Пептид

1. Застосування пептиду або його фармацевтично прийнятної солі формули І: ((X)1(Y)m)n (I), де пептид містить 3-200 амінокислот, та де 1 та m - цілі числа від 0 до 10; n - ціле число від 1 до 10; X та Y є однаковими та є аргініном, у виробництві медикаменту для лікування грибкової інфекції. 2. Застосування за пунктом 1, де пептид містить 3100 амінокислот. 3. Застосування за пунктом 2, де пептид містить 350 амінокислот. 4. Застосування за пунктом 3, де пептид містить 450 амінокислот. 5. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де інфекція є дерматофітною інфекцією. 6. Застосування за п. 5, де інфекція є спричиненою грибковим патогеном виду Trichophyton spp. 7. Застосування за п. 6, де грибковим патогеном є Trichophyton interdigitale. 8. Застосування за п. 6, де грибковим патогеном є Trichophyton rubrum. 9. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де грибкова інфекція є шкірною інфекцією. 10. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, де інфекція є оніхомікозом. UA (21) a200701921 (22) 18.08.2005 (24) 25.11.2011 (86) PCT/GB2005/003245, 18.08.2005 (31) 0418414.9 (32) 18.08.2004 (33) GB (31) 11/079,795 (32) 14.03.2005 (33) US (46) 25.11.2011, Бюл.№ 22, 2011 р. (72) О'НІЛ ДЕБОРА, GB (73) НОВАБІОТІКС ЛІМІТЕД, GB (56) US2003087827 A1, 08.05.2003. WO9840401 A, 17.09.1998. EP1502949 A, 02.02.2005. HAYNIE S L ET AL: "ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF AMPHIPHILIC PEPTIDES COVALENTLY BONDED TO A WATER-INSOLUBLE RESIN" ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 39, no. 2, 1 February 1995 (1995-02-01), pages 301-307. MILLER C T ET AL: "The synthesis and screening of 1,4,5,8-naphthalenetetracarboxylic diimide-peptide conjugates with antibacterial activity" BIOORGANIC AND MEDICINAL CHEMISTRY 2001 UNITED KINGDOM, vol. 9, no. 8, 2001, pages 2015-2024. BESSALLE R ET AL: "AUGMENTATION OF THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF MAGAININ BY POSITIVE-CHARGE CHAIN EXTENSION" C2 2 (19) 1 3 ними мостами. Вони знайдені у рослинах, комахах і різних ссавцях. У людей два класи знайдені як такі, що відрізняються один від одного в розташуванні у просторі і зв'язками між шістьма залишками цистеїну. Перший із цих класів - альфадефензини (шість типів), що були виділені з нейтрофілів (HNP 1-4, пептид людського нейтрофілу) і в клітинах Панета шлунково-кишкового тракту (альфа-дефензини 5 і 6). Другий клас, бетадефензини, є більш численним, більш основним і усюди експресується слизовою оболонкою в межах епітеліоцитів і кератиноцитів, що вистилають та/або містяться, та/або присутні в межах травного, респіраторного і урогенітального трактів і шкіри. HBD1(ЛBД1) (людський бета-дефензин 1) секретується конститутивно і людські бета-дефензини 2, 3 і 4 (ЛБД2, ЛБД3 і ЛБД4) продукуються у відповідь на інфекцію або запалення. Експресія і секреція ЛБД2 ініційована бактеріальною стимуляцією, особливо джгутиковими бактеріями (Harder et al, Nature 1997; 387:861) та IL1 [альфа] та IL1 [бета] (Інтерлейкін 1) (Liu et al, J Invest Dermatol 2002; 118; 275-281). У деяких сайтах тканин, альфафактор некрозу пухлин (TNF альфа) і ліпополісахарид (ЛПС) можуть також відігравати роль у стимулюванні експресії ЛБД2. In vitro експерименти показали, що ЛБД2 активний проти Грамнегативних бактерій, таких як Escherichia coli (E. coli) і в меншій мірі, проти Грам-позитивних бактерій, таких як Streptococcus pneumoniae (Str. pneumoniae). ЛБД2 також демонструє кілерну активність in vitro проти Candida albicans. Експресія і секреція ЛБД3 індукується бактеріальною стимуляцією, TNF-альфа й особливо гамаінтерфероном (IFN), що також мають загальну · властивість залучатися в запальні процеси. Окрім потужної, конститутивної і регулювальної властивості, бета-дефензини забезпечують широкого спектру антимікробний захист, ці молекули, зокрема, ЛБД2 також мають здатність мобілізувати адаптивну силу імунної відповіді через хемоктатичні ефекти на незрілі дендритні клітини і Тлімфоцити (Yang et al, Science 1999; 286: 525-528). Маються дані, що бета-дефензини не тільки забезпечують захист проти інфікування патогенними мікробами, але і є ключовими в регулюванні і підтримці оптимальної щільності і розмаїтості сукупності первинного коменсала мікробних екосистем, таких як тих, що на шкірі і в межах шлунковокишкового і генітального трактів (Ganz, T, Nat Rev Immunol. 