях імунних реакцій у мишей, імунізованих Αβпептидними кон'югатами Ар1-5, Ар1-12 і Αβ 13-28; фупи тварин, оброблених Αβ-афвгатами ΑΝ1792 13 81215 (Αβ1-42) і ΑΝ1528 (Αβ1-40) повної довжини, і контрольній групі тварин, оброблених PBS. Фіг.13. Середні геометричні титрів Αβспецифічного антитіла в групах мишей, імунізованих Αβ або похідними АРР у комбінації з ад'ювантом Фрейнда. Фіг.14. Середні геометричні титрів Αβспецифічного антитіла в групах морських свинок, імунізованих AN 1792 або його пальмітоїльованою похідною в комбінації з різноманітними ад'ювантами. Фіг.15 (А-Е). Рівні Αβ в кортикальному шарі 12місячних мишей PDAPP, оброблених AN 1792 або AN1528 в комбінації з різноманітними ад'ювантами. Фіг.16. Середній титр мишей, оброблених поліклональним антитілом проти Αβ. Фіг.17. Середній титр мишей, оброблених моноклональним антитілом 10D5 проти Αβ. Фіг.18. Середній титр мишей, оброблених моноклональним антитілом 2F12 проти Αβ. Фіг.19. Епітопна карта: рестриктована Nкінцева імунна відповідь. Сироватка 175-го дня від мавп Cynomolgus була піддана твердофазному імуноферментному аналізу (ELISA) у порівнянні зі серією 10-мерних пептидів (SEQ. ID No. 1-41), що перекриваються і охоплюють повну послідовність AN1792. Тварина за номером F10920M показала типову N-кінцеву рестриктовану відповідь на пептид DAEFRHDSGY (SEQ. ID No. 9), що охоплює амінокислоти 1-10 пептиду AN 1792, використовуваного у якості імунізаційного антигена. Фіг.20. Епітопна карта: нерестриктована Nкінцева відповідь. Сироватка 175-го дня від мавп Cynomolgus була піддана аналізу ELISA у порівнянні зі серією 10-мерних пептидів (SEQ. ID No. 1-41), що перекриваються і охоплюють повну послідовність AN1792. Тварина за номером F10975F показала типову нерестриктовану Nкінцеву відповідь. Реактивність спостерігається проти двох N-кінцевих і одного С-кінцевого пептидів до пептиду DAEFRHDSGY (SEQ. ID No. 9), що охоплює амінокислоти 1-10 пептиду AN1792. Термінологія Термін «суттєва ідентичність» означає, що дві пептидні послідовності, піддані оптимальному вирівнюванню за допомогою, наприклад, програми GAP або BESTFIT, які в якості параметра за умовчуванням використовують вагові коефіцієнти пробілів, мають принаймні 65% ідентичність за послідовністю, у кращому варіанті принаймні 80% або 90% індентичність, а у ще кращому варіанті принаймні 95% (наприклад 99% і більше) ідентичність. Бажано, щоб неідентичні положення залишків розрізнювались консервативними заміщеннями амінокислот. При порівнянні послідовностей, як правило, одна послідовність приймається за еталонну, і з нею порівнюються послідовності, що аналізуються. При застосуванні алгоритму порівняння послідовностей порівнювана й еталонна послідовності вводяться в комп'ютер і, якщо необхідно, задаються координати 14 послідовностей і параметри програми алгоритму послідовностей. Після цього алгоритм порівняння послідовностей обчислює відсоткову ідентичність порювнюваних послідовностей відносно еталонної послідовності на базі заданих параметрів програми. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології [Smith & Waterman, Ad v. Appl. Math. 2:482 (1981)], алгоритму гомологічного порівнювального аналізу [Needleman & Wunsch, J. Моl. BioL 48:443 (1970)], методу дослідження подібності [Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)], комп'ютеризованого здійснення цих алгоритмів GAP, BESTFJT, FASTA і TFASTA у [Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl], - а також візуального аналізу [Ausubel et aL, вище]. Одним з прикладів алгоритмів, підходящих для визначення відсоткової ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, є алгоритм BLAST, описаний в роботі [Altschul etaL, J. Моl. Biol. 215:403-410 (1990)]. Програмне забезпечення для BLAST-аналізів можна придбати в Національному інформаційному центрі з біотехнології [National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.govO]. У порівнювальному аналізі послідовностей, як правило, можуть використовува тися параметри програми за умовчуванням, хоч не виключається також застосування параметрів, підібраних для конкретного випадку. Для амінокислотних послідовностей програма BLASTP використовує за умовчуванням довжину слова (W) 3, очікування (Е) 10 і під рахункову матрицю BLOSUM62, див. [Henikoff & Henikoff, Рroc. Natl. Acad. Sci. USA 89,10915 (1989)]. У розрізнюванні консервативних і неконсервативних амінокислотних заміщень амінокислоти поділяються на такі групи: Група І (гідрофобні бічні ланцюги) - норлейцин, met, ala, val, leu, Не; Група II (нейтральні гідрофільні бічні ланцюги) - cys, ser, thr; Група III (кислотні бічні ланцюги) - asp, glu; Група IV (основні бічні ланцюги) - asn, gin, his, lys, arg; Група V (залишки, що впливають на орієнтацію ланцюгів) - gly, pro; і Група VI (ароматичні бічні ланцюги) - trp, tyr, phe. До консервативних належать заміщення між амінокислотами одного класу. Неконсервативні заміщення передбачають заміну члена одного з цих класів на член іншого класу. Терапевтичні агенти за даним винаходом у загальному випадку практично не містять небажаних забруднень. Це означає, що чистота того чи іншого агента становить принаймні близько 50% (мас), а також практично не містить білків і забруднень, що взаємодіють. В деяких випадках ці агенти мають чистоту принаймні 80% (мас), а у кращих варіантах - принаймні 90% (мас.) або 95% (мас.)· Але звичайна технологія очищування білків дозволяє одержувати гомогенні пептиди чистотою принаймні 99% (мас). Специфічне зв'язування між двома матеріалами означає спорідненість між ними на 15 81215 рівні 10е, 107,108,109 М-1 або 1010 М-1 . Кращими є рівні спорідненості, більші ніж 108 М-1. Терміном «антитіло» або «імуноглобулін» охоплюються інтактні антитіла та їхні зв'язувальні фрагменти. Фрагменти, як правило, конкурують з інтактним антитілом, із якого вони виведені, за специфічне зв'язування з фрагментом антигена, включаючи відокремлені важкі ланцюги, легкі ланцюги, Fab, Fab' F(ab')2, Fabc i Fv. Фрагменти одержують за методами рекомбінантних ДНК або шляхом ферментативного чи хімічного розділяння інтактних імуноглобулінів. Термін «антитіло» включає у себе також один або більше ланцюгів імуноглобуліну, що є хімічно кон'югованими з білками, злитими з іншими білками, або вони експресуються як ці білки. Термін «антитіло» включає у себе також біспецифічне антитіло. Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гібридне антитіло, яке має дві різні пари важких/легких ланцюгів і два різні сайти зв'язування. Біспецифічні антитіла можна одержувати у різноманітні способи, включаючи злиття гібридом або зв'язування Fab' фрагментів, див., наприклад, [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et at., J. Immunol. 148,1547-1553 (1992)]. Найменування APP695, APP 751 і АРР 770 належать поліпептидам, що кодують людський ген АРР, довжиною відповідно 695, 751 і 770 амінокислотних залишків [Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al.. Nature 331, 525 (1988); Kitaguchi et al., Nature 331,530 (1988)]. Амінокислоти в амілоїд ному прекурсорному білку (АРР) людини позначені номерами відповідно до послідовності ізоформи АРР770. Назви Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 і Αβ43 стосуються пептиду Αβ, що містить амінокислотні залишки 1-39, 1-40, 1-41, 142 і 1-43. Термін «антиген» стосується речовини, з якою специфічно зв'язується антитіло. Термін «епітоп» або «антигенна детермінанта» стосується сайта в антигені, на який реагують В- і/або Т-клітини. В-клітинні епітопи можуть утворюватися як зі суміжних, так і з несуміжних амінокислот, суміщених третинною укладкою білка. Епітопи, утворені зі суміжних амінокислот, як правило, витримують дію розчинників, що денатур ують, у той час як епітопи, утворені третинною складчатістю, як правило, втрачаються при оброблянні такими розчинниками. Епітоп, як правило, містить принаймні 3, а частіше принаймні 5, 8 або 10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Для визначення просторової конформації епітопів застосовуються методи, наприклад, рентгенівської кристалографії і двомірного ядерного магнітного резонансу, див., наприклад, [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]. Антитіла, що розпізнають один і тий самий епітоп, можуть бути ідентифіковані за допомогою простого імуноаналізу, що показує здатність одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню. Т-клітини розпізнають безперервні епітопи довжиною приблизно 9 16 амінокислот у випадку клітин CD8, або приблизно 13-15 амінокислот у випадку клітин CD4. Т-клітини, що розпізнають даний епітоп, можуть бути ідентифіковані за допомогою аналізу in vitro, що дозволяє вимірювати антиген-залежну проліферацію згідно з визначенням шляхом включення 3Н-тимідину примованими Т-клітинами [Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)], антиген-залежним кілінгом (Т-Лімфоцитотоксичний тест [Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910]) або секрецією цитокінів. Терміном «імунологічна» або «імунна» реакція зветься корисна гуморальна (опосередкована антитілом) і/або клітинна (опосередкована антиген-специфічними Т-клітинами або продуктами їхньої секреції) реакція, спрямована проти амілоїдного пептиду у пацієнта. Така реакція може бути активною, викликаною введенням імуногена, або пасивною, викликаною введенням антитіла або примованих Т-клітин. Клітинна імунна реакція виказує себе поданням антигенних детермінант поліпептидів у сполученні з молекулами МНС (головного комплексу гістосумісності) Класу І або Класу II в активації антиген-специфічних Т-клітин-хелперів CD4+ і/або цитотоксичних Т-клітин CD8 +. Ця реакція може також викликати активацію моноцитів, макрофагів, NK-клітин, базофілів, дендритних клітин, астроцитів, мікрогліальних клітин, еозинофілів та інших компонентів уродженого імунітету. Наявність клітинно-опосередкованої імунологічної реакції можна визначити аналізом проліферації (СD4+-Тклітини) або CTL (цитотоксичні Т-лімфоцити) аналізом, див. [Burke, вище; Tigges, вище]. Відповідні вклади гуморальної і клітинної реакцій у захисний або терапевтичний ефект імуногена можуть розрізнюватися шляхом окремого виділення антитіл і Т-клітин у імунізованої сингенної тварини і вимірювання захисного або терапевтичного ефекта у іншого ссавця. «Імуногенний агент» або «імуноген» здатний викликати імунологічну реакцію на себе при введенні його ссавцю, якщо потрібно, разом з ад'ювантом. Термін «відкритий полінуклеотид» стосується полінуклеотида без колоїдальних матеріалів. Відкриті полінуклеотиди іноді клонуються в плазмідному векторі. Терміном «ад'ювант» зветься сполука, яка при введенні її разом з антигеном підсилює імунну реакцію на цей антиген, але при введенні її одної, вона не генерує імунну реакцію на цей антиген. Ад'юванти можуть підсилювати імунну реакцію декількома механізмами, включаючи рекрутінг лімфоцитів, стимуляцію В- і/або Т-клітин і стимуляцію макрофагів. Терміном «пацієнт» звуться люди та інші ссавці, що отримують профілактичну або терапевтичну допомогу. Дезагрегованим або мономерним Αβ зветься розчинна мономерна пептидна одиниця Αβ. Одним зі способів приготування мономерного Αβ є розчинення ліофілізованого пептиду в чистому DMSO з опромінюванням ультразвуком. Отримуваний в результаті розчин піддають 17 81215 центрифугуванню для видалення нерозчинних часток. Агрегований Αβ являє собою суміш олігомерів, в котрій мономерні одиниці утримуються разом нековалентними зв'язками. Конкуренція між антитілами визначається шляхом аналізу, в якому випробуваний імуноглобулін інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла зі загальним антигеном, яким є Αβ. Відомо багато різноманітних методів аналізу зв'язування, наприклад, твердофазний прямий або непрямий радіоімунний аналіз (RIA), твердофазний прямий або непрямий ферментний імуноаналіз (ЕІА), конкурентний сендвіч-аналіз, див. [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)], твердофазний прямий біотин-авідиновий ЕІА аналіз [Kirkland et al., J. Immunol. 137:36143619 (1986)], твердофазний прямий аналіз із міченням, твердофазний прямий сендвіч-аналіз із міченням [Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)], твердофазний прямий RIA аналіз із міченням 1-125 [Morel et al., Molec. Immunol. 25(l):7-15 (1988)], твердофазний прямий біотинавідиновий ЕІА аналіз [Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)] і прямий радіоімуноаналіз із міченням [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)]. В такому аналізі, як правило, застосовується очищений антиген, зв'язаний з твердою поверхнею або клітинами, які несуть немічений імуноглобулін, що аналізується, і мічений еталонний імуноглобулін. Конкурентне інгібування вимірюють шляхом визначення кількості мітки, зв'язаною з твердою поверхнею або клітинами при наявності імуноглобуліну, що аналізується. Зазвичай, аналізований імуноглобулін знаходиться у надмірній кількості. Антитіла, іденти фіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають до свого числа антитіла, котрі зв'язуються з тим самим епітопом, що й еталонне антитіло, і антитіла, котрі зв'язуються з сусіднім епітопом, достатньо близьким до епітопу, зв'язаного еталонним антитілом через виникнення стеричної перешкоди. Зазвичай, коли конкуруюче антитіло знаходиться у надмірній кількості, воно інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла зі звичайним антигеном, принаймні, на 50 або 75%. Композиції або способи, які "включають у себе" один або більше вищезазначених елементів, можуть містити також інші елементи, які тут не згадувалися. Наприклад, композиція, що містить пептид Αβ, охоплює як ізольований пептид Αβ, так і пептид Αβ, котрий є компонентом більшої поліпептидної послідовності. Докладний опис винаходу 1. Загальні відомості Наявність відкладень пептиду Αβ, агрегованого з нерозчинною масою в мозку пацієнта, є характерною ознакою декількох амілоїдогенних хвороб або станів. До таких станів належать хвороба Альцгеймера, синдром Дауна) когнітивний розлад. Останній є симптомом хвороби Альцгеймера і синдрому Дауна, але може спостерігатися також без інших характерних ознак 18 цих хвороб. Наприклад, м'я кий когнітивний розлад або пов'язана з віком втрата пам'яті спостерігається у деяких пацієнтів, у яких хвороба Альцгеймера ще не розвинулася або не буде розвинута і в майбутньому. М'яку форму когнітивного розладу можна визначити за схемою Державних психологічних міні-обстежень (MiniMental State Exam) згідно з конвенцією. Для таких хвороб характерною є наявність агрегатів Αβ, які мають р-складчасту шарува ту стр уктуру і забарвлюються конго-червоним. Основоположний підхід У профілактиці або лікуванні хвороби Альцгеймера або інших амілоїдогенних хвороб шляхом генерування імуногенної реакції на компонент амілоїдного відкладення у пацієнта описаний у [WO 99/27944] (включеному тут шляхом посилання). Дана заявка повторює і підтверджує ефективність цього підходу, але при цьому вона спрямована, головним чином, на поліпшення застосовуваних при цьому реагентів і способів. Відправним пунктом для цих поліпшень стали проведені авторами дослідження з локалізації кращих епітопів в Αβ, проти якого повинна спрямовуватися імуногенна реакція. Ідентифікація кращих епітопів в Αβ привела авторів до речовин (агентів) і способів, що підвищують ефективність, зменшують можливість побічних ефектів та полегшують виго товлення, складання препаратів і іх уведення. II. Терапевтичні агенти Імуногенна реакція може бути активною, як у тому випадку, коли імуноген уводиться для індукування антитіл, реактивних щодо Αβ у пацієнта, або пасивною, як у тому випадку, коли уведене антитіло саме зв'язується з Αβ у пацієнта. 