2003 3(9): 710-20). Механізм активності бета-дефензинів - такий, що вони є в значній мірі є нетоксичними до клітин хазяїна при активних концентраціях. Тому, бетадефензини були залучені як потенційні мішені для терапії широкого спектра інфекцій. Однак, природні форми дефензинів технічно проблемні щодо продукування в рекомбінантих системах внаслідок низького виходу. Крім того, зростають докази, що бета-дефензини є потужними запальними сполуками внаслідок їхньої хемотактичної активності (Yang et al, Science 1999; 286: 525-528; Van Wetering et al. Inflamm Res. 2002; 51(1): 8-15; Niyonsaba et al. Curr Drag Targets Inflamm Allergy 2003; 2(3): 224-231), Узяті разом, ці фактори роб 96564 4 лять природні дефензини неприйнятними для терапевтичного застосування. Бета-дефензини також є високочутливими щодо солі (Porter et al., Infect. Immun. 1997; 65(6): 2396-401; Bals et al. J Clin Invest. 1998; 102(5): 87480; Valore et al., J Clin Invest 1998; 101(8): 1633-42; Goldmann et al., Cell 1997; 88(4): 553-609; Singh et al., Proc Natl Acad Sci USA 95(25): 14961-6). З цієї причини, бета-дефензини не можуть забезпечити антимікробний захист при станах, таких як кістозний фіброз, хоча респіраторний епітелій продукує велику кількість бета-дефензинів у відповідь на персистентні бактеріальні інфекції, пов'язані з цим станом, вони неактивні внаслідок дисбалансу в іонному транспорті через респіраторні епітеліальні мембрани, що приводить до збільшеної катіонної + резорбції (Na особливо) і збільшеної секреції хлориду (Donaldson SH and Boucher RC. Curr. Opin. Pulm. Med. 2003 Nov;9(6):486-91; Davies JC. Pediatr Pulmonol Suppl. 2004;26:147-8). Тому є потреба у подальших агентах, що можуть використовуватися для лікування мікробних інфекцій. Винахідники ідентифікували пептиди, що, несподівано, поліпшили антимікробну активність природних дефензинів. Згідно з першим аспектом винаходу, забезпечений пептид, що включає від 3 до приблизно 200 D та/або L амінокислот, що можуть бути однаковими або різними, причому амінокислоти вибрані з групи, що складається з гідрофобних амінокислот та/або катіонних амінокислот. Пептид може включати від 3 до приблизно 100 D та/або L амінокислот, наприклад 3-50 амінокислот D та/або L амінокислоти, включаючи від 4 до приблизно 50 D та/або L-амінокислот. Пептиди винаходу корисні, між іншим, у лікуванні або профілактиці мікробних інфекцій. У подальшому аспекті винаходу, забезпечений пептид, що включає амінокислоти формули І: ((Х)1(Y)m)n (I), де 1 та m - цілі числа від 0 до 10, наприклад від 0 до 5; n - ціле число від 1 до 10; X і Υ, які можуть бути однаковими або різними, амінокислота вибрана з групи, що складається з гідрофобних амінокислот та/або катіонних амінокислот. У переважному аспекті винаходу, пептид включає від 3 до 200 амінокислот, наприклад 3, 4, 5, 6 або 7-100 амінокислот, включаючи 3, 4, 5, 6, або від 7 до 20, 25, 30, 35, 40 або 42 амінокислот. Пептид згідно з винаходом може включати 100-200 амінокислот, 27-100 амінокислот, 28-86 амінокислот, 7-27 амінокислот або 3-14 амінокислот. Переважно, пептиди включають 3-15 амінокислот, наприклад 3-7 амінокислот. В подальшому переважному аспекті, пептиди, крім того, включають один або більше залишків цистеїну, наприклад до 6 залишків цистеїну, так як 1, 2, 3, 4, 5 або 6 залишків цистеїну. В переважному аспекті винаходу забезпечений пептид, що включає амінокислоти формули II: C((X)1(Y)m)nC((X)1(Y)m)n (II), 5 96564 де С - цистеїн, 1, n та m - ціле число від 0 до 10; і X і Y, що можуть бути однаковими або різними, амінокислота, вибрана з групи, що складається з гідрофобних амінокислот та/або катіонних амінокислот. В подальшому переважному аспекті винаходу, пептид включає амінокислоти формули III: С((Х)1(Y)m)nC((X)1(Y)m)nC((X)1(Y)m)nC((X)1(Y)m)nС(III), де С, X, Υ, 1, m та n як визначені тут. В усе ж ще переважному аспекті винаходу, пептид включає амінокислоти формули IV: С((Х)1(Y)m)nC((X)1(Y)m)nC((X)1Y)m)nC((X)1(Y)m)nCC(IV), де С, X, Υ, 1, m та n як визначені тут. Оскільки пептиди винаходу більш прості по структурі, ніж природні бета-дефензини, їх просто й ефективно одержати. Пептиди також є суттєво не чутливими щодо солі і не гепатотоксичними. Крім того, їхній механізм активності є більше фізичним, ніж метаболічним (тобто пряме руйнування мембрани проти таргетингу компонентів метаболічних шляхів), мінімізує, якщо не виключає, імовірність, що мікроби-мішені можуть розвити резистентність до цих антимікробних агентів. Як відомо фахівцю в даній галузі, амінокислоти можуть бути віднесені до різних класів, що залежить насамперед від хімічних і фізичних властивостей бічного ланцюга амінокислоти. Наприклад, деякі амінокислоти, як вважають, є гідрофільними або полярними амінокислотами і інші, як вважають, є гідрофобними або неполярними амінокислотами. Як використовується тут термін "гідрофобні" і "катіонні" можуть відноситись до амінокислот, що мають гідрофобність, що є більшою, ніж або дорівнює -1,10 та/або чистий заряд, що є більший, ніж або дорівнює 0, як описано в Fauchere and Pliska Eur. J. Med Chem. 10:39 (1983). Гідрофобна або неполярна амінокислота може також стосуватися амінокислоти, що має бічний ланцюг, що не має заряду при фізіологічному рН, що є неполярний і, що взагалі резистентна щодо водного розчину. У переважному аспекті винаходу X та/або Υ вибрані з групи гідрофобних амінокислот, що складаються з гліцину, лейцину, фенілаланіну, проліну, аланіну, триптофану, валіну, ізолейцину, метіоніну, тирозину і треоніну, та/або групи катіонних амінокислот, що складаються з орнітину, гістидину, аргініну і лізину. X та/або Υ можуть бути D або L-амінокислотами. Крім того, X та/або Υ можуть бути поперемінними амінокислотами. Винахід також включає відомі ізомери (структурні, стерео, конформаційні і конфігураційні) і структурні аналоги описаних вище амінокислот і природно модифіковані (наприклад, посттрансляційна модифікація) або хімічно, включаючи, але не обмежуючи, фосфорилювання, глікозилювання, сульфонілювання та/або гідроксилювання. Загалом, пептиди винаходу не включають амінокислоти, такі як:: аспарагінова кислота, глутамінова кислота, аспарагін, глутамін або серин, але 6 деякі пептиди винаходу можуть мати активність за умови присутності цих амінокислот. Пептиди винаходу можуть включати один або більше додаткових амінокислотних залишків, суміжних з одним або обома кінцевих залишків цистеїну формули II, III або IV, наприклад, пептиди можуть включати до 10 (наприклад 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10) додаткових амінокислотних залишків. Переважно, додаткові амінокислоти - є нецистеїновими залишками. Більш переважно, додаткові амінокислоти - X та/або Y. Крім того, амінокислотну послідовність пептиду може бути змінено, щоб привести до варіанту пептиду, що включає заміщення принаймні одного залишку амінокислоти в пептиді іншим залишком амінокислоти, включаючи заміщення скоріше D формою, ніж L. Один або більше залишків пептиду можуть бути замінені на інший, щоб змінити, підсилити або зберегти біологічну активність пептиду. Такий варіант може мати, наприклад, принаймні приблизно 10% біологічної активності щодо неваріантного пептиду. Часто використовуються захисні амінокислоти, тобто замісники амінокислот з подібними хімічними і фізичними властивостями, як описано вище. Отже, наприклад, захисні замісники амінокислоти можуть включати заміну лізину на аргінін, орнітин або гістидин; заміну однієї гідрофобної амінокислоти на іншу. Після того, як замісники введені, варіанти піддають скринінгу на біологічну активність. Пептид може включати принаймні 4 амінокислоти, наприклад, від 4 до 50 амінокислот, або 4 і 50 амінокислот, також як від 20 до 45 амінокислот, як наприклад 20, 25, 30, 35, 40, 42 або 45 амінокислот. У переважному аспекті винаходу, X і Υ - однакові і є лейцином або гліцином. В подальшому переважному аспекті винаходу, X - лейцин і Υ - гліцин. В подальшому переважному аспекті, X і Υ однакові і є лізином або аргініном. Таким чином, винахід забезпечує пептиди, вибрані з полі-L-лізину, полі-О-лізину, полі-L-аргініну і полі-D-аргініну. В усе ще подальшому переважному аспекті, X - лізин і Υ - аргінін. У пептиді даного винаходу 1 і m можуть бути 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 і n може бути 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10. У