1. Агенти, що викликають активну імунну реакцію Терапевтичні агенти викликають імунну реакцію, специфічним чином скеровану на певні епітопи в пептидах Αβ. Кращими агентами є сам пептид Αβ і його сегменти. Використовуватися можуть також різноманітні варіанти таких сегментів, аналоги і міметики природного пептиду Αβ, що індукують антитіла до кращих епітопів пептиду Αβ або вступають з ними у перехресні реакції Пептид Αβ, відомий також як β-амілоїдний пептид або пептид А4 [Патент США №4,666,829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)], є пептидом із 39-43 амінокислот, який являє собою головний компонент бляшок, характерних для хвороби Альцгеймера. Пептид Αβ продукується шляхом процесінгу крупнішого білка АРР двома ферментами, що звуться β- і gсекретазами [Hardy, TINS 20, 154 (1997)]. Відомі мутації в АРР, пов'язані з хворобою Альцгеймера, виникають поблизу сайта β- або g-секретази, або в самому Αβ. Наприклад, положення 717 є найближчим до сайта розщеплення APP gсекретазою в процессуванні АРР на Αβ, а положення 670/671 є найближчими до сайта розщеплення β-секретазою. Вважається, що ці мутації зумовлюють хворобу Альцгеймера через взаємодію з реакціями розщеплення, внаслідок чого Αβ утворюється таким чином, що кількість 42 19 81215 43 амінокислотної форми продукованого Αβ збільшується. Пептид Αβ має ту нетривіальну властивість, що він може фіксувати й активувати як класичні, так і додаткові каскади комплементу. Зокрема, він зв'язується з Clq і, у кінцевому рахунку, з С3bі. Це об'єднання полегшує зв'язування з макрофагами, призводячи до активації В-клітин. Крім того, С3bі розпадаються далі і зв'язуються з CR2 на Вклітинах залежним від Т-клітин чином, приводячи до 10000-кратного збільшення активації цих клітин. Цей механізм зумовлює генерацію Αβ в імунній реакції у кількості, більшій, ніж інших атигенів. Αβ має декілька форм природного утворення. Людські форми Αβ мають назви Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 і Αβ43. Послідовності цих пептидів і їх співвідношення з АРР-попередником показані на Фіг.1 в роботі [Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997)]. Наприклад, Αβ42 має таку послідовність: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-GluVal-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Aia-Glu-AspVal-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-ValGly-Gl y-Val-Val-lle-Ala-OH (SEQ. ID No. 42). Пептиди Αβ41, Αβ40 і Αβ39 відрізняються від Αβ42 пропуском Ala, Ala-He і Ala-lle-Val відповідно від С-кінця. Αβ43 відрізняється від Αβ42 наявністю треонінового залишку на С-кінці. Імуногенні фрагменти Αβ мають переваги над інтактною молекулою, застосовуваною у відомих способах, з декількох причин. Першою з них є те, що оскільки корисну для лікування хвороби Альцгеймера імуногенну реакцію в Αβ індукують лише певні епітопи, така сама доза (в одиницях маси) фрагмента, що містить такі ж епітопи, дає більшу молярну концентрацію корисних імуногенних епітопів, ніж доза інтактного Αβ. Другою причиною є те, що певні імуногенні фрагменти Αβ генерують імуногенну реакцію проти амілоїдних відкладень, не генеруючи при цьому значну імуногенну реакцію проти білка АРР, із якого виведений цей Αβ. Третя причина полягає в тому, що фрагменти Αβ є простішими у виготовленні, ніж інтактний Αβ завдяки Їхньому меншому розміру. Четвертою причиною є те, що фрагменти Αβ не агрегуються так, як інтактний Αβ, що спрощує готування фармацевтичних композицій і їх введення. Деякі імуногенні фрагменти Αβ мають послідовність, принаймні, із 2, 3, 5, 6, 10 або 20 суміжних амінокислот із природного пептиду. Деякі імуногенні фрагменти мають не більше 10, 9, 8, 7, 5 або 3 суміжні залишки із Αβ. Кращими є фрагменти від N-кінцевої половини Αβ. До кращих імуногенних фрагментів належать Αβ1-5, 1-6,1-7, 1-10, 3-7,1-3 і 1-4. Наприклад, позначення Αβ 1-5 належить фрагменту, що містить залишки 1-5 пептиду Αβ і не містить інших його залишків. Особливо кращими є фрагменти, що починаються на залишках 1-3 Αβ і закінчуються на залишках 711 Αβ. Використовуватися також може фрагмент Αβ1-12, але він є менш прийнятним. В деяких способах N-кінцевим є цей фрагмент, а не Αβ1-10. Іншими менш прийнятними фрагментами є Αβ1328, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 і 35-42. Ці фрагменти 20 перед тим, як їх використовувати , потребують відбирання (скринінгу) за активністю їх у видаленні або запобіганні виникненню амілоїдних відкладень, як описано нижче в Прикладах. В деяких способах використовуються фрагменти, в яких бракує принаймні 1, а іноді принаймні 5 або 10 С-кінцевих амінокислот, наявних у формах Αβ, утворених природним шляхом. Наприклад, фрагмент в якому не вистачає 5 амінокислот від С-кінця Αβ43, містить перші 38 амінокислот від Nкінця Αβ. Для індукування імуногенної реакції можуть використовуватися також інші компоненти амілоїдних бляшок, наприклад, синуклеїн і його епітопні фрагменти. Якщо не зазначено іншого, то позначення Αβ охоплює природні людські амінокислотні послідовності, згадані вище, а також їхні аналоги, включаючи алельні варіанти, різновиди й індуковані варіанти. Аналоги, як правило, відрізняються від пептидів, утворених природним шляхом, на одне, два або декілька положень часто внаслідок консервативних заміщень. Аналоги виказують, як правило 80% або 90% ідентичність послідовностей з природними пептидами. Деякі аналоги також містять ненатуральні амінокислоти або модифікації Ν- або С-кінцевих амінокислот в одному, дво х чи декількох положеннях. Наприклад, природний залишок аспартанової кислоти в положенні 1 і/або 7 пептиду Αβ може бути заміщений ізоаспартановою кислотою. У якості прикладів ненатуральних амінокислот можна назвати D-амінокислоти, а, а-двозаміщені амінокислоти, N-алкільні амінокислоти, молочну кислоту, 4-гідроксипролін, γ-карбоксиглютамат, εΝ,Ν,Ν-триметиллізин, ε-Ν-ацетиллізин, Офосфосерин, N-ацетилсерин, N-формілметіонін, 3метилгістидин, 5-гідроксилізин, v-Ν-метиларгінін та ізослартанову кислоту. Фрагменти та їхні аналоги можуть відбиратися за їхньою профілактичною або терапевтичною ефективністю в трансгенних моделях тварин у порівнянні з необробленими чи обробленими плацебо контрольними особинами, як описано нижче. Αβ, його фрагменти й аналоги можуть одержуватися за методом твердофазного синтезу пептидів або рекомбінантної експресії, або ж із природних джерел. У продажу є автоматичні синтезатори пептидів виробництва численних фірм, наприклад, фірми Applied Biosystems, Foster City, California. Рекомбінантна експресія може проводитися в бактеріях, наприклад, Е. Соlі, дріжджах, клітинах комах або ссавців. Відповідні методики рекомбінантної експресії описані в [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2d ed., 1989)]. У продажу є також деякі форми пептиду Αβ (наприклад, фірм American Peptides Company, Inc., Sunnyvale, CA and California Peptide Research, Inc. Napa, CA). В число терапевтичних агентів також входять довші поліпептиди, які містять, наприклад, активний фрагмент із пептиду Αβ разом з іншими амінокислотами. Наприклад, до кращих агентів належать злиті білки, що містять сегмент Αβ, злитий з гетерогенною амінокислотною 21 81215 послідовністю, що індукує відповідь Т-клітинихелпера на гетерологічну амінокислотну послідовність і тим самим відповідь В-клітини на сегмент Αβ. Такі поліпептиди можуть відбиратися за їхньою профілактичною або терапевтичною ефективністю на піддослідних тваринах у порівнянні з необробленими або обробленими плацебо контрольними особинами, як описано нижче. Пептид Αβ, його аналог, активний фрагмент або інший поліпептид можуть уводитися в об'єднаній або мультимерній формі, чи в дисоційованій формі. В число терапевтичних агентів також входять мультимери мономерних імуногенних агентів. В інших варіантах імуногенний пептид, наприклад, фрагмент Αβ може бути поданий вірусом або бактерією як частиною імуногенної композиції. При цьому в геном або епісому вірусу чи бактерії може вбудовуватися нуклеїнова кислота, що кодує імуногенний пептид. Якщо потрібно, то нуклеїнова кислота вбудовується таким чином, щоб імуногенний пептид експресувався як секретований білок або злитий білок зовнішньоповерхневим білком вірусу або трансмембранним білком бактерії так, щоб відображався цей пептид. Віруси або бактерії, застосовувані в таких способах, повинні бути непатогенними або пригніченими. До числа підходящих вірусів входять аденовіруси, HSV (вірус простого герпесу), вірус збудника венесуельського енцефаліту та інші α-віруси, везикулярний вірус стоматиту та інші рабдовіруси, віруси коров'ячої віспи і пташиної віспи. До числа підходящих бактерій входять сальмонела і бацила Шига. Особливо прийнятним є продукт злиття імуногенного пептиду з HBsAg вірусу HBV. Теапевтичними агентами можуть бути також пептиди та інші сполуки, подібність амінокислотних послідовностей яких до Αβ не обов'язково є суттєвою, але які є міметичними з Αβ і індукують подібну йому імунну відповідь. Наприклад, на придатність до застосування можуть відбиратися пептиди і білки, що утворюють β-складчасті шари. Можуть застосовуватися також антиідіотипові антитіла проти моноклональних антитіл до Αβ та інші амілоїдогенні пептиди. Такі анти-И-антитіла імітують антиген і генерують імунну відповідь на нього [Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.), p. 181]. Агенти, що не є пептидами Αβ, повинні індукувати імуногенну реакцію на один і більше бажаних фрагментів Αβ, перелічених вище (наприклад, 1-10, 1-7, 1-3 і 3-7). Краще, якщо такі агенти індукують імуногенну реакцію, яка специфічним чином спрямована на один з цих сегментів і не спрямовується при цьому на інші сегменти Αβ. На придатність до застосування можуть відбиратися також рандомізовані бібліотеки пептидів та інших сполук. Можуть створюватися комбінаторні бібліотеки для багатьох типів сполук, які можуть синтезуватися поступовим чином. В число таких сполук входять поліпептиди, міметики бета-оберту, полісахариди, фосфоліпіди, гормони, простагландини, стероїди, ароматичні сполуки, 22 гетероциклічні сполуки, бензодіазепіни, олігомерні N-заміщені гліцини й олігокарбамати. Великі комбінаторні бібліотеки сполук можуть бути сконструйовані за методом кодованих синтетичних бібліотек (ESL: encoded synthetic libraries), описаним в [Affymax, WO 95/12608; Affymax, WO 93/06121; Columbia University, WO 94/08051; Pharmacopeia, WO 95/35503; Scripps, WO 95/30642], включених тут шля хом посиляння для всіх цілей. Пептидні бібліотеки можуть створюватися також за методами відображення фагів, див., наприклад, [Deviin, WO 91/18980]. Комбінаторні бібліотеки та інші сполуки спочатку відбирають за їхньою спроможністю зв'язуватися з антитілами або лімфоцитами (В чи Т), які є специфічними щодо Αβ або інших амілоїдогенних пептидів. Наприклад, початковому скринінгу можуть піддаватися поліклональні сироватки або моноклональне антитіло до Αβ або його фрагмент. Після цього сполуки можна відбирати за їхнім зв'язуванням зі специфічним епітопом в Αβ (наприклад, 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 і 3-7). Тестування сполук можна проводити за тими ж методиками, що описані для картування специфічностей епітопів антитіл. Сполуки, ідентифіковані шляхом такого скринінгу. після нього піддаються подальшому аналізу на їхню спроможність індукувати антитіла або реактивні лімфоцити до Αβ чи його фрагментів. Наприклад, на мікротитрувальних планшетах, покритих перед тим Αβ або його фрагментом, можна тестува ти численні розчини сироваток,, а стандартний аналіз ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз) можна. застосовувати для тестування антитіл за їхньою реактивністю щодо Αβ або його фрагмента. Після цього сполуки можна тестувати на їхню профілактичну і терапевтичну ефективність на трансгенних піддослідних тваринах, схильних до амілоїдогенних захворювань, як описано нижче в Прикладах. Такими тваринами можуть бути, наприклад, миші з мутацією 717 білка АРР так, як описано в [Games et al., вище], і миші зі шведською мутацією 670/671 АРР, як описано в [McConlogue et al., US 5,612,486 and Hsiao et al., Science 274, 99 (1996); Staufenbiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292 (1997); SturchlerPierrat et al., Pmc. Nad. Acad. Sci. USA 94, 1328713292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1977)]. Така сама методика відбору може застосовуватися і до інших потенційних агентіваналогів Αβ і крупніших пептидів, включаючи фрагменти Αβ, описані вище. 2. Агенти, що індукують пасивну імунну реакцію До терапевтичних агентів згідно з даним винаходом належать також антитіла, що специфічно зв'язуються з Αβ або іншим компонентом амілоїдних бляшок. Такі антитіла можуть бути як моноклональними, так і поліклональними. Деякі з таких антитіл специфічно зв'язуються з агрегованою формою Αβ, не зв'язуючись при цьому з його дисоційованою формою. Деякі антитіла специфічно зв'язуються з дисоційованою формою Αβ і не зв'язуються з його агрегованою формою. Деякі ж антитіла 23 81215 зв'язуються з його як агрегованою, так і дисоційованою формами. Деякі з таких антитіл зв'язуються з утвореною природним шляхом короткою формою Αβ (тобто Αβ39, 40 або 41), не зв'язуючись при цьому з довгою природною формою Αβ (тобто Αβ42 і Αβ43). Деякі антитіла зв'язуються з довгою формою і не зв'язуються з короткою формою Αβ. Деякі антитіла зв'язуються з Αβ, не зв'язуючись при цьому з амілоїдним прекурсорним білком повної довжини. Антитіла, що застосовуються в терапевтичних способах, зазвичай, мають інтактну постійну ділянку або принаймні постійну ділянку, достатню для взаємодії з Fc-рецептором. Кращим тут є людський ізотип lgG1, оскільки він має найвищу спорідненість до людських ізотипів для FcRIрецептора на фагоцитних клітинах. Можуть застосовуватися також біспецифічні Fabфрагменти, в котрих одне плече антитіла має специфічність до Αβ, а інше - до Fc-рецептора. Деякі антитіла зв'язуються з Αβ з афінністю зв'язування, що є більшою або дорівнює 106, 107, 108, 109 або 1010 М-1. Поліклональні сироватки, зазвичай, містять змішані популяції антитіл, що зв'язуються з декількома епітопами по довжині пептиду Αβ. Але поліклональні сироватки можуть бути специфічними до певного сегмента Αβ, наприклад, Αβ1-10. Моноклональні антитіла зв'язуються зі специфічним епітопом в Αβ, який може бути як конформаційним, так і неконформаційним епітопом. Антитіла можуть бути тестовані на їхню профілактичну і терапевтичну ефективність на трансгенних піддослідних тваринах за методиками, описаними в Прикладах нижче. Кращі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом на залишках 1-10 Αβ (де перший N-кінцевий залишок природного Αβ позначений цифрою 1). Деякі кращі моноклональні антитіла зв'язуються з епітопом на ділянці амінокислот 1-5, а деякі - з епітопом на ділянці 5-10. Деякі кращі антитіла зв'язуються з епітопами на ділянках амінокислот 1-3, 1-4, 1-5, 16, 1-7 і 3-7. Деякі кращі антитіла зв'язуються з епітопом, починаючи від залишків 1-3 і закінчуючи на залишках 7-11 пептиду Αβ. До менш прийнятних антитіл належать такі, що зв'язуються з епітопами на ділянках залишків 10-15, 15-20, 2530, 10-20, 20, 30 і 10-25 пептиду Αβ. Пропонується, щоб такі антитіла перед тим, як їх використовува ти, відбиралися за їхньою активністю на піддослідних мишах так, як описано в Прикладах нижче. Наприклад, було знайдено, що деяким антитілам до епітопів на ділянках залишків 10-18, 16-24, 18-21 і 33-42 бракує активності. В деяких способах використовуються численні моноклональні антитіла, котрі специфічно зв'язуються з різними епітопами. Такі антитіла можуть уводитися як послідовно, так і одночасно. Можуть застосовуватися також антитіла до інших амілоїдних компонентів, що не є Αβ. Наприклад, антитіла можуть спрямовуватися на амілоїд, зв'язаний з білковим синуклеїном. Якщо в даному тексті зазначено, що антитіло зв'язується з епітопом в межах специфічних залишків, наприклад, Αβ1-5, то мається на увазі, 24 що це антитіло специфічно зв'язується з поліпептидом, який містить специфічні залишки (тобто у даному прикладі Αβ1-5). При цьому зовсім не обов'язково, щоб антитіло контактувало з кожним залишком в межах Αβ1-5. Не обов'язково також, щоб кожне заміщення або кожна делеція амінокислоти в межах Αβ1-5 суттєво впливала на афінність зв'язування. Специфічність антитіла до епітопу може визначатися, наприклад, шляхом утворення бібліотеки відображення фагів, в котрій різні члени відображують різні послідовності Αβ. Зі створеної бібліотеки відображення фагів відбирають члени, котрі специфічно зв'язуються з даним антитілом при тестуванні. Далі відділяють сімейство послідовностей. Таке сімейство, як правило, містить загальну серцевинну послідовність і бічні послідовності різної довжини в різних членах. Епітоп, зв'язаний з антитілом, визначається найкоротшою серцевинною послідовністю, що виказує специфічне зв'язування з цим антитілом. Антитіла можуть бути також тестовані на епітопну специфічність шляхом конкурентного аналізу за участі антитіла, епітопна специфічність якого вже була визначена. Наприклад, антитіла, що конкурують з антитілом 3D6 за зв'язування з Αβ, зв'язуються з тим самим або подібним 3D6 епітопом, тобто в межах залишків Αβ1-5. Подібним чином антитіла, що конкурують з антитілом 10D5, зв'язуються з тим самим або подібним епітопом, тобто в межах залишків Αβ3-6. Скринінг антитіл за їхньою епітопною специфічністю дозволяє досить точно прогнозувати терапевтичну ефективність. Наприклад, антитіло, визначене як таке, що зв'язується з епітопом у межах залишків 1-7 Αβ, є, очевидно, ефективним у профілактиці і лікуванні хвороби Альцгеймера. Моноклональні або поліклональні антитіла, що специфічно зв'язуються з бажаним сегментом Αβ, не зв'язуючись при цьому з іншими ділянками Αβ, мають цілу низку переваг над моноклональними антитілами, що зв'язуються з іншими ділянками або поліклональними сироватками до інтактного Αβ. По-перше, за однакових масових доз дози антитіл, що специфічно зв'язуються з бажаними сегментами, містять більш високу молярну дозу антитіл, що є ефективними у видаленні амілоїдних бляшок. По-друге, антитіла, що специфічно зв'язуються з бажаними сегментами, можуть індукувати реакцію видалення проти амілоїдних відкладень, не викликаючи при цьому реакції видалення проти інтактного поліпептиду АРР, знижуючи тим самим можливість виникнення побічних ефектів. і. Загальні характеристики імуноглобулінів Відомо, що базова структурна одиниця антитіла містить тетрамер із субодиниць. Кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один «легкий» (приблизно 25 kDa) і один «важкий» (приблизно 50-70 kDa) ланцюги. Аміно-кінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку приблизно від 100 до 110 і більше амінокислот, яка є головною відповідальною за розпізнавання антигенів. Карбокси-кінцева частина 25 81215 кожного ланцюга визначає постійну ділянку, що є головною відповідальною за ефекторну функцію. Легкі ланцюги діляться на капа- і лямбдаланцюги. Важкі ланцюги діляться на гамма-, мю-, альфа-, дельта- і епсілон-ланцюги, визначаючи ізотили антитіл відповідно як IgG, IgM, Ig A, IgD i IgE. В легких і важких ланцюгах варіабельні і постійні ділянки з'єднуються «Ja-ділянкою із приблизно 12 і більше амінокислот, а важкий ланцюг, крім того, містить також «Р»-ділянку із приблизно 10 і більше амінокислот, див. [Fundamental Immunology (Paul, W. ed, 2nd ed. Raven Press, N.Y, 1989), Ch. 7] (включеній тут шляхом посилання в усій її повноті для всіх цілей). Варіабельні ділянки кожної пари із легкого і важкого ланцюгів утворюють сайт зв'язування антитіла. Таким чином, інтактне антитіло має два сайти зв'язування. За винятком біфункціональних або біслецифічних антитіл, ці два сайти зв'язування є однаковими. Всі ланцюги показують однакову загальну структуру із відносно консервативних каркасних ділянок (FR: framework regions), об'єднаних трьома гіперваріабельними ділянками, які звуться також ділянками визначення комплементарності або CDR (complementarity determining гедіопз)-ділянками. CDR-ділянки із двох ланцюгів кожної пари вишиковуються в ряд каркасними ділянками, створюючи можливість зв'язування зі специфічним епітопом. Від N-кінця до С-кінця обидва ланцюги - легкий і важкий містять домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Розподіл амінокислот по цих доменах відповідає визначенням, даним у [Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)] або [Chothia & Lesk, J. Моl. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878883 (1989)]. ii. Продукування антитіл тварин Продукування моноклональних антитіл тварин, наприклад, мишей, морських свинок, приматів, кроликів, щурів, здійснюється, наприклад, шляхом імунізації тварини пептидом Αβ. Можуть застосовуватися також довший поліпептид, що містить Ар або імуногенний фрагмент Αβ, або антиідіотипові антитіла до антитіла проти Αβ, див. [Harlow & Lane, Antibodies. A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)] (включеній тут шляхом посилання для всіх цілей). Такий імуноген може бути отриманий із природного джерела, шляхом пептидного синтезу або рекомбінантної експресії. Уводитися пацієнту імуноген може у злитій формі або у формі кон'югату з носійним білком, як описано нижче. Імуноген можна уводити також разом із ад'ювантом. Застосовува ти можна декілька типів ад'ювантів, як описано нижче. Для імунізації піддослідних тварин кращим є повний ад'ювант Фрейнда, а також, хоча і менш кращим, неповний ад'ювант Фрейнда. Для вироблення поліклональних антитіл, зазвичай, використовуються кропиш або морські свинки. Миші, як правило, використовуються для одержання моноклональних антитіл. Одержані антитіла відбирають за їхнім специфічним 26 зв'язуванням з Ар. У разі потреби антитіла можуть додатково відбиратися за їхнім зв'язуванням зі специфічною ділянкою Αβ. Останній скринінг може бути виконаний визначенням зв'язування антитіла з колекцією делеційних мутантів пептиду Αβ і визначенням того, які делеційні мутанти зв'язуються з антитілом. Зв'язування можна оцінювати, наприклад, за допомогою аналізу за методом вестерн-блотінгу або аналізу ELISA. Найменший фрагмент, що показує специфічне зв'язування з антитілом, визначає епітоп антитіла. Іншим чином епітопну специфічність можна визначати шляхом конкурентного аналізу, в якому випробуване й еталонне антитіла конкурують за зв'язування з Αβ. Якщо між випробуваним і еталонним антитілами відбувається конкуренція, то вони зв'язуються з одним і тим самим епітопом або однаковими епітопами, близькими один до одного настільки, що зв'язування одного антитіла перешкоджає зв'язуванню іншого антитіла. Кращим ізотипом для таких антитіл є мишачий ізотип lgG2a або еквівалентний йому ізотип в інших видах. Мишачий ізотип lgG2a є еквівалентним людському ізотипу IgGl. ііі. Химерні і гуманізовані антитіла Химерні і гуманізовані антитіла мають однакову або подібну специфічність зв'язування як і миша або інше антитіло тварини, що дає вихідний матеріал для конструювання химерного або гуманізованого антитіла. Химерними є такі антитіла, гени легких і важких ланцюгів яких сконструйовані, як правило, за допомогою генної інженерії, із сегментів імуноглобулінового гена від різних видів. Наприклад, варіабельні (V) сегменти генів із моноклонального антитіла миші можуть бути з'єднані з постійними (С) сегментами людини, якими є, наприклад, lgG1 і lgG4. Кращим є людський ізотип IgGl Таким чином, типовим хімерним антитілом є гібридний білок, що складається із V або антиген-зв'язуючого домену із антитіла миші і С або ефекторного домену із антитіла людини. Гуманізовані антитіла мають каркасні залишки варіабельних ділянок практично із антитіла людини (яке зветься акцепторним антитілом) і ділянки, що визначають комплементарність, практично із антитіла миші (яке зветься донорним імуноглобуліном), див. [Queen et al.. Proc. Natl. Acad. Set. USA 86:10029-10033 (1989) and WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101 and Winter, US 5,225,539] (включені тут шля хом посилання в усій їхній повноті для всіх цілей). Постійні ділянки, якщо вони є, також практично повністью або цілком є із імуноглобуліну людини. Варіабельні домени людини, зазвичай, вибирають із людських антитіл, каркасні послідовності яких показують високий ступінь ідентичності з мишачими доменами варіабельних ділянок, із котрих були виведені CDR. Каркасні залишки варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів можуть виводитися із однакових або різних послідовностей антитіла людини. Послідовностями антитіла людини можуть бути послідовності антитіл людини, що виникають природним шляхом, або консенсусні 27 81215 послідовності декількох антитіл людини, див. [Carter et al., WO 92/22653]. Деякі амінокислоти серед каркасних залишків варіабельних ділянок людини відбирають за заміщенням, виходячи із їхнього можливого впливу на конформацію CDR і/або зв'язування з антигеном. Дослідження цих можливих форм впливу проводять шляхом моделювання, вивчення характеристик амінокислот на особливих ділянках або емпіричних спостережень ефектів заміщення або мутагенезу конкретних амінокислот. Наприклад, у тому випадку, коли амінокислота каркасного залишку варіабельної ділянки миші відрізняється від амінокислоти відібраного каркасного залишку варіабельної ділянки людини, каркасна амінокислота людини, зазвичай, повинна заміщува тися еквівалентною каркасною амінокислотою із антитіла миші, якщо очікується, що ця амінокислота: (1) встановлює з антигеном прямий нековалентний зв'язок; (2) прилягає до CDR-ділянки; (3) іншим чином взаємодіє з CDR-ділянкою (наприклад, знаходиться від CDR-ділянки на відстані приблизно 6 ангстремів) або (4) бере участь у VL-VH- взаємодії. Кандидатами на заміщення можуть бути також каркасні амінокислоти людини-акцептора, які є незвичайними для людського імуноглобуліну в даному положенні. Ці амінокислоти можуть заміщува тися амінокислотами із еквівалентного положення донорного антитіла миші або із еквівалентних положень більш типових людських імуноглобулінів. Заміщува тися можуть також каркасні амінокислоти людини-акцептора, які є незвичайними для людського імуноглобуліну в даному положенні. Каркаси варіабельних ділянок гуманізованих імуноглобулінів, зазвичай, виказують 85% ідентичність послідовності з каркасною послідовністю варіабельної ділянки людини або консенсус таких послідовностей. iv. Анти тіла людини Антитіла людини проти Αβ можуть бути одержані у різноманітні способи, описані нижче. Деякі антитіла людини відбирають шляхом проведення експериментів з конкурентного зв'язування або іншим чином за такою самою епітопною специфічністю, що й у конкретного антитіла миші, як це описано в Прикладі XI для мишачих моноклональних антитіл. Людські антитіла можуть відбиратися також за конкретною епітопною специфічністю, використовуючи в якості імуногена лише фрагмент Αβ, і/або піддаючи скринінгу антитіла проти колекції делеційних мутантів Αβ. У кращому варіанті людські антитіла мають lgG1 людини з ізотипною специфічністю. (І) Триома-методологія Базовий підхід і типовий партнер SPAZ-4 у злитті клітин для застосування в цьому способі був описаний в роботах [Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent No. 4,634,664; and Engleman et al., US Patent 4,634,666] (включених тут шля хом посилання в усій їхній повноті для всіх цілей). Отримувані в цей спосіб клітинні лінії, що продук ують антитіла, 28 звуться триомами, оскільки вони походять від трьох клітин - двох людських і однієї мишачої. Згідно з цим способом спочатку лінію мієломи миші зливають з людським β-лімфоцитом, одержуючи ксеногенну гібридну клітину, що не продукує антитіла, якою є, наприклад, клітинна лінія SPAZ-4, описана в [Oestberg et al., вище]. Після цього ксеногенну клітину зливають з імунізованим людським β-лімфоцитом, отримуючи триома-клітинну лінію, що продукує антитіла. Було встановлено, що триоми продукують більш стабільні антитіла, ніж звичайні гібридоми, приготовані із людських клітин. Імунізовані β-лімфоцити отримуються з крові, селезінки, лімфовузлів і кісткового мозку людинидонора. Якщо потрібні антитіла проти специфічного антигена або епітопу, то для імунізації бажано застосовувати цей антинген або його епітоп. Імунізацію можна здійснювати як in vi vo, та і in vitro. Для імунізації in vivo В-клітини, зазвичай, виділяють у людини, імунізованої Ар, його фрагментом, крупнішим поліпептидом, що містить Αβ або його фрагмент, чи антиідіотиповим антитілом до антитіла проти Αβ. В деяких способах В-клітини виділяють у того самого пацієнта, якого лікують шляхом уведення антитіла. У випадку імунізації in vitro В-лімфоцити, як правило, обробляють антигеном протягом 7-14 днів у такому середовищі, як RPMI-1640, див. [Engleman, вище], доповненому 10% людської плазми. Імунізовані В-лімфоцити зливають із ксеногенною гібридною клітиною, наприклад, SPAZ-4 за допомогою добре відомих способів. Наприклад, ці клітини піддають оброблянню 4050% поліетиленгліколем молекулярною масою 1000-4000 при температурі приблизно 37°С протягом 5-10 хвилин. Клітини відділяють від суміші злиття і розподіляють у середовищі, що є селективним стосовно бажаних гібридів (наприклад, HAT або АН). Клони, що секретують антитіла з потрібною специфічністю зв'язування, ідентифікуються шляхом аналізу середовища триома-культури на здатність до зв'язування з Αβ або його фрагментом. Людські антитіла, що продукують триоми і мають бажану специфічність, піддають субклонуванню у спосіб обмеженого розведення і вирощуються in vitro в культурному середовищі. Одержані таким чином триомаклітинні лінії випробують на здатність до зв'язування з Αβ або його фрагментом. Хоча триоми є генетично стабільними клітинними лінями, вони не продукують антитіла на дуже високих рівнях. їхні рівні експресії можна підвищити шляхом клонування генів антитіл із триом в один чи більше векторів експресії і трансформування цього вектора у стандартні клітинні лінії ссавцій, бактерій або дріжджів. (2) Трансгенні ссавцнтварини Людські антитіла проти Ар можуть бути одержані також із трансгенних ссавців-тварин, що мають трансгени, які кодують принаймні один сегмент локусу імуноглобуліну людини. Зазвичай, ендогенний імуноглобуліновий локус таких трансгенних тварин є функціонально 29 81215 неактивованим. Краще, якщо сегмент локусу імуноглобуліну людини містить непереупорядковані послідовності важких і легких ланцюгових компонентів. Як інактивація ендогенних імуноглобулінових генів, так і вбудовування екзогенних імуноглобулінових генів можуть здійснюватися шляхом скерованої гомологічної рекомбінації' або вбудовування YACхромосом. Трансгенні ссавці після такої обробки здатні функціонально переупорядковувати послідовності імуноглобулінових компонентів і експресувати популяцію антитіл різних ізотипів, кодованих імуноглобуліновими генами людини, не експресуючи при цьому ендогенних імуноглобулінових генів. Продукування і властивості ссавців з такими характеристиками описані докладно, наприклад, в [Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucheriapati, WO 91/10741 (1991)] (включених тут шляхом посилання в усій їхній повноті для всіх цілей). Особливо підходящими для цієї ролі є трансгенні миші. Антитіла проти Ар одержуються шляхом імунізації трансгенної тварини-ссавця так, як описано в [Lonberg, або Kucheriapati, див. вище], пептидом Ар або його фрагментом. Моноклональні антитіла готують, наприклад, шляхом злиття р-клітин від таких тварин з відповідними клітинними лініями мієломи за звичайною технологією Колера-Мільштайна (Kohler-Milstein). Поліклональні антитіла людини також можна одержувати у формі сироватки від людей, імунізованих імуногенним агентом. Якщо необхідно, то такі поліклональні антитіла можуть бути концентровані шляхом афінного очищування з використанням Ар або іншого амілоїдного пептиду в якості афінореагенту. (3) Фаговідображувальні способи Одержувати людські антитіла проти Ар можна також шляхом скринінгу бібліотеки ДНК із В-клітин людини відповідно до загального протоколу, запропонованого в [Huse et al., Science 246:12751281 (1989)]. Як і у випадку триома-методики, такі В-клітини можна одержувати від людини, імунізованої Αβ, його фрагментами, довшими поліпептидами, що містять Αβ або його фрагменти, чи антиідіотиповими антитілами. У разі потреби такі В-клітини одержують від пацієнта, який буде піддаватися лікуванню антитілами. Для цього відбирають антитіла, що зв'язуються з Αβ або його фрагментом. Після цього клонують і ампліфікують послідовності, що кодують такі антитіла (або зв'язувальні фрагменти). Протокол, описаний Хьюзом (Huse) стає більш ефективним в комбінації з фаговідображувальним способом, див., наприклад, [Dower et al., WO 91/17271 and McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 and US 5,565,332] (включені тут шляхом посилання в усій їхній повноті і для всіх цілей). В цих способах готують фагові бібліотеки, члени яких на зовнішніх поверхнях відображують 30 різноманітні антитіла. При цьому антитіла, як правило, відображуються як Fv або Fabфрагменти. Фаговідображуючі антитіла з бажаною специфічністю відбирають за збільшенням афінності до Αβ-пептиду або його фрагменту. Один із варіантів фаговідображувального способу дозволяє продукувати людські антитіла зі специфічністю зв'язування вибраного мишачого антитіла [Winter, WO 92/20791]. У цьому способі в якості вихідного матеріалу використовується варіабельна ділянка важкого або легкого ланцюга відібраного мишачого антитіла. Якщо, наприклад, у якості вихідного матеріалу вибирається варіабельна ділянка легкого ланцюга, то конструюють фагову бібліотеку, члени якої відображують таку саму варіабельну ділянку легкого ланцюга (тобто мишачий вихідний матеріал) і варіабельну ділянку важкого ланцюга, що відрізняється від неї. Важколанцюгові варіабельні ділянки одержують із бібліотеки переупорядкованих важколанцюгових варіабельних ділянок людини. Відбирають фаг, що виказує сильне специфічне зв'язування з Αβ (наприклад, принаймні 108, а краще, якщо принаймні 109 М-1). Важколанцюгова варіабельна ділянка людини із цього фага служить у якості вихідного матеріалу для конструювання наступної фагової бібліотеки. В цій бібліотеці кожний фаг відображує таку саму важколанцюгову варіабельну ділянку (тобто ділянку, ідентифіковану із першої відображувальної бібліотеки) і легколанцюгову варіабельну ділянку, що від неї відрізняється. Легколанцюгові варіабельні ділянки одержують із бібліотеки переупорядкованих варіабельних легколанцюгових ділянок людини. І знову відбирають фаги, що виказують сильне специфічне зв'язування з Αβ. Ці фаги відображують варіабельні ділянки повністю людських антитіл проти Αβ. Ці антитіла, зазвичай, мають однакову або подібну до мишачого вихідного матеріалу епітопну специфічність. ν. Селекція постійної ділянки Важколанцюгові і легколанцюгові варіабельні ділянки химерних, гуманізованих або людських антитіл можуть бути зв'язані принаймні з частиною постійної ділянки людини. Вибір постійної ділянки залежить частково від того, чи є бажаними антитіло-залежне доповнення і/або клітинноопосередкована токсичність. Наприклад, ізотипи lgG1 і lgG3 мають комплементарну активність, а ізотипи lgG2 j lgG4 її не мають. Вибір ізотипу може також впливати на перехід антитіла в мозок. Кращим є людський ізотип IgGl Легколанцюгові постійні ділянки можуть бути лямбда- або кападілянками. Антитіла можуть експресуватися як тетрамери, що містять два легких і два важких ланцюги, такі роздільні важкі ланцюги і легкі ланцюги, як Fab, Fab' F(ab')2 і Fv, або як однолацюгові антитіла, в котрих важколанцюгові і легколанцюгові варіабельні домени зв'язані через спейсер. vi. Експресія рекомбінантних антитіл Химерні, гуманізовані і людські антитіла, як правило, отримують шляхом рекомбінантної 31 81215 експресії. Рекомбінантні полінуклеотидні конструкти, як правило, містять послідовність контролю експресії, оперативно зв'язану з кодуючими послідовностями ланцюгів антитіл, включаючи об'єднані природним шляхом або гетерологічні промоторні ділянки. У кращому варіанті послідовностями контролю експреси є еукаріотичні промоторні системи у векторах, здатних трансформувати або трансфектувати еукаріотичні клітини-хазяїни. Як тільки вектор вбудовується у відповідного хазяїна, останній підтримується в умовах, підходящи х для високого рівня експресії нуклеотидних послідовностей збирання й очищення антитіл, що взаємодіють перехресним чином. Ці вектори експресії, як правило, можуть реплікуватися в організмах-хазяїнах чи як епісоми, чи як інтегральна частина хромосомної ДНКхазяїна. У загальному випадку вектори експресії містять селекторні маркери, наприклад, ампіцилінрезистивність або гідроміцин-резистивність, для того, щоб дозволити на виявлення клітин, трансформованих бажаними ДН «послідовностями. Е. соlі є одним з прокаріотичних хазяїнів, особливо підходящих для клонування ДНКпослідовностей за даним винаходом. Застосовувати для експресії можна також мікроби, наприклад, дріжджі. Кращими дріжджамихазяїнами є сахароміцети з відповідними векторами, що мають послідовності контролю експреси, ориджин-реплікації, кінцеві послідовності і т.п. До числа типових промоторів належать 3-фосфогліцераткіназа та інші гліколітичні ферменти. До числа дріжджових промоторів, що індукуються, належать, поряд з іншими, промотори із алкогольдегідрогенази, ізоцитохрому С і ферментів, відповідальних за використання мальтози і галактози. Кращими для експресії нуклеотидних сегментів, що кодують імуноглобуліни або їхні фрагменти, є клітини ссавців [Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]. Була розроблена ціла низка підходящих ліній клітинхазяїнів, здатних секретувати інтактні гетерологічні білки - СНО-клітинні лінії, різноманінті COSклітинні лінії, HeLa-клітини, L-клітини і лінії клітин мієломи. Краще, якщо ці клітини не є клітинами людини. В число векторів експресії для цих клітин входять послідовності контролю експресії, якими є ориджин-реплікації, промотор, енхансер [Queen et aL, Immunol. Rev. 89:49 (1986)] і необхідні інформаційні сайти процесінгу, якими є сайти зв'язування рібосоми, сайти сплайсінгу РНК, сайти поліаденілювання і послідовності завершення транскрипції. Кращими послідовностями контролю експресії є промотори, виведені із ендогенних генів, цитомегаловірусу, SV-40, аденовірусу, вірусу бичачої папіломи і под. [Co et al., J. Immunol. 148:1149(1992)]. В альтернативному варіанті послідовності кодування антитіл можуть вбудовуватися в трансгени для введення в геном трансгенної тварини і наступної експресії в молоці трансгенної тварини див., наприклад, патенти США [US 32 5,741,957, US 5,304,489, US 5,849,992]. Підходящими трансгенами є кодувальні послідовності для легких і/або важких ланцюгів в оперативному зв'язуванні з промотором і енхансером зі специфічного гена залози ссавця, яким є, наприклад, казеїн або бета-лактоглобулін. Вектори, що містять потрібні ДНК-сегменти, можуть бути перенесені до клітини-хазяїна у добре відомі способи залежно від типу клітини-хазяїна. Наприклад, для прокаріотичних клітин, зазвичай, застосовується трансфекція хлоридом кальцію, а для інших клітин-хазяїнів можна застосовувати обробку фосфатом кальцію, електропорацію, ліпофекцію, біолістичну трансфекцію або трансфекцію на базі вірусів. Для трансформації клітин ссавців можуть застосовуватися також полібрен, злиття протопластів, ліпосоми, електропорація і мікроін'єкція, див. [Sambrook et al., вище]. У продукуванні трансгенних тварин трансгени можуть уводитися шля хом мікроін'єкцій в запліднені ооцити або можуть уводитися в геном ембріональних стовбурових клітин, а ядра таких клітин можуть бути перенесені до енуклеованих ооцитів. Антитіла після їх експресії можна очищувати за стандартними методами і, у тому числі, рідинної хроматографії високої розрізнювальності, колончастої хроматографії, гель-електрофорезу, тощо, ди в., наприклад, [Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982]. 3. Білки-носії Деякі агенти для індукування імунної реакції містять відповідний епітоп для індукування імунної реакції проти амілоїдних відкладень, але вони занадто малі для того, щоб бути імуногенними. У цій ситуації пептидний імуноген може бути зв'язаний з відповідним носієм, щоб допомогти йому викликати імунну відповідь. Підходящими для цього носіями є сироваточні альбуміни, гемоціанін лімфи равлика, молекули імуноглобуліну, тироглобулін, овальбумін, правцевий токсин, токсини від інших патогенних бактерій, наприклад, дифтерії, Е. Соlі, холери, Н. pylori або атенуйовані похідні токсинів. Носіями можуть бути також Т-клітинні епітопи, що зв'язуються з численними алелями головного комплексу гістосумісності, наприклад, зі 75% всіх алелей головного комплексу гістосумісності людини. Такі носи іноді називають універсальними «Т-клітинними епітопами». У якості прикладів універсальних Т-клітинних епітопів можна назвати: гемаглутинін інфлюенції: НА307-319 PKYVKQNTLKL AT (SEQ. ID No. 43); - PADRE (загальні залишки, виділені жирним шрифтом) AKXVAAWTLKAAA (SEQ. ID N0. 44); - малярія CS: ТЗ-епітоп EKKIAKMEKASSVFN V (SEQ. ID No. 45); - поверхневий антиген гепатиту В: HBsAg19-28 FFLLTRILTI (SEQ. ID No. 46); - білок 65 теплового шоку: hsp65153-171 DQSIGDUAEAMDKVGNEG (SEQ. ID No. 47); - бацила Calmette-Guerin: QVHFQPLPPAWKL (SEQ. ID No. 48); правцевий токсин: TT830-844 QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID No. 49); 33 81215 правцевий токсин: ТТ947-967 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ. ID No. 50); - вірус ВІЛ gp120 T1: KQIIN MWQEVGKAMYA (SEQ. ID No. 51); У якості носіїв для стимулювання або підсилення імунної відповіді можна застосовувати цитокіни, наприклад, IL-1, IL-1 a- і β-пептиди, IL-2, γ-INF, IL-10, GM-CSF, і хемокіни, наприклад, МІРІ α і β і RANTES. Імуногенні агенти можна також зв'язувати з пептидами, що підсилюють транспортування крізь тканини, як описано в [O'Mahony WO 97/17613 і WO 97/17614]. Імуногенні агенти можна зв'язувати з носіями шляхом хімічного зшивання. Для зшивання імуногена з носієм застосовуються способи утворення дисульфідних зв'язків за допомогою №сукцинімідил-3-(2-піридилтіо)пропіонату (SPDP) і сукцинімідил-4-(№ малеімідометил)циклогексан-1карбоксилату (SMCC) (якщо пептиду бракує сульфгідрильної групи, то ЇЇ наявність можна забезпечити добавленням цистеїнового залишку). Ці реагенти утворюють дисульфідний зв'язок між ними і цистеїновими залишками пептиду на одному білку і амідний зв'язок через ε-аміно на лізині, чи через іншу вільну аміногрупу в інших амінокислотах. Різноманітні агенти, що утворюють дисульфід/амідні зв'язки, описані в [Immun. Rev. 62, 185 (1982)]. Інші біфункціональні зв'язувальні агенти утворюють тіоефірний, а не дисульфідний зв'язок. Багато з таких тіоефір-утворювапьних агентів є у продажу, і серед них можна назвати хімічно активні ефіри 6-малеімідокапронової кислоти, 2-бромоцтової кислоти і 2-йодоцтової кислоти, 4-(N-малеімідометил)циклогексан-1карбонової кислоти. Карбоксильні групи можна активувати шля хом комбінування з їх сукцинімідом або 1-гідроксил-2-нітро-4-сульфокислотою, сіллю натрію. Імуногенні пептиди можуть також бути експресовані як злиті білки з носіями (тобто гетерологічні пептиди). Імуногенний пептид може бути зв'язаний з носієм на своєму аміно-кінці, карбокси-кінці або на обох кінцях. Якщо необхідно, то у злитому білку можуть бути наявними численні повтори імуногенного пептиду. Імуногенний пептид може зв'язуватися з багатьма копіями гетерологічного пептиду, наприклад, на N- і на Скінцях пептиду. Деякі пептиди-носії служать для індукування відповіді Т-клітин-хелперів проти пептиду-носія. Індуковані Т-клітини-хелпери, у свою чергу, викликають В-клітинний відгук на імуногенний пептид, зв'язаний з пептидом-носієм. Деякі агенти за даним винаходом містять злитий білок, в якому N-кінцевий фрагмент Αβ зв'язаний з пептидом-носієм на своєму С-кінці. В таких агентах N-кінцевий залишок фрагмента Αβ становить собою N-кінцевий залишок злитого білка. Таким чином, такі злиті білки спроможні ефективно індукувати антитіла, що зв'язуються з епітопом, який потребує, щоб N-кінцевий залишок пептиду Αβ знаходишся у вільній формі. Деякі агенти за даним винаходом містять численні повтори N-кінцевого сегмента Αβ, зв'язаного на Скінці з однієї чи більше коліями пептиду-носія. Nкінцевий фрагмент пептиду Αβ, вбудований в такі 34 злиті білки, іноді починається на Αβ1-3 і закінчується на Αβ7-11. Кращими N-кінцевими фрагментами Αβ є Αβ1-7, Αβ1-3, Αβ1-4, 1-5 і 3-7. Деякі злиті білки містять різні N-кінцеві сегменти Αβ в тандемі. Наприклад, злитий білок може містити Αβ1-7, за яким слідує Αβ1-3, за яким, у свою чергу, йде гетерологічний пептид. В деяких злитих білках N-кінцевий сегмент Αβ злитий на його N-кінці з гетерологічним пептидомносієм. Ті ж самі різновиди N-кінцевих сегментів Αβ можуть використовуватися як з С-кінцевими злиттями. Деякі злиті білки містять гетерологічний пептид, зв'язаний з N-кінцем N-кінцевого сегмента Αβ, який у свою чергу зв'язаний з одним чи більше додаткових N-кінцевих сегментів Αβ в тандемі. Нижче розглядаються деякі приклади злитих білків, підходящих для застосування у даному винаході. Деякі з цих злитих білків містять сегменти Αβ, зв'язані з епітопами правцевого токсину, як описано в [US 5,196,512, ЕР 378,881 і ЕР 427,347]. Деякі злиті білки містять сегменти Αβ, зв'язані з пептидами-носіями, описаними в патенті США 5,736,142. Деякі гетерологічні пептиди являють собою універсальні Т-клітинні епітопи. В деяких способах призначений для введення пацієнту агент являє собою простий одинарний злитий білок з Αβ-сегментом, зв'язаним з гетерологічним сегментом у лінійній конфігурації. В деяких способах агентом є мультимер злитих білків, що визначається як 2х, де x - ціле число від 1 до 5. У кращих варіантах x = 1, 2, 3, серед яких найкращим є x = 2. При значенні x = 2 такий мультимер має чотири злиті білки, зв'язані у кращій конфігурації, що зветься МАР4, див. патент США [US 5,229,490]. Епітопи Αβ підкреслені. Нижче показана конфігурація МАР4, де розгалужені структури одержують шляхом ініціації пептидного синтезу як на N-кінці, так і на амінах бічного ланцюга лізину. Лізин з різною кратністю вбудовується в послідовність і одержує змогу відгалужуватися, утворюючи структуру з численними N-кінцями. У даному прикладі на розгалуженому лізиновмісному стрижні утворено 4 ідентичних N-кінця. Така множинність значно збільшує реактивність споріднених В-клітин. AN90549 (Αβ 1-7/правцевий токсин 830-844 в конфігурації МАР4): DAEFRHDQYIKANSKRGITEL (SEQ. ID No. 52) AN90550 (Αβ І-7/правцевий токсин 947-967 в конфігурації МАР4): DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ. ID No. 53) AN90542 (Αβ 1-7/правцевий токсин 830-844 + 947-967 в лінійній конфігурації): DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKV SASHLE (SEQ. ID No. 54) 35 81215 AN90576: (Αβ 3-9/правцевий токсин 830-844 в конфігурації МАР4): EFRHDSGQYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID No. 55) Пептид, описаний в патенті США №5,736,142 (все в лінійній конфігурації): AN90562 (Αβ17/пептид) AKXVAAWTLKAAAD AEFRHD (SEQ. ID No. 56) AN90543 (ΑβΙ-7 x 3/пептид): DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (SEQ. ID No. 57) У якості прикладів злитих білків (імуногенний епітоп пептиду Αβ виділений жирним шрифтом) можна навести: AKXVAAWTLKAAA-D AEFRHD-DAEFRHDDAEFRHD (SEQ. ID No. 58) DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ. ID No. 59) DAEFRHD-ISQAVHAAH AEINEAGR (SEQ. ID No. 60) FRHDSGY-ISQAVH AAH AEINEAGR (SEQ. ID No. 61) EFRHDSG-ISQAVH AAH AEINEAGR (SEQ. ID No. 62) PKYVKQNTLKL AT-D AEFRHD-DAEFRHDDAEFRHD (SEQ. ID No. 63) DAEFRHD-PKYVKQNTLKL AT-D AEFRHD (SEQ. ID No. 64) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDPKYVKQNTLKL AT (SEQ. ID No. 65) DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKL AT (SEQ. ID No. 66) DAEFRHD-PKWKQNTLKLATEKKIAKMEKASSVFNV-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD (SEQ. ID No. 67) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ. ID No. 68) DAEFRHDQYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFVVLRVPKVSASHL E (SEQ. ID No. 69) DAEFRHDQYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLR VPKVSASHLE -DAEFRHD (SEQ. ID No. 70) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ. ID No. 52) на 2-гілчастій смолі EQVTNVGGAISQAVHAAH AEINEAGR (SEQ. ID No. 71) (злітий білок синуклеїну в конфігурації МАР-4) Такі самі або подібні білки-носії і способи зв'язування можуть застосовуватися для генерування імуногенів, призначених для продукування антитіл проти Αβ, застосовуваних у пасивній імунізації. Наприклад, Αβ або його фрагмент, зв'язаний з носієм, може вводитися піддослідній тварині для продукування моноклональних антитіл проти Αβ. 4. Нуклеїнові кислоти, що кодують терапевтичні агенти 36 Імунні реакції проти амілоїдних відкладень можуть індукуватися також уведенням нуклеїнових кислот, які кодують сегменти пептиду Αβ і його фрагменти, імуногени інших пептидів або антитіла і їхні складові ланцюги, що застосовуються для пасивної імунізації. Такими нуклеїновими кислотами можуть бути як ДНК, так і РНК. Нуклеїнокислотний сегмент, що кодує імуноген, зазвичай, зв'язаний з регуляторними елементами, якими є промотори і енхансери, що дозволяють експресувати ДНК-сегмент в призначених для цього клітинах-мішенях пацієнта. У випадку експресії в клітинах крові, що є бажаним для індукування імунної відповіді, підходящими для прямої експресії є промоторні й енхансерні елементи із легколанцюгових або важколанцюгових імуноглобулінових генів або CMV головні проміжні ранішні промотор і енхансер. Зв'язані регуляторні елементи і кодуючі послідовності часто клонуються у вектор. Для введення дволанцюгових антитіл обидва їхні ланцюги можуть бути клоновані в одному і тому ж або роздільних векторах. У продажу є численні вірусні і векторні системи, включаючи ретровірусні системи, див., наприклад, [Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet Develop. 3, 102-109 (1993)], аденовірусні вектори, див., наприклад, [Bett et al., J. Virol. 67, 5911 (1993)], адено-асоційовані вірусні вектори, див., наприклад, [Zhou et al., J. Exp. Med, 179, 1867 (1994)], вірусні вектори родини сифілісних, включаючи вірус коров'ячої віспи і віруси пташиної віспи, вірусні вектори роду альфа-вірусів, якими є виведені із вірусів Sindbis і Semliki лісний, див., наприклад, [Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)], вірус венесуельського конячого енцефаліту, див. патент США [US 5,643,576], рабдовіруси, одним з яких є вірус везикулярного стоматиту, див., наприклад, [WO 96/34625] і віруси папіломи [One et al.. Human Gene Therapy Q, 325333 (1995); Woo et al., WO 94/12629; Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24,2630-2622 (1996)]. ДНК, що кодує імуноген, або вектор, який її містить може впаковуватися в ліпосоми. Підходящі для цього ліпіди і відповідні аналоги описані в патентах США [US 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5,283,185]. Вектори і ДНК, що кодують імуноген, можуть також адсорбуватися на порошкових носіях або зв'язуватися з ними; в якості таких носіїв можуть застосовуватися полімери поліметилметакрилату, полілактиди і полі(лактидспівгліколіди), див., наприклад, [McGee et ai., J. Місro Еnсар. (1996)]. Вектори генної терапії або відкриті ДНК можуть постачатися в організм пацієнта in vivo шляхом уведення, зазвичай, у способи системного введення (наприклад, внутрішньовенно, інтраперитонеально, інтраназанально, через шлунок, інтрадермально, внутрішньом'язово, субдермально або інтракраніальною інфузією) або шляхом місцевої аплікації, див., наприклад, патент США [US 5,399,346]. Такі вектори можуть містити також сприятливі агенти, наприклад, бупівацин [US 5,593,970]. ДНК можуть уводитися також за допомогою генної пушки [Xiao & Brandsma, вище]. 37 81215 ДНК, що кодує імуноген, осаджують на поверхню металевих мікрокульок. Мікрокулькам під дією ударної хвилі або розширюваного гелію надається прискорення, і вони проникають в тканину на глибину кількох клітинних шарів. Підходящим для цього є, наприклад, прилад для постачання генів марки Accel™, який виробляє фірма Agacetus, Inc. Middleton WI. Можна також уводити відкриті ДНК крізь шкіру, в потік крові, просто прикладаючи ДНК на шкіру із засобами механічного або хімічного подразнення [WO 95/05853]. Можливі варіанти, в яких вектори, що кодують імуногени, постачаються в клітини ех vi vo, тобто в клітини, експлантовані у пацієнта (наприклад, лімфоцити, аспіраційні біоптати кісткового мозку, тканинна біопсія) або універсальні донорні гематопоетичні стовбурові клітини, з наступною реімплантацією цих клітин у пацієнта, зазвичай, після відбору клітин, які мають вбудований вектор. III. Скринінг антитіл за їхньою очищувальною дією Винаходом пропонуються способи скринінгу антитіла за його ефективністю у видаленні амілоїдного відкладення або іншого антигена, або ж асоційованої біологічної речовини, яка повинна бути піддана такого роду дії. Для відбирання антитіл за їхньою активністю проти амілоїдного відкладення зразок тканини із мозку пацієнта з хворобою Альцгеймера або піддослідної тварини, що має характеристичну патологію Альцгеймера, приводять у контакт з фагоцитними клітинами, що несуть Fc-рецептор, наприклад, мікрогліальними клітинами, і аналізованим антитілом в середовищі in vitro. У якості фагоцитних клітин може бути застосована первинна культура або клітинна лінія, якою є, наприклад, BV-2, C8-B4 або ТНР-1. В деяких способах компоненти комбінують на предметному склі мікроскопу, що дозволяє полегшити мікроскопічні спостереження. Можна застосовувати способи, згідно з якими в ямках мікротитрувальних чашок паралельно здійснюють багато реакцій. За таких розмірів мініатюрні предметні стекла мікроскопу можуть встановлюватися в окремі ямки, або ж може бути застосований не мікроскопічний формат виявлення, наприклад, детектування Αβ за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ELISA. У кращому варіанті проводять серію вимірювань кількості амілоїдного відкладення в реакційній суміші in vitro, починаючи від величини базового рівня, що відповідає дореакційному стану, і знімаючи потрібну кількість величин в процесі реакції. Антиген може бути виявлений шляхом забарвлення, наприклад, флуоресцентно міченим антитілом до Αβ або іншого компонента амілоїдних бляшок. Антитіло, що використовується для забарвлення, може бути або не бути таким самим, як антитіло, що аналізується на очищувальну дію. Зниження кількості амілоїдних відкладень відносно базового рівня в процесі реакції вказує на те, що дане антитіло вчиняє очищувальну дію. Такі антитіла, очевидно, можуть застосовуватися у профілактиці або лікуванні хвороби Альцгеймера та інших амілоїдогенних хвороб. 38 Аналогічні способи можуть бути застосовані для скринінгу антитіл за Їхньою активністю у видаленні інших типів біологічних речовин. Такі випробування можуть застосовуватися для виявлення очищувальної активності проти біологічних речовин будь-якого типу. Як правило, така біологічна речовина відіграє певну роль у хворобі людини чи тварини. Біологічна речовина може подаватися для аналізу у формі зразка тканини або в ізольованій формі. У першому варіанті зразок тканини не повинен фіксуватися, щоб мати змогу легкого доступу до його компонентів, уникаючи при цьому порушень конформації компонентів внаслідок фіксації. У якості зразків тканин для такого аналізу можуть братися: ракові тканини; предракові тканини; тканини з доброякісними утвореннями, якими є, наприклад, бородавки або родимки; тканини, інфектовані патогенними мікроорганізмами: тканини, інфільтровані клітинами зони запалення; тканини з патологічними матрицями між клітинами (наприклад, фібринозний перикардит); тканини з аберантними антигенами і рубцеві тканини. У якості прикладів ізольованих речовин, які можуть застосовуватися у такому аналізі, можна назвати Αβ, вір усні антигени або віруси, протеоглікани, антигени інших патогенних мікроорганізмів, пухлинні антигени і адгезійні молекули. Такі антигени можуть одержуватися із природних джерел, шляхом рекомбінантної експресії або хімічного синтезу та за допомогою інших засобів. Зразок тканини або ізольованої біологічної речовини приводять в контакт з фагоцитними клітинами, що несуть Fc-рецептори, наприклад, моноцитами або мікрогліальними клітинами, і випробуваним антитілом у певному середовищі. Антитіло може бути спрямоване на біологічну речовину, що аналізується, або на антиген, зв'язаний з цією речовиною. В останньому випадку об'єкт піддають тесту на те, чи є дана біологічна речовина опосередковано фагоцитованою антигеном. Зазвичай, хоч і не обов'язково, антитіло і біологічна речовина (іноді зі зв'язаним з нею антигеном) перед добавленням фагоцитних клітин приводяться у взаємний контакт. Після цього ведуть спостереження за концентрацією біологічної речовини і/або зв'язаного антигена (якщо він є), що залишився у середовищі. Зменшення кількості або концентрації антигена чи зв'язаної біологічної речовини у середовищі показує, чи має антитіло очищувальну реакцію проти антигена і/або зв'язаної біологічної речовини разом з фагоцитними клітинами (див. Приклад 14). IV. Пацієнти Пацієнтами, які погодились на лікування у запропоновані способи, можуть бути особи, що знаходяться в групі ризику даної хвороби, але не виказують її симптомів, а також пацієнти, які в даний час вже такі симптоми виявляють. У випадку хвороби Альцгеймера практично будь-яка людина достатньо великого віку знаходиться в її групі ризику. Отже запропоновані способи можуть застосовуватися профілактично до всіх, без винятку, і незалежно від того, чи знаходиться дана особа в групі ризику. Способи за даним винаходом 39 81215 є особливо ефективними щодо осіб, схильних генетично до хвороби Альцгеймера. Такими особами можуть бути ті, що мають родичів, вже потерпілих від цієї хвороби, і ті, для яких ризик захворіти був виявлений в результаті аналізу генетичних або біохімічних маркерів. Генетичними маркерами ризику стосовно хвороби Альцгеймера є мутації в АРР-гені і, зокрема, мутації в положенні 717 і положеннях 670 і 671, які одержали назву відповідно мутацій Харді (Hardy) і шведських мутацій, див. [Hardy, TINS, ви ще]. Маркерами ризику можуть бути також мутації в пресенільних генах PS1 і PS2, і АроЕ4, історія хвороби Альцгеймера в родині, гіперхолестеролемія або атеросклероз. Особи, що страждають на хворобу Альцгеймера на час обстежень, виявляють себе по характерному недоумству, а також наявністю описаних вище факторів ризику. Крім того, існують численні діагностичні тести для ідентифікації осіб, що страждають на хворобу Альцгеймера. До них належать вимірювання рівней CSF-тау і Αβ42. Підвищений рівень тау і знижений рівень Αβ42 свідчать про наявність хвороби Альцгеймера. Особи, що страждають на хворобу Альцгеймера, можуть бути виявлені також за критерієм ADRDA, як описано в Прикладах нижче. Для пацієнтів, що виказують симптоми хвороби, лікування може починатися у будь-якому віці (10, 20, 30... років). Проте, зазвичай, починати лікування такого пацієнта раніше, ніж він досягне віку 40, 50, 60 або 70 років, необхідності немає. Лікування, як правило, полягає у призначенні пацієнту прийняття багатократних доз препаратів протягом певного часу. Спостереження в лроцессі лікування можна здійснювати шляхом аналізу антитіла або активованих Т-клітинних чи Вклітинних реакцій на терапевтичний агент (наприклад, пептид Αβ). Якщо реакція падає, то пацієнту призначають бустер-дозу. Лікування потенційних пацієнтів із синдромом Дауна може починатися до їх народження і здійснюватися шляхом уведення терапевтичного агента матері або ж одразу після народження. V. Режими лікування З метою профілактики фармацевтичні композиції або медикаменти вводять пацієнту, який є схильним до хвороби Альцгеймера або якимось іншим чином входить в її гр упу ризику, у кількості, достатній для позбавлення від цього ризику або зниження його, послаблення тяжкості або затримання виникнення хвороби, включаючи біохімічні, гістологічні симтоми і/або зовнішні ознаки цієї хвороби, ускладнення від неї і проміжні патологічні фенотипи, що виникають в процесі її розвитку. При застосуванні у терапевтичних цілях композиції або медикаменти вводять пацієнту, що знаходиться під підозрою на захворювання або вже страждає на таку хворобу, у кількості, достатній для лікування або, принаймні, часткового припинення симптомів хвороби (біохімічних, гістологічних і/або зовнішніх ознак), включаючи ускладнення від неї і проміжні патологічні фенотипи в процесі її розвитку. В деяких способах уведення лікувального агента зменшує або виключає міокогнітивний розлад у 40 пацієнта, в якого ще не розвинулась характерна патологія Альцгеймера. Кількість, адекватна терапевтичному або профілактичному втр учанню, зветься терапевтично або профілактично ефективною дозою. Як у профілактичному, так і в терапевтичному режимі втручання активні агенти, зазвичай, уводяться декількома дозами до тих пір, поки не буде досягнена достатня імунна відповідь. Далі в процесі втручання як тільки по результатах спостережень імунна реакція починає слабнути, пацієнту призначають повторні дози. Ефективні дози композицій за даним винаходом у лікуванні вищеописаних станів залежать від багатьох факторів і, в тому числі, призначення медичного втручання, місця-мішені медичного втручання, фізіологічного стану пацієнта, того, є пацієнт людиною чи твариною, інших застосовуваних медикаментів, а також того, чи є втручання профілактичним чи терапевтичним. Зазвичай, пацієнтом є людина, але лікуванню можуть піддаватися також ссавці-тварини, включаючи трансгенних тварин. Дозування медикаментів повинно бути протитроване, щоб оптимізувати лікування з точки зору безпеки й ефективності. Кількість імуногена залежить від того, чи вводиться разом з ним також ад'ювант, причому у разі відсутності ад'юванту дозу імуногена потрібно збільшува ти. Кількість імуногена для введення іноді варіює у межах 1500мкг на пацієнта і, як правило, в межах 5-500мкг на ін'єкцію для людини. В деяких випадках застосовуються і більші дози - від 1 до 2мг на ін'єкцію. Як правило, в ін'єкціях для людей дози імуногена складають приблизно 10, 20, 50 або 100мкг на пацієнта. Кількість імуногена в одиницях маси залежить також від масового співвідношення імуногенного епітопу в імуногені і загальної маси імуногена. Зазвичай, використовуються від 10-3 до 10-5 мікромолей імуногенного епітопу на мікрограм імуногена. Частота застосування ін'єкцій може змінюватися в широких межах від 1 ін'єкції на день до 1 ін'єкції на рік чи навіть на 10 років. У разі щоденних ін'єкцій доза на пацієнта складає більше 1мкг, а у разі застосування ад'юванту - більше 10мкг, і більше 10мкг при зростанні її до 100мкг на пацієнта у разі відсутності ад'юванту. Типовий режим лікування складається із імунізації з наступними бустер-ін'єкціями з інтервалами в 6 тижнів. Можливі також режими, в яких за імунізацією слідують бустер-ін'єкції через 1, 2 і 12 місяців. Ще в одному режимі ін'єкції роблять кожні 2 місяці протягом всього життя. Бустер-ін'єкції можна також робити нерегулярно, відповідно до результатів спостережень за імунною реакцією. У випадку пасивної імунізації антитілом доза може варіювати у межах приблизно від 0,0001 до 100мг/кг і частіше у межах від 0,01 до 5мг/кг маси тіла хазяїна. Наприклад, доза може становити 1мг/кг маси тіла або 10мг/кг маси тіла чи знаходитися в межах 1-10мг/кг. У типовому режимі лікування введення медикаменту роблять кожні два тижні або один раз на місяць чи один раз за період від 3 до 6 місяців. В деяких способах одночасно призначають два і більше моноклональних антитіл з різними 41 81215 специфічностями зв'язування, а дози при цьому для кожного антитіла знаходяться у вищезазначених межах. Антитіло, зазвичай, призначається в багатьох випадках. Інтервали між уведеннями їхніх одиничних доз можуть бути тижневими, місячними і річними. Вони можуть бути також нерегулярними і встановлюватись відповідно до вимірюваних рівней антитіла до Αβ у крові пацієнта. В деяких способах дозування антитіл регулюють у розрахунку на одержання їхньої концентрації в плазмі крові в межах 11000мкг/мл, а в деяких способах - в межах 25300мкг/мл. В альтернативному варіанті антитіла можуть уводитися у формі препаратів пролонгованої дії, де частота їх прийому зменшується. Дози і частота їх прийому залежать від періоду напівжиття антитіла у пацієнта. У загальному випадку антитіла людей мають найбільший період напівжиття. За ними слідують гуманізовані антитіла, далі - химерні антитіла і після них антитіла тварин. Дози і частота їх введення можуть варіювати залежно від того, є лікування профілактичним чи терапевтичним. У випадку профілактичного лікування дози є порівняно малими, а інтервали їх уведення порівняно великими і займають тривалий час. Деякі пацієнти продовжують лікуватися і надалі протягом всієї решти життя. У терапевтичному застосуванні відносно великі дози за відносно коротких інтервалів їх уведення іноді потребуються до тих пір, поки розвинення хвороби не загальмується або не скінчиться, а в кращих випадках - до тих пір, поки пацієнт не викаже часткове або повне поліпшення симптомів хвороби. Після цього пацієнтові може бути призначений профілактичний режим лікування. Дози нуклеїнових кислот, що кодують імуногени, варіюють в діапазоні від приблизно 10нг до 1г, від 100нг до 100мг, від 1мкг до 10мг чи в межах 30-300мкг ДНК на пацієнта. Дози векторів на основі інфекційних вірусів варіюють у межах 10100 і більше віріонів на дозу. Як у профілактичних, так і в терапевтичних цілях агенти для індукування імунної реакції можуть уводитися парентерально, місцево, внутрішньовенно, перорально, підшкірно, інтраартеріально, інтракраніально, інтраперитонеально, інраназально або внутрішньом'язово. Найбільш поширеним шляхом уведення імуногенного агента є підшкірний, хоча не менш ефективними є також інші шляхи. Наступним за ним, найпоширенішим способом є внутрішньом'язові ін'єкції. Частіше за усе їх роблять в м'язи рук або ніг. У деяких способах ін'єкції агентів роблять безпосередньо в ту тканину, де акумульвані відкладення, вживаючи для цього, наприклад, інтракраніальні ін'єкції. Внутрішньом'язові ін'єкції або внутрішньовенні інфузії застосовують для введення антитіл. В деяких способах конкретні терапевтичні антитіла вводять безпосередньо в череп. В деяких способах антитіла вводять у формі композиції або приладу пролонгованої дії, яким є, наприклад, прилад Medipad™. 42 Агенти за даним винаходом можуть необов'язково уводитися в комбінації з іншими агентами, які принаймні частково ефективні у лікуванні амілоїдогенних хвороб. У випадку хвороби Альцгеймера і синдрому Да уна, коли амілоїдні відкладення виникають в мозку, агенти за даним винаходом можуть уводитися також разом з іншими агентами, які розширюють прохід запропонованих винаходом агентів крізь гематомозковий бар'єр. Імуногенні агенти за даним винаходом, наприклад пептиди, часто вводять у комбінації з ад'ювантом. Для індукування імунної реакції в комбінації, наприклад, з пептидом Αβ можуть уводитися найрізноманітніші ад'юванти. Кращими серед них є такі, що підсилюють внутрішню реакцію на імуноген, не поводуючи конформаційних змін в імуногені, які впливають на якісну форму відповіді. До кращих ад'ювантів належать гідроксид і фосфат алюмінію, 3-Dе-Оацильований монофосфорилліпід A (MPL™), див. патент Великобританії [GB 2220211 (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, тепер частина фірми Соrіха)]. Препарат Stimulon™ QS-21 являє собою тритерпенглікозид або сапонін, виділений з кори дерева Quillaja Saponaria Molina, що росте в Південній Америці [Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US Patent No. 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA)]. Серед інших можливих для застосування ад'ювантів можна назвати емульсії типу «масло у воді» (наприклад, сквален або арахісове масло) у разі необхідності в комбінації з імунними стимулянтами, такими, як монофосфорилліпід A [Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)]. Можна застосовувати також ад'ювант CpG [WO 98/40100]. Пептид Αβ може також зв'язуватися з ад'ювантом. Проте таке зв'язування не повинно суттєво змінювати конформацію Αβ - настільки, щоб зачеплювати природу імунної відповіді на нього. Ад'юванти можуть уводитися як компонент терапевтичної композиції з активним агентом або окремо - до введення, водночас з уведенням або після введення терапевтичного агента. Кращим класом ад'ювантів є солі алюмінію, наприклад, гідроксид алюмінію, фосфат алюмінію і сульфат алюмінію. Такі ад'юванти можуть застосовуватися разом з іншими специфічними імуностимуляторними агентами, наприклад, MPL або 3-DMP, QS-21, полімерними чи мономерними амінокислотами, якими є, наприклад, поліглутамінова кислота або полілізин, чи без них. Іншим прийнятним класом ад'ювантів є емульсійні препарати типу «масло у воді». Такі ад'юванти можуть застосовуватися разом з іншими специфічними імуностимуляторними агентами, наприклад, мураміл-пептидами (наприклад, Nацетилмураміл-L-треоніл-D-ізоглютамін (thr-MDP), N-ацетил-нормураміл-L-аланіл-D-ізоглютамін (norMDP), N-ацетилмураміл-L-аланіл-D-ізоглютамінілL-аланін-2-(1'-2'дипальмітоїл-sn-гліцеро-3гідроксифосфорилоксі)-етиламін (МТР-РЕ), Nацетилглюксамініл-N-ацетилмураміл-L-АІ-D 43 81215 ізоглю-L-АІа-дипалмітоксипропиламід (DTP-DPP) (TheramideTM) або іншими компонентами стінок бактеріальних клітин або без них. У числі емульсій «масло у воді» можна назвати: (a) MF59 [WO 90/14837], що містить 5% Squalene, 0,5% Tween 80 і 0.5% Span 85 (у разі необхідності, з певною кількістю МТР-РЕ) у формі субмікронних часток, одержуваних за допомогою мікрозріджувача, наприклад, моделі 110Y (фірми Microfluidics, Newton MA); (b) SAF, що містить 10% Squalene, 0,4% Tween 80, 5% плюронік-блокованого полімеру L121 і thr-MDP, мікрозріджений у субмікронній емульсії або інтенсивно перемішаний для утворення емульсії з крупнішими частками, і (с) ад'ювантну систему Ribi™ (RAS) (фірма Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT), що містить 2% сквалену, 0,2% Tween 80 і один чи більше компонентів стінок бактеріальних клітин із групи, що складається із монофосфорилліпіду A (MPL), трегалозодиміколату (TD M) і каркасу клітинної стінки (CWS), у кращому варіанті MPL + CWS (Detox™). Іншим підходящим класом ад'ювантів є сапонінові ад'юванти, такі, як Stimulon™ (QS-21, фірма Aquila, Framingham, MA), або утворені з них порошки, наприклад, ISCOM (імуностимуляторні комплекси) й ISCOMATRIX. Серед інших підходящих ад'ювантів можна назвати повний ад'ювант Фрейнда (CFA: Complete Freund's Adjuvant) і неповний ад'ювант Фрейнда (IFA: Incomplete Freund's Adjuvant). Застосовувати в якості ад'ювантів можна також цитокіни, наприклад, інтерлейкіни (IL-1, IL-2 і IL-12), колонієстимулючий фактор макрофагів (M-CSF), фактор некрозу печінки (TNF). Ад'ювант може вводитися з імуногеном у формі єдиної композиції або перед ним, водночас з імуногеном або ж після введення імуногена. Імуноген і ад'ювант можуть пакуватися і постачатися в одній ампулі або ж в різних ампулах і змішуватися безпосередньо перед вживанням. Імуноген і ад'ювант, зазвичай, упаковують в тару з ярликом, на якому указане призначення препарату. Якщо імуноген і ад'ювант упаковані окремо один від одного, то на упаковці, зазвичай, дані інструкції щодо їх змішування перед вживанням. Відповідний ад'ювант і/або носій вибирають, виходячи з міркувань стабільності імуногенного препарату з цим ад'ювантом, способу введення, графіку дозування, ефективності ад'юванту для даного виду пацієнтів і, якщо це люди, то фармацевтично прийнятний ад'ювант повинен мати дозвіл на його застосування у фармакології від відповідних установ. Наприклад, повний ад'ювант Фрейнда не підходить для введення його людині. Кращими ад'ювантами є солі алюмінію, MPL і QS-21. У разі необхідності можуть одночасно застосовуватися два і більше різних ад'юванти. Серед кращих комбінацій таких ад'ювантів можна назвати солі алюмінію з MPL, солі алюмінію з QS-21, MPL з QS21 і солі алюмінію, QS-21 і MPL разом. Може бути застосований також неповний ад'ювант Фрейнда [Chang et al., Ad vanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)], у разі потреби в комбінації з будь 44 якою з солей алюмінію, QS-21 і MPL, а також будьякими їхніми комбінаціями. Агенти за даним винаходом часто вводять у формі фармацевтичних композицій, що містять активний терапевтичний агент та інші різноманітні фармацевтично прийнятні компоненти [Remington's Pharmaceutical Science (15th ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)]. Краща форма такої композиції залежить від передбачуваного способу її введення та її терапевтичного призначення. Такі композиції' можуть включати у себе, залежно від бажаного складу, також фармацевтично прийнятні, нетоксичні носії або розріджувачі, які знаходять широке застосування в якості носіїв для готування фармацевтичних препаратів у ветеринарії чи медицині. Розріджувач вибирають у такому розрахунку, щоб він не впливав на біологічну активність композиції В якості прикладів таких розріджувачів можна назвати дистильовану воду, забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчини Рінгера, розчини декстрози і розчин Хенка. Крім того, фармацевтична композиція або препарат може містити інші носії, ад'юванти або нетоксичні, нетерапевтичні, неімуногенні стабілізатори, тощо. Фармацевтичні композиції можуть включати у себе також великі макромолекули, що повільно метаболізуються, наприклад, білки, полісахариди, такі, як хітозан, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти і співполімери (такі, як латекс-активована сефароза(ТМ), агароза, целюлоза, тощо), полімерні амінокислоти, амінокислотні співполімери і ліпідні агрегати, такі, як масляні краплі або ліпосоми). Крім того, такі носії можуть діяти як імуностабілізаторні агенти (тобто ад'юванти). Для парентерального введення агенти за даним винаходом можуть мати форму дозованих розчинів чи суспензій для ін'єкцій потрібних речовин у фізіологічно прийнятному розчиннику з фармацевтичним носієм, яким може бути стерильна рідина, наприклад, вода, масло, фізіологічний розчин, гліцерол або етанол. Крім того, композиції можуть містити допоміжні речовини, наприклад, зволожувачі або емульгатори, поверхнево-активні речовини, рНбуферні речовини, тощо. Інші компоненти фармацевтичних композицій можуть походити з нафти, мати тваринне, рослинне або синтетичне походження; ними можуть бути, наприклад, арахісова олія, соєва олія та мінеральне масло. У загальному випадку кращими рідинними носіями, особливо в розчинах для ін'єкцій, є гліколі, наприклад, проліленгліколь або поліетиленгліколь. Антитіла можуть уводитися у формі депо-ін'єкцій або імплантаційних препаратів, приготованих таким чином, щоб забезпечити довготривале звільнення активного інгредієнта. Типова композиція включає у себе моноклональне антитіло з концентрацією 5мг/мл, що знаходиться у водному буферному розчині із 50мМ L-гістидину і 150мМ NaCI, відрегульованому на рН 6,0 соляною кислотою (НСІ). 45 81215 Композиції, як правило, готують у формі для ін'єкцій в розчинах або суспензіях. Можливі також твердотілі форми, розраховані на розчинення або суспендування в рідинних носіях перед Їх ін'єкцією. Препарати можуть також бути емульгованими або інкапсульованими в ліпосомах чи мікрочастках, наприклад, полілактидних, полігліколідних або співполімерних частках для підсилення ад'ювантного ефекту, як описано в роботі [Langer, Science 249, 1527 (1990) and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997)]. Агенти за даним винаходом можуть уводитися у формі депо-ін'єкцій або імплантаційних препаратів, які можуть бути приготовані таким чином, щоб забезпечити довготривале або пульсаційне виділення активного інгредієнта. Можуть готуватися також препарати, розраховані на інші способи введення, в тому числі пероральний, інтраназальний, легеневий, а також супозиторії і трансдермальні аплікації. Для супозиторіїв у якості зв'язуючих і носіїв можна застосовувати, наприклад, поліалкіленгліколі або тригліцериди. Такі супозиторії можна формувати із сумішей, що містять активний інгредієнт в межах від 0,5% до 10% і краще - від 1% до 2%. Препарати для перорального прийому включають у себе ексципієнти - фармацевтичні сорти манітолу, лактози, крохмалю, стеарату магнію, натрійсахарину, целюлози і карбонату магнію. Ці композиції приймають форму розчинів, суспензій, таблеток, пілюль, капсул, препаратів пролонгованої дії або порошків і містять активний Інгредієнт у кількості 10-95%, і у кращому варіанті 25-70%. Аплікації для місцевого застосування розраховані на трансдермальне або інтрадермальне постачання. Місцеве застосування може бути полегшене сумісним уведенням агента разом з токсином холери або його детоксифікованими похідними чи субодиницями або іншими подібними бактеріальними токсинами [Glenn et al.. Nature 391,851 (1998)]. При сумісному введенні компоненти можуть утворювати суміш або мати форму зв'язаних молекул, отриманих хімічним зшиванням або експресією, як для злитих білків. В альтернативному варіанті трансдермальне постачання може здійснюватись із використанням шляхів крізь шкіру або трансферосом [Paul et al., Bur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995); Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15 (1998)]. VI. Способи діагностики Даний винахід передбачає способи виявлення імунної реакції проти пептиду Αβ у пацієнта, що страждає на хворобу Альцгеймера або є схильним до неї. Ці способи є особливо корисними у спостереженнях за процесом лікування, призначеного даному пацієнту. Вони можуть використовува тися для спостережень як за терапевтичним лікуванням пацієнтів, що виказують симптоми захворювання, так і за профілактичним лікуванням пацієнтів, що таких симптомів не виказують. Запропоновані способи 46 можуть застосовуватися для спостережень як за активною імунізацією (наприклад, антитіл, що продукуються як реакція на введення імуногена), так і за пасивною імунізацією (наприклад, вимірювання рівня введеного антитіла). 1. Активна імунізація Деякі запропоновані способи передбачають визначення величини базового рівня імунної реакції у пацієнта до введення йому дози агента і порівняння цієї величини з величиною імунної реакції після лікування. Суттєве зниження (тобто більше, ніж типові межі похибки експерименту в групі повторних вимірювань одного зразка, вираженої через стандартне відхилення від середньої величині в даній групі вимірювань) величини імунної реакції означає позитивний результат лікування (тобто те, що введення агента викликало або збільшило імунну реакцію). Якщо ж величина імунної реакції не зазнала значних змін або зменшилася, це означає, що результат лікування є негативним. У загальному випадку у пацієнтів на початку курсу лікування імуногенним агентом спостерігається збільшення імунної реакції від однієї дози до наступної з виходом величини реакції на плоску ділянку графіка. Уведення агента, як правило, продовжують до тих пір, поки імунна реакція зростає. Досягнення плоскої ділянки вказує на те, що курс лікування може бути припинений або що можуть бути зменшені дози чи частота їх уведення. В інших способах визначають контрольну величину (тобто середню величину і стандартне відхилення) імунної реакції в контрольній групі. Члени контрольної групи, як правило, не проходять попереднього лікування. Після вимірювань одержані величини імунної відповіді на введення пацієнту терапевтичного агента порівнюють з контрольною величиною. Значне збільшення відносно контрольної величини (наприклад, більше одного стандартного відхилення від середнього значення) вказує на позитивний результат лікування. Якщо ж значного збільшення немає, а спостерігається навіть зменшення імунної відповіді, це вказує на те, що результат лікування є негативним. Уведення агента у загальному випадку продовжують до тих пір, пока імунна реакція не зросте відносно контрольної величини. Як і в попередньому випадку, досягнення плоскої ділянки графіка відносно контрольних величин є показником того, що призначене лікування може бути перерване або дози чи частота їх уведення зменшена. В інших способах визначається контрольна величина імунної реакції (наприклад, середнє значення і стандартне відхилення) в контрольній групі, яка була піддана лікуванню терапевтичним агентом і імунна реакція якої досягла плоскої ділянки графіка. Величини імунної реакції, одержані у пацієнта, порівнюють з цією контрольною величиною. Якщо рівень реакції пацієнта не відрізняється помітно від контрольної величини (наприклад, більше одного стандартного відхилення), то лікування може бути перерване. Якщо ж рівень реакції у пацієнта є значно нижчий контрольної величини, то введення агента слід 47 81215 продовжувати. Якщо рівень реакції у пацієнта продовжує залишатися нижче контрольної величини, то це може означати, що потрібно внести зміни в режим лікування, наприклад, використати інший ад'ювант. Можливі також способи, в яких пацієнт в даний час лікування не проходить, але пройшов попередній курс лікування і тепер знаходиться під спостереженням за його імунною реакцією з метою визначення необхідності поновлення лікування. Величину імунної реакції, виміряну у пацієнта, можна привести у порівняння з величиною імунної реакції, одержаною у того ж пацієнта після попереднього курсу лікування. Значне зниження імунної реакції відносно попередніх вимірювань (тобто більше типової межі похибки фупи вимірювань на одному зразку) є показником того, що лікування може бути поновлене. В альтернативному варіанті виміряна у пацієнта величина може бути порівняна з контрольною величиною (середнє значення плюс стандартне відхилення), визначеною в групі пацієнтів після курсу лікування. Можливий також варіант, де виміряна у пацієнта величина порівнюється з контрольною величиною, одержаною в групі пацієнтів, що пройшли профілактичне лікування і не виказують симптомів захворювання, або в групі пацієнтів, що пройшли терапевтичне лікування і показують поліпшення характеристик хвороби. В усіх цих випадках значне зниження величини реакції відносно контрольного рівня (тобто більше стандартного відхилення) є показником того, що лікування даного пацієнта повинно бути поновлене. У якості зразка тканини для аналізу у пацієнта беруть, як правило, кров, плазму, сироватку, слиз слизових оболонок або спинномозкову рідину. Зразок аналізують на виявлення імунної реакції на будь-яку форму пептиду Αβ, зазвичай, Αβ42. Показником імунної реакції може служити наявність, наприклад, антитіл або Т-клітин, що специфічно зв'язуються з пептидом Αβ. ELISAметоди виявлення антитіл, специфічних до Αβ, описані в розділі Приклади. Методи виявлення реактивних Т-клітин були описані вище (див. розд. Темінологія). В деяких способах імунна реакція визначається шляхом тесту на видалення, як описано вище в розд. III. Взятий у пацієнта зразок тканини, що піддається тесту, приводиться в контакт з амілоїдними відкладеннями (наприклад, від миші PDAPP) і фагоцитними клітинами, що несуть Fc-рецептори. Далі ведуть спостереження за видаленням амілоїдного відкладення. Наявність і величина реакції видалення є показником наявності і рівня антитіл, здатних видаляти Αβ в зразку тканини пацієнта. 2. Пасивна імунізація Методика спостережень за пасивною імунізацією у загальному випадку є такою самою, що й для активної імунізації, описаної вище. Проте профіль антитіл, що супроводжує пасивну імунізацію, показує, як правило, проміжний пік концентрації антитіл, за яким слідує експоненціальний спад. Без подальшого введення препарату цей спад наближається до рівней 48 попереднього лікування протягом часу від декількох днів до декількох місяців залежно від періоду напівжиття введених антитіл. Наприклад, період напівжиття деяких антитіл людини складає приблизно 20 днів. В деяких способах спочатку вимірюють базовий рівень антитіла до Αβ у пацієнта перед уведенням препарату. Невдовзі після введення препарату проводять друге вимірювання, визначаючи піковий рівень антитіла, а далі - одне чи більше подальших вимірювань з певними інтервалами для спостереження за зниженням рівня антитіла. Коли рівень антитіла знижується до базового або до певного відсотка піка над базовим рівнем, наприклад, 50%, 25% чи 10%, пацієнту вводять наступну дозу антитіла. В деяких способах пік або послідовно виміряні рівні над базовим порівнюють з еталонними рівнями, визначеними перед тим для встановлення ефективного режиму профілактичного або терапевтичного лікування в інших пацієнтів. Якщо виміряні рівні антитіла є значно нижчими за еталонний рівень (наприклад, нижче середнього значення мінус одне стандартне відхилення еталонного рівня в групі пацієнтів, що отримали лікування), то це означає, що введення антитіла потрібно продовжувати. 3. Діагностичні набори Винаходом також пропонуються діагностичні набори для здійснення описаних ви ще способів діагностики. Такі набори, як правило, включають у себе агент, що специфічно зв'язується з антитілами до Αβ. В набір також може входити мітка. Мітка для виявлення антитіл до Αβ подана в наборі, як правило, у формі мічених антиідіотипових антитіл. Для виявлення антитіл агент може входити в набір у попередньо зв'язаному з твердою фазою стані, наприклад, з ямками мікротитрувальної чашки. Набори можуть містити також інформаційні матеріали з інструкціями щодо користування цими наборами. В такі інформаційні матеріали може входити карта або інші засоби кореляції рівней виміряної мітки з рівнями антитіл до Αβ. Терміном «інформаційні матеріали» охоплюються будь-які друковані чи записані на інших носіях матеріали, що додаються або у будь-який інший спосіб супроводжують набір під час його виготовлення, транспортування, продажу і використання. Це, наприклад, рекламні листки і брошури, пакувальні матеріали, інструкції, аудіо- і відеокасети, комп'ютерні диски, а також написи, друковані безпосередньо на наборах. Винаходом також передбачені діагностичні набори для відображення in vivo. Такий набір включає у себе, як правило, антитіло, що зв'язується з епітопом пептиду Αβ у кращому варіанті на залишках 1-10. Краще, якщо антитіло, що входить в набір, або вже є міченим, або ж в набір включають допоміжний реагент для мічення. Краще, якщо набір забезпечується інструкціями щодо зображення in vivo. VII. Зображення in vivo Винаходом пропонуються способи зображення in vivo амілоїдних відкладень у пацієнта. Такі способи можуть застосовуватися в діагностиці або 49 81215 підтвердженні діагнозу хвороби Альцгеймера або схильності до неї. Наприклад, ці способи можуть застосовуватися до пацієнтів, що виказують симптоми недоумства. Якщо у пацієнта виявлені аномальні амілоїдні відкладення, то він з очевидністю страждає на хворобу Альцгеймера. Дані способи можуть також застосовуватися до пацієнтів, які не виказують симптомів цієї хвороби. Наявність аномальних відкладень амілоїду вказує на схильність до симптоматичної хвороби у майбутньому. Запропоновані способи можуть застосовуватися також у спостереженнях за розвитком хвороби і/або реакції на лікування у пацієнтів, яким раніше був поставлений діагноз хвороби Альцгеймера. Дані способи полягають у введенні реагента, наприклад, антитіла, що зв'язується з Αβ пацієнта, і наступному виявленні цього агента після його зв'язування. Кращі антитіла зв'язуються з відкладеннями Αβ у пацієнта, не зв'язуючись з АРР поліпептидом повної довжини. Антитіла, що зв'язуються з епітопом пептиду Αβ в межах амінокислот 1-10, є особливо прийнятними для застосування. В деяких способах антитіло зв'язується з епітопом в межах амінокислот 7-10 пептиду Αβ. Такі антитіла, як правило, зв'язуються, не викликаючи суттєвої реакції видалення. В деяких способах антитіло зв'язується з епітопом в межах амінокислот 1-7 пептиду Αβ. Такі антитіла, зв'язуючись, зазвичай, викликають в Αβ реакцію видалення. Проте реакції видалення можна уникнути, якщо використовувати фрагменти антитіла, такі, як Fab, в яких бракує постійної ділянки повної довжини. В деяких способах те саме антитіло може служити і як лікувальний і як діагностичний реагент. У загальному випадку антитіла, що зв'язуються з С-кінцевими епітопами залишку 10 пептиду Αβ, не подають такого сильного сигналу, як антитіла, що зв'язуються з епітопами у межах залишків 1-10, причиною чого є, очевидно, те, що С-кінцеві епітопи в амілоїдних відкладеннях є недоступними. Через це такі антитіла є менш прийнятними для застосування. Діагностичні реагенти можна вводити шляхом внутрішньовенних ін'єкцій в тіло пацієнта або безпосередньо в мозок шляхом інтракраніальних ін'єкцій або через отвір, висвердлений у черепі. Доза реагенту при цьому знаходиться в тих самих межах, що й застосовувані у способах лікування. Як правило, реагент тут є мічений, хоча в деяких способах первинний реагент з афінністю до Αβ є неміченим, а поряд з ним використовується вторинний, маркерний реагент, призначений для зв'язування з первинним реагентом. Вибір тої чи іншої мітки залежить від засобів її виявлення. Наприклад, для оптичного виявлення підходящою є флуоресцентна мітка. Парамагнітні мітки є підходящими для томографічних засобів виявлення без хірургічного втручання. Радіоактивні мітки можуть виявлятися за допомогою PET або SPECT. Діагноз встановлюють шляхом порівняння кількості, розмірів і/або інтенсивності мічених локусів з відповідними величинами базового рівня. Величини базового рівня можуть являти собою 50 середні рівні в фупі здорових особин. Величини базового рівня можуть також являти собою рівні, визначені перед тим у того самого пацієнта. Наприклад, величини базового рівня можуть бути визначені у пацієнта до початку його лікування, а порівнюватися з ними будуть величини, одержані у вимірюваннях після цього. У цьому випадку зниження величин порівняно з сигналами базового рівня буде являти собою позитивну реакцію на лікування. Приклади І. Профілактична ефективність Αβ стосовно хвороби Альцгеймера В цих Прикладах описане, ведення пептиду Αβ42 в трансгенних мишей, що надекспресують АРР з мутацією в положенні 717 (APP717V®F) ii таким чином, стають схильними до альцгеймеровської нейропатології. Продукування і характеристики цих мишей (миші PDAPP) описані в роботі [Games et а)., вище]. Ці тварини в їхній гетерозиготній формі починають утворювати відкладення Αβ на шостому місяці життя. На п'ятнадцятому місяці в них вже спостерігаються рівні відкладень Αβ, еквівалентні тим, що є характерними для хвороби Альцгеймера. Мишам РОАРР були зроблені ін'єкції агрегованого Αβ42 або забуференого фосфатом фізіологічного розчину. Агрегований Αβ42 був вибраний за його здатністю індукувати антитіла до численних епітопів Αβ. А. Методика 1. Піддослідні тварини Тридцять гетерогенних самок мишей РОАРР були поділені випадковим чином на такі фупи: 10 мишей, що призначалися для ін'єкцій агрегованим Αβ42 (одна загинула при транспортуванні), 5 мишей для ін'єкцій забуференим фосфатом фізіологічним розчином (PBS) і ад'ювантом або PBS, і 10 неін'єктованих контрольних тварин. П'ять мишей були ін'єктовані пептидами, виведеними із послідовності сироваточного амілоїдного білка (SAP). 2. Готування імуногенів Готування агрегованого Αβ42. Два міліграми Αβ42 (US Peptides, Inc., партія К-42-12) розчинили в 0,9мл води і довели до 1мл додаванням 0,1мл 10 х PBS. С уміш інтенсивно перемішали і поставили на інкубування протягом ночі при температурі 37°С - умови, за яких агрегується пептид. Будь-який невикористаний Αβ зберігали у формі сухого ліо філізованого порошку при -20°С до наступної ін'єкції. 3. Готування ін'єкцій Для кожної ін'єкції 100мкг агрегованого Αβ42 в PBS на мишу емульгували у співвідношенні 1:1 з повним ад'ювантом Фрейнда (CFA) в кінцевому об'ємі 400мкл емульсії для першої імунізації з наступною за нею бустер-ін'єкцією такої ж самої кількості імуногена в неповному ад'юванті Фрейнда (IFA) з двотижневим інтервалом. Дві додаткові дози в IFA робили з місячними інтервалами. Подальші імунізації робили з місячними інтервалами в 500мкл PBS. ін'єкції робили інтраперитонеально. 51 81215 Ін'єкції PBS робили за тією ж самою схемою, і мишам вводили ін'єкції у суміші 1:1 PBS/ад'ювант по 400мкл на мишу або 500мкл PBS на мишу. Ін'єкції SAP робились також за цією схемою дозою 100мкг на ін'єкцію. 4. Титрування кровопускань, препарування тканин і імуногістохімія у мишей Методика описана нижче в розд. Загальні матеріали і методи В. Отримані результати Мишам PDAPP були зроблені ін'єкції агрегованого Αβ42, пептидів SAP або розчину PBS по групах. Була виділена також група неін'єктованих мишей PDAPP, тобто позитивних контрольних зразків. Титри мишей для ін'єкцій агрегованого Αβ42 обстежувались щомісячно, починаючи з четвертої бустер-дози до досягнення мишами однорічного віку. На тринадцятому місяці життя мишей препарували. В усі періоди обстежень 8 із 9 мишей, ін'єктованих агрегованим Αβ42, показали високий титр антитіл, який залишався високим (більше 1/10000) на всіх серіях ін'єкцій. Дев'ята миша мала низький, але такий, що піддавався вимірюванням, титр приблизно 1/1000 (Фіг.1, Табл. 1). Миші, ін'єктовані SAPP, мали титри від 1:1000 до 1:30000 для цього імуногена, і лише одна миша перевищила рівень 1:100000. Миші, ін'єктовані PBS, були титровані проти агрегованого Αβ42 на шостий, десятий і дванадцятий місяці. При 1:100 розрідженні миші, ін'єктовані PBS, як показало титрування їх проти агрегованого Αβ42, перевищували рівень фону в 4 рази лише в одній точці даних, а в усіх інших точках їхні титри не досягали 4-кратного рівня над фоном (Табл. 1). В цих точках SAP-специфічна реакція була зневажливо малою в усіх точках спостережень, де всі титри складали менше 300. В мозку семи із дев'ятьох мишей, ін'єктованих агрегованим Αβ42, амілоїду не було виявлено. У протилежність цьому мозкова тканина у мишей, ін'єктованих SAP і PBS, містила численні амілоїдні відкладення в гіпокампі, а також у лобовій і сингулятній корі головного мозку. Обрис відкладення був подібний тому, що мали контрольні тварини, яким ін'єкції не робили, з характерною заплутаністю уразливих ділянок, таких, наприклад, як зовнішній молекулярний шар зубчастої звилини гіпокампу. Одна миша із групи, ін'єктованої Αβ1-42, мала значно зменшене амілоїдне навантаження, прикріплене до гіпокампу. У іншої міші, обробленої Αβ 1-42, була виявлена ізольована бляшка. Кількісний аналіз зображень амілоїдного навантаження в гіпокампі підтвердив його різке зниження у тварин, яким робили ін'єккції Αβ42 (ΑΝ1792) (Фіг.2). Середні величини амілоїдного навантаження в групі PBS (2,22%) і в контрольній групі необроблених тварин (2,65%) були значно вищі рівней, що спостерігалися у тварин, імунізованих AN 1792 (0,00%, р=0,0005). У протилежність цьому середня величина у тварин, імунізованих петидами SAPP, складала 5,74%. Мозкова тканина у необроблених, контрольних мишей містила численні Αβ-амілоїдні відкладення, візуалізовані Αβ-специфічним моноклональним 52 антитілом (mAb) 3D6 в гіпокампі, а також в ретроспленіальній корі. Подібна картина амілоїдних відкладень спостерігалася також у мишей, імунізованих SAPP або PBS (Фіг.2). Крім того, в останніх трьох групах мала місце характерна для хвороби Альцгеймера заплутаність уразливих субділянок мозку, таких, як зовнішній молекулярний шар зубчастої звилини гіпокампу, в усі х ци х трьох гр упах. Мозок тварин, який не містив відкладень Αβ, не мав також і нейритних бляшок, які, зазвичай, спостерігалися у мишей PDAPP з АРР антитілом 8Е5 людини. Всі зразки мозку решти гр уп (яким робили ін'єкції SAP, PBS і яким ін'єкцій не робили) мали численні нейритні бляшки, типові для необроблених мишей PDAPP. Невелика кількість нейритних бляшок мала місце в одної миші, обробленої AN 1792, а один кластер дистрофічних нейритів був виявлений у др угої миші, обробленої AN1792. Аналіз зображень гіпокампу, як показано на Фіг.3, продемонстрував фактичне видалення дистрофічних нейритів у мишей, оброблених AN 1792 (середній рівень 0,00%) порівняно з реципієнтами PBS (середній рівень 0,28%, р=0,0005). Астроцитоз, характерний для супроводжуваних бляшками запалень, в зразках мозку тварин, ін'єктованих Αβ1-42, також був відсутній. Зразки мозку мишей інших груп містили численні кластеризован! GFAP-позитивні астроцити, типові для супроводжуваного Αβбляшками гліозу. Підгрупа GFAP-прореагованих препаратів була забарвлена для зчитування Тіофлавіном S для локалізації відкладень Αβ. GFAP-позитивні астроцити зв'язувалися з Αβбляшками у тварин, оброблених SAP, PBS і необроблених, контрольних тварин. Такого зв'язування не було виявлено у мишей, оброблених Αβ1-42, які не мали бляшок, у той час як в одної з мишей, оброблених ΑΝ1792, спостерігався мінімальний, зв'язаний з бляшками гліоз. Аналіз зображень, як показано на Фіг.4 для ретроспленіальної кори головного мозку, підтвердив, що зниження астроцитів із середнім рівнем 1,56% був значним у тварин, оброблених AN 1792, порівняно із середніми величинами, що перевищили 6% у тварин, імунізованих пептидами SAP, фізіологічним розчином PBS і у неімунізованих тварин (p=0,0017). Асоційована з бляшками імунореактивність головного комплексу гістосумісності МНС II, яку виявила підгрупа мишей, імунізованих ін'єкціями Αβ1-42 і PBS, була відсутньою у мишей, котрим робили ін'єкції Αβ1-42, що співпадає з відсутністю пов'язаної з Αβ запальної реакції. Зрізи мозку мишей були також піддані реакції з mAb, специфічним до моноклонального антитіла, специфічного до клітинного поверхневого білка МАС-1. Білок МАС-1 (CD11b) є членом родини інтегрину й існує як гетеродимер з CD18. Комплекс CD11D/CD18 є наявним на моноцитах, макрофагах, нейтрофілах і природних клітинахкілерах [Мак and Simard]. Резидентний тип МАС-1 реактивних клітин в мозку є, очевидно, мікроглією, 53 81215 якщо виходити з подібної фенотипової морфології на імунореактивних зрізах МАС-1. Зв'язане з бляшками мічення МАС-1 було нижчим в зразках мозку мишей, оброблених AN 1792, порівняно з контрольною групою, котрій робилися ін'єкції PBS, - факт, що збігається з відсутністю Αβ-індукованої запальної реакції. С. Висновок Відсутність Αβ-бляшок, а також реактивних, нейронних і гліотичних змін в мозку мишей, яким робились ін'єкції Αβ1-42, вказує на те, що в мозку цих тварин амілоїдних відкладень чи зовсім не було, чи їх було дуже мало, як і не було патологічних наслідків, таких, як гліоз і невритна патологія. Миші PDAPP, оброблені Αβ1-42, показали практично таку ж відсутність патології, що і контрольні, нетрансгенні миші. Отже ін'єкції Αβ1-42 є дуже ефективними у запобіганні утворенню відкладень і видаленні Αβ людини із мозкової тканини, як і у виключенні подальших нейронних і запальних дегенеративних змін. Таким чином, уведення пептиду Αβ може дати як профілактичний, так і терапевтичний позитивний результат у відверненні хвороби Альцгеймера. II. Дослідження реакції на дозу Групи п'ятитижневих самок мишей шведський Вебстер (Swiss Webster) (кількість особин у групі N=6) були імунізовані 300, 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,4 або 0,13мкг Αβ, приготованого в препараті з CFA/IFA і введеного інтраперитонеальним шляхом. Три дози вводили з двотижневими інтервалами, а після них, через місяць уводили четверту дозу. Першу дозу емульгували з CFA, а решту доз - з IFA. Через 4-7 днів після кожної імунізації, починаючи з другої дози, тваринам робили кровопускання для вимірювання титрів антитіл. Тваринам у підгруппі з трьох груп, імунізованих 1, 33 і 300мкг антигена, робили додаткове кровопускання приблизно з місячними інтервалами протягом 4 місяців після четвертої імунізації для спостереження за спадом реакції антитіл залежно від доз імуногенних препаратів. Ці тварини отримали п'яту, заключну імунізацію на сьомий місяць від початку досліджень. Через тиждень після цього вони були препаровані для вимірювання імунних гуморальних реакцій на AN 1792 і проведення токсикологічного аналізу. У межах доз від 300 до 3,7мкг спостерігалося падіння реакції на дозу і відсутність реакції за двох найнижчих доз. Середні титри антитіл складали приблизно 1:1000 після трьох доз і приблизно 1:10000 після чотирьох доз 11-300мкг антигена (Фіг.5). Титри антитіл різко зростали в усій групі мінімальної дози з підвищенням GMT у 5-25 разів після третьої імунізації. Після цього спостерігалися низькі імунні реакції навіть у реципієнтів, що отримали 0,4мкг ін'єкції. Групи, ін'єктовані 1,2 і 3,7мкг, мали титри, порівняні з GMT приблизно 1000, а чотири найвищі дози зібралися разом з GMT приблизно 25000, за винятком групи дози 33мкг, де GMT був мінімальний і складав 3000. Після четвертої імунізації зростання титру антитіл у більшості груп було значно меншим. Тут спостерігався чіткий відгук на дозу в групах з 54 мінімальною дозою антигена від 0,14мкг до 11мкг, який змінювався від невиявленого антитіла у реципієнтів 0,14мкг до GMT 36000 у реципієнтів 11мкг. Тут також титри в чотирьох групах найвищих доз від 11 до 300мкг зібрались разом. Таким чином, після двох імунізацій титр антитіл залежав від дози антигена у широкому діапазоні від 0,4 до 300мкг. У третьої імунізації титри від чотирьох найвищих доз мали порівняні величини, і після додаткової імунізації залишалися на плоскій ділянці кривої. Через місяць після четвертої імунізації титри в групі 300мкг були у 2-3 рази вищими, ніж виміряні на зразках крові, відібраних через 5 днів після імунізації (Фіг.6). Це спостереження свідчить про те, що пік вторинної імунної реакції настає більш ніж через 5 днів після імунізації. Помірніший (50%) зріст спостерігався у цей час в гр упі 33мкг дози. В групі 300мкг дози через два місяці після останньої дози GMT ступінчасто знизився приблизно на 70%. Ще через місяць спад склав 45% (100мкг) і приблизно 14% у доз 33 і 11мкг. Таким чином, швидкість спаду в титрах циркулюючи х антитіл після припинення імунізації є, очевидно, двофазною зі ступінчастим спадом у перший місяць після пікової реакції і більш помірною швидкістю зніження після цього. Титри антитіл і кінетика імунної реакції досліджених у даному експерименті мишей типу шведський Вебстер були подібні до тих, що спостерігалися у молодих особин гетерозиготних трансгенних мишей PDAPP, імунізованих паралельно. Дози препаратів, здатні індукувати імунну реакцію в людей, є, як правило, такими самими, що й аналогічні дози у мишей. III. Відбір за терапевтичною ефективністю щодо розвиненої хвороби Альцгеймера Метою цих досліджень було проведення випробувань Імуногенних агентів за їхньою активністю щодо припинення або повернення у зворотному напрямку розвитку нейропатологічних характеристик хвороби Альцгеймера у старши х за віком тварин. Імунізацію пептцдом Αβ довжиною в 42 амінокислоти (AN 1792) почали у той час, коли амілоїдні бляшки вже з'явилися в мозку мишей PDAPP. Протягом цих досліджень у мишей PDAPP, що не отримали ін'єкцій, розвилися численні нейродегенеративні зміни, аналогічні тим, що спостерігаються при хворобі Альцгеймера [Games et al., див. вище; Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1550-1555 (1997)]. Відкладення Αβ в амілоїд них бляшках асоціюється з дегенеративною нейронною реакцією із аберантних аксонних і дентритних елементів, що звуться дистрофічними нейритами. Амілоїдні відкладення, що оточуються дистрофічними нейритами і їх містять, звуться нейритними бляшками. Як у мишей із симптомами хвороби Альцгеймера, так і в мишей PDAPP дистрофічні нейрити мали чітку глобулярну стр уктуру і виказували імунореактивність з планшетом антитіл, що розпізнають АРР і цитокаркасні компоненти, і відображали комплекс субклітинних 55 81215 дегенеративних змін на надструктурному рівні. Ці характеристики дозволяють здійснювати щодо відповідних хвороб селективні і відтворювані вимірювання утворення нейритних бляшок в мозку РОАРР. Дистрофічний нейронний компонент нейритних бляшок PDAPP легко візуалізується антитілом, специфічним до АРР людини (моноклональним антитілом 8Е5), і просто вимірюється за допомогою комп'ютерного аналізу зображень. Таким чином, окрім вимірювань впливу AN 1792 на утворення амілоїд них бляшок, автори вивчали вплив цієї обробки на розвиток нейритної дистрофії. Астроцити і мікроглії є не-нейронними клітинами, що реагують на ступінь нейронного ушкодження і віддзеркалюють його. GFAPпозитивні астроцити і МНС-ІІ-позитивні мікроглії, зазвичай, спостерігаються при хворобі Альцгеймера, і їх активація по мірі розвитку цієї хвороби збільшується. Таким чином, авторами були проведені також дослідження розвитку реактивного астроцитозу і мікрогліозу у мишей, оброблених AN 1792. А. Матеріали і методи Сорок вісім гетерозиготних самок мишей PDAPP віком від 11 до 11,5 місяців, отримані від фірми Charles River, були випадковим чином поділені на дві групи: 24 тварини для імунізації 100мкг AN1792 і 24 тварини для імунізації PBS, кожний з ад'ювантом Фрейнда. По досягненні приблизно 15-місячного віку групи AN 1792 і PBS були знов поділені. У 15-місячному віці приблизно половина кожної групи AN1792- і PBS-імунізованих тварин були піддані ейтаназії (n = 10 і 9 відповідно), а решту тварин продовжували імунізувати до досягнення ними приблизно 18місячного віку (n = 9 і 12 відповідно). У процесі досліджень всього померло 8 тварин (5 тварин AN1792 і 3 тварини PBS). Окрім імунізованих тварин в дослідження були включені необроблені миші PDAPP віком 1 рік (n = 10), 15 місяців (n = 10) і 18 місяців (n = 10) для порівняння в аналізі ELISA за рівнями Αβ і АРР в мозку; однорічні тварини були також включені в імуногістохімічний аналіз. Методика досліджень в цілому була такою, як описано в Прикладі 1. У приготуванні антигена для шести імунізацій тварин у 15-місячому віці були використані партія 12 пептидів від US Peptides і партія МЕ0339 пептиду AN1792 від California Peptides. Партії МЕ0339 І МЕ0439 від California Peptides були використані в трьох додаткових імунізаціях, що проводились тваринам у віці між 15 і 18 місяцями. Для здійснення імунізації пептид AN1792 у кількості 100мкг у 200мкл розчину PBS або тільки PBS були емульговані у співвідношенні 1:1 (об.) з повним ад'ювантом Фрейнда (CFA), неповним ад'ювантом Фрейнда (IFA) або PBS в кінцевому об'ємі 400мкл. Першу імунізацію робили з ад'ювантом CFA, наступні 4 дози вводили з ад'ювантом IFA, а заключні 4 дози - тільки PBS без добавлення ад'юванту. Вищеперелічені дев'ять імунізацій були зроблені протягом семимісячного періоду з двотижневим інтервалом для перших трьох доз і чотиритижневим інтервалом для решти 56 ін'єкцій. Група тварин, яка була імунізована чотири місяці, одержала лише перші 6 імунізацій і була піддана ейтаназії у п'ятнадцятимісячному віці. В. Результати 1. Вплив ін'єкцій AN 1792 на амілоїд не навантаження Результати імунізації пептидом AN 1792 на кортикальне амілоїд не навантаження визначені кількісним аналізом зображень і показані на Фіг.7. Середня величина кортикального амілоїд ного навантаження становила 0,28% в групі неімунізованих 12-місячних мишей PDAPP типовий рівень бляшок у мишей на початку досліджень. У 18-місячному віці амілоїдне навантаження зросло більш ніж в 17 разів і досягло 4,87% у тварин, оброблених PBS, у той час як у тварин, імунізованих AN 1792, спостерігалося значне зниження амілоїдного навантаження, яке становило лише 0,01%, тобто значно менше, ніж у 12-місячних неімунізованих тварин і у тварин як 15-місячного, так і 18місячного віку, оброблених PBS. Амілоїдне навантаження значно зменшилося у реципієнтів AN1792 як у 15-місячному (96% зниження; р=0,003), так і у 18-місячному (зниження >99%; р=0,0002) віці. Утворення кортикальних амілоідних відкладень у мишей РОАРР, як правило, починалося у лобовій і ретроспленіальній корах (RSC) головного мозку і прогресувало далі у вентрально-бічному напрямку, залучаючи до цього процесу скриневу й енторхінальну кори (EC). У 12місячних мишей - приблизний вік, в якому починалися ін'єкції AN1792, -амілоїдні відкладення в EC були або дуже малими або нульовими. За чотири місяці ін'єкцій AN1792 амілоїдні відкладення значно зменшилися в RSC, а прогресуюче залучення EC внаслідок обробки пептидом AN 1792 було повністю виключене. Останнє з цих спостережень свідчить про те, що AN 1792 повністю зупиняє розвинення амілоїду, який, як завжди, захопив би темпоральну і вентральну кори головного мозку, а також зупиняє або, можливо, повертає у зворотному напрямку розвинення відкладень в RSC. Значний вплив імунізації пептидом AN1792 на розвинення кортикального амілоїдного навантаження у мишей PDAPP був продемонстрований також в групі 18-місячних тварин, імунізація яких тривала 7 місяців. У тварин цієї групи, імунізованих AN1792, кортикальний амілоїд був практично повністю відсутній, дифузійних бляшок не було зовсім, а кількість густи х відкладень зменшилася. 2. Клітинні і морфологічні зміни, пов'язані з обробкою AN 1792 В ділянках мозку, де зазвичай утворюються амілоїдні відкладення, була виявлена популяція Αβ-позитивних клітин. Слід підкреслити, що в декількох зразках мозку реципієнтів AN 1792 було знайдено дуже мало, а іноді не знайдено зовсім зовнішньоклітинних кортикальних аміло'їдних бляшок. Очевидно, що імунореактивність Αβ зосереджена, головним чином, в клітинах з великою лобулярною або скупченою сомою. З 57 81215 фенотипічного погляду ці клітини нагадують активовані мікроглії або моноцити. Вони були імунореактивними з антитілами, що розпізнають ліганди, експресовані активованими моноцитами і мікрогліями (МНС II і CD11b) і були випадковим чином зв'язані зі стінками і порожнинами кровоносних судин. Порівняння близько один до одного розташованих зрізів, мічених Αβ- і МНС ІІспецифічними антитілами, виявило, що обома класами антитіл були розпізнані подібні одна одній конфігурації цих клітин. Детальне обстеження зразків мозку, обробленого AN 1792, показало, що МНС ІІ-позитивні клітини були зосереджені поблизу обмеженого амілоїду, що залишився в цих тваринах. У застосованих умовах фіксації ці клітини не були імунореактивними до антитіл, які розпізнають Т-клітинні (CD3, CD3e) або В-клітинні (CD45RA, CD45RB) ліганди або лейкоцитоспільний антиген (CD45), але були реактивними до антитіла, що розпізнає лейкозіалін (CD43), котрий вступає в перехресні реакції з моноцитами. У жодної з піддослідних тварин, оброблених PBS, таких клітин знайдено не було. У мишей РОАРР незмінно розвивалося важке амілоїдне відкладення у зовнішньому молекулярному шарі гіпокампової зубчастої звилини. Це відкладення утворювало чітку стрічку в перфоруючому проході - субділянці, яка незмінно містить амілоїдні бляшки при хворобі Альцгеймера. Характерний вигляд цих відкладень у мишей, оброблених PBS, нагадував ті, що раніше спостерігалися у необроблених тварин PDAPP. Це амілоїдне відкладення складалося як із дифузійних, так і зі згущених бляшок у безперервній стрічці. У протилежність цьому в багатьох зразках мозку мишей, оброблених AN 1792, ця картина була зовсім іншою. Тут гіпокампове амілоїдне відкладення більш не містило дифузійного амілоїду, а стрічкова конфігурація була повністю зруйнована. Замість цього спостерігалася велика кількість незвичайних крапкових структур, які реагували з антитілами до Αβ і декілька із яких були, очевидно, клітинами, що містили амілоїд. Поблизу зовнішньоклітинного амілоїду у тварин, імунізованих ΑΝ1792, часто спостерігалися МНС ІІ-позитивні клітини. Ця картина сполучення Αβ-позитивних клітин з амілоїдом була дуже схожою в декількох зразках мозку мишей, оброблених AN 1792. Розподіл цих моноцитних клітин був обмежений безпосередньою близкістю амілоїдного відкладення і був цілком відсутній в інших ділянках мозку, чистих від бляшок Αβ. Конфокальні мікроскопічні обстеження МНС II- і Αβ-мічених зрізів показали, що бляшковий матеріал містився в багатьох моноцитних клітинах. Кількісний аналіз зображень МНС Іі і МАС 1мічених зрізів показав тенденцію до збільшення імунореактивності в RSC і гіпокампі мишей, оброблених AN 1792 порівняно з групою PBS, яка досягла значної, виміряної за допомогою МАС 1, реактивності в гіпокампі. 58 Розглянуті результати свідчать про активне, клітинно-опосередковане видалення амілоїду на ділянках мозку, навантажених бляшками. 3. Вплив AN 1792 на рівні Αβ; твердофазний імуноферментний аналіз (а) Кортикальні рівні У неімунізованих мишей PDAPP середній рівень загального Αβ в корі головного мозку на дванадцятому місяці складав 1600нг/г і зростав до 8700нг/г по досягненню ними п'ятнадцяти місяців (Табл. 2). На 18 місяці ця величина становила 22000нг/г і зростала більш ніж десятикратно протягом часу тривання експерименту. Тварини, оброблені PBS, мали рівень загального Αβ 8600нг/г на 15 місяці, який зростав до 19000нг/г на 18 місяці. У протилежність цьому тварини, імунізовані AN 1792, мали на 15 місяці на 81% менше загального Αβ (1600нг/г), ніж тварини, імунізовані PBS. Значно менша кількість (р=0,0001) загального Αβ (5200 нг/г) була знайдена у 18 місячних тварин при порівнянні груп, оброблених AN 1792 І PBS (Табл. 2), що показало 72% зниження загального Αβ, який би в іншому разі був наявним. Аналогічні результати були отримані при порівнянні кортикальних рівнів Αβ42 і, зокрема, те, що гр упа, імунізована ΑΝ1792, містила набагато менше Αβ42, але у цьому випадку різниця між AN 1792- і PBS-групами була значною як у 15 місячних тварин (р=0,04), так і у 18 місячних тварин (р=0,0001, Табл. 2). (b) Гіпокампові рівні У необроблених мишей PDAPP середні ппокампові рівні загального Аb на 12 місяці віку становили 15000нг/г і зростали до 51000нг/г на 15 місяці і далі до 81000нг/г на 18 місяці (Табл. 3). Подібно цьому тварини, імунізовані PBS, показали рівні Αβ, що складали 40000нг/г і 65000нг/г на 15 і 18 місяцях відповідно. Тварини, імунізовані AN 1792, мали менші рівні загального Αβ, які складали, зокрема, 25000нг/г і 51000нг/г на 15 місячному і 18 місячному віці відповідно. Група 18 місячних особин, імунізованих AN 1792, мала значно менші кількості Αβ, ніж група, оброблена PBS (р=0,0105; Табл. 3). Вимірювання Αβ42 дали аналогічні результати і, зокрема, те, що в групі, обробленій AN 1792, рівні Αβ були значно меншими, ніж в групі PBS (39000нг/г і 57000нг/г відповідно; р=0,002) у 18 місячному віці (Табл. 3). 59 81215 (с) Церебелярні рівні У 12 місячних неімунізованих мишей PDAPP середній церебелярний рівень загального Αβ складав 15нг/г (Табл. 4). На 15 місяці життя він зростав до 28нг/г, а на 18 місяці - до 35нг/г. Тварини, оброблені PBS, показали середній рівень загального Αβ 21нг/г на 15 місяці і 43нг/г на 18 місяці. Тварини, оброблені AN 1792, мали 22нг/г загального Αβ на 15 місяці і значно менше (р=0,002) на 18 місяці (25нг/г) порівняно з відповідною групою PBS (Табл. 4). 4. Вплив обробки пептидом AN 1792 на рівні АРР ΑΡΡ-α і молекули АРР повної довжини містили всю або частину послідовності Αβ і, таким чином, могли зазнати впливу від генерування АN1792спрямованої імунної реакції. В дослідженнях, проведених на сьогоднішній день, невеликий зріст рівнів АРР був відмічений як нейропатологічний у мишей PDAPP. В корі головного мозку рівні як ΑΡΡ-α/FL (FL: full length - повної довжини), так і ΑΡΡ-α не зазнали значних змін внаслідок обробки, за винятком того, що ΑΡΡ-α знизився, на 19% у 18місячній точці вимірювань у тварин, імунізованих AN 1792, порівняно з групою, обробленою PBS. Величини АРР у 18-місячних тварин, імунізованих AN1792, не відрізнялися у значній мірі від величин, отриманих у 12-місячній і 15-місячній неімунізованій і 15-місячній імунізованій PBS групах. В усі х випадках величини АРР залишалися в межах, що вважаються нормальними для мишей PDAPP. 5. Вплив імунізації пептидом AN1792 на нейродегенеративну і гліотичну патології Нейритне бляшкове завантаження в лобовій корі мишей, імунізованих AN1792, було значно нижчим порівняно з групою PBS як у 15-місячному (84%; р=0,03), так і у 18-місячному (55%; р=0,01) віці (Фіг. 8). Середня величина нейритного бляшкового завантаження зростала від 0,32% до 0,49% в групі PBS на відтинку між 15 і 18 місяцями віку. Це контрастувало зі суттєво зниженим розвитком нейритних бляшок в гр упі, імунізованій AN 1792, де середні величини нейритного бляшкового навантаження складали 0,05% і 0,22% у 15місячній і 18- місячній групах відповідно. Імунізація пептидом AN1792 показала себе як така, що добре переноситься організмом 60 реципієнта, а реактивний астроцитоз був також значно зменшений у RSC мозку мишей, імунізованих AN1792, порівняно з групою PBS як у 15-місячному (56%; р=0,011), так і у 18-місячному (39%; р=0,028) віці (Фіг.9). Середні величини відсотку астроцитозу в групі PBS зросли на відтинку від 15 до 18 місяців від 4,26% до 5,21%. Імунізація пептидом AN1792 приглушує розвинення астроцитозу в обох вікових точках до 1,89% і 3,2% відповідно. Це свідчить про те, що нейропіль не був ушкоджений процесом видалення амілоїду. 6. Гуморальні імунні реакції Як зазначалося вище, був проведений експеримент, в якому 11-місячні гетерозиготні миші PDAPP (кількістю N = 24 особини) отримали серію із 5 імунізацій 100мкг AN1792, емульгованого з ад'ювантом Фрейнда й уведеного інтраперитонеальним шляхом на 0, 2, 4, 8 і 12 тижні, і 6 імунізацій тільки PBS (без ад'юванту Фрейнда) на 16-ому тижні. У якості негативних контрольних зразків використовувалась паралельна група із 24 трансгенних мишей аналогічного віку, які отримували імунізації PBS, емульгованого з такими самими ад'ювантами й уведеного за такою самою схемою. Тваринам робили кровопускання через 3-7 днів після кожної імунізації, починаючи з другої дози. Імунну реакцію на AN1792 виміряли за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу ELISA. Середні геометричні титрів (GMT) тварин, імунізованих AN 1792, складали приблизно 1900, 7600 і 45000 після другої, третьої і останньої (шостої) доз відповідно. Після шостої імунізації у контрольних тварин Αβспецифічного антитіла зареєстровано не було. Приблизно половина тварин була піддана оброблянню протягом ще 3 місяців і одержала імунізацію приблизно на 20, 24 і 27 тижнях. Усі ці дози уводилися лише в PBS-носії без ад'юванта Фрейнда. Протягом усього цього часу середні титри антитіл залишалися незмінними. Таким чином, титри антитіл залишалися стабільними на відтинку від четвертого до восьмого кровопускання, що відповідало періоду від п'ятої до дев'ятої ін'єкції. Для визначення того, чи викликані імунізацією Αβ-специфічні антитіла, виявлені у сироватці мишей, оброблених AN 1792, були також пов'язані з відкладеним в мозку амілоїдом, підгрупа зрізів від мішей, імунізованих AN 1792 і PBS, були піддані реакції з антитілом, специфічним до мишачого IgG. У протилежність групі PBS, Αβбляшки в зразках мозку, імунізованого AN 1792, були покриті ендогенним IgG. Така різниця між двома групами спостерігалася як у 15-місячній, так і у 18-місячній групах. Особливо вражаючим був брак мічення в групі PBS, незважаючи на наявність важкого амілоїдного навантаження у цих мишей. Ці результати показують, що імунізація синтетичним білком Αβ генерує антитіла, що розпізнають і зв'язуються in vivo з Αβ в амілоїдних бляшках. 7. Клітинно-опосередковані імунні реакції У 9 мишей PDAPP 18-місячного віку, імунізованих ΑΝ1792, і 12 мишей PDAPP того ж