пептиді винаходу 1 може бути 1, n може бути 1, і m може бути між 4 і 9, наприклад, m може бути 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9. У пептиді даного винаходу 1, n та/або m може бути між 1 і 5, наприклад, 1, 2, 3, 4 або 5. Переважно, пептид є ациклічним. Пептид може бути лінійним або розгалуженим. Термін "пептид" як використовується тут означає в загальному терміні безліч амінокислотних залишків, з'єднаних разом пептидними зв'язками. Вони використовується поперемінно й означають однаково як поліпептид і протеїн. В одному варіанті реалізації винаходу пептид включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з: 7 В подальшому аспекті винаходу пептид включає принаймні одну з аміно послідовностей від (і) до (viii) і додатково амінокислотні залишки, суміжні з одним або обома із кінцевих залишків цистеїну. Таким чином, в подальшому варіанті реалізації винаходу забезпечений пептид, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з амінокислотних послідовностей, показаних на Фіг. 1. Пептиди винаходу взагалі - синтетичні пептиди. Пептиди можуть бути виділеними, очищеними пептидами або їх варіантами, котрі можуть синтезуватися in vitro, наприклад, твердофазним синтетичним способом, ензимно каталізованим пептидним синтезом або за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Щоб ідентифікувати активні пептиди, що мають незначну або небажану токсичність для клітин ссавців, можуть бути виготовлені окремі пептиди або бібліотеки пептидів, й окремі пептиди або пептиди бібліотек можуть піддаватися скринінгу на антимікробну активність і токсичність, включаючи, але не обмежуючись антимікотичною, антибактеріальною, противірусною, антипротозойною, антипаразитарною активністю і токсичностю. Пептиди винаходу можуть існувати в різних формах, таких як вільні кислоти, вільні основи, естери й інші проліки, солі і таутомери, наприклад, винахід включає всі різні форми сполук. Таким чином, винахід охоплює сіль або проліки пептиду або варіанти пептиду винаходу. Пептиди винаходу можуть застосовуватися у формі фармацевтично прийнятних солей. Фармацевтично прийнятні солі представленого винаходу можуть синтезуватися з вихідного(материнського) пептиду, що містить основну або кислотну частки звичайними хімічними способами. Узагалі, такі солі можуть бути одержані реагуванням форм вільної кислоти або основи цих пептидів зі стехіоме 96564 8 тричною кількістю прийнятної основи або кислоти у воді або в органічному розчиннику, або в суміші двох; взагалі, неводне середовище переважно ефір, етилацетат, етиловий спирт, ізопропіловий спирт або ацетонітрил. Перелік прийнятних солей наведений у Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., US, 1985, p. 1418, рокриття якого включене тут як посилання; див. також Stahl et al, Eds, "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use", Verlag Helvetica Chimica Acta and Wiley- VCH, 2002. Винахід, таким чином, включає фармацевтично прийнятні солі розкритих пептидів, де вихідна речовина модифікована одержанням її кислотних або основних солей, наприклад, загальноприйнятні нетоксичні солі або солі четвертинного амонію, які утворюються, наприклад, від неорганічних або органічних кислот або основ. Приклади таких кислотно-адитивних солей включають ацетат, адипат, альгінат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бісульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфосульфонат, циклопентанпропіонат, диглюконат, додецил сульфат, етансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, гліцерофосфат, гемісульфат, гептаноат, гептаноат, хлоргідрат, бромгідрат, йодгідрат, 2-гідроксиетансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталенсульфонат, нікотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 3-фенілпропіонат, пікринат, півалат, пропіонат, сукцинат, тартрат, тіоціанат, тозилат, і ундеканоат. Основні солі включають солі амонію, солі лужних металів, такі як натрієві і калієві солі, солі лужно-земельних металів, такі як солі кальцію і магнію, солі з органічними основами, такі як солі дициклогексиламіну, N-метил-D-глутамiну і амінокислотні солі, такі як аргінін, лізин, і т.д. Також, основні азот-місткі групи можуть бути кватернизовані з такими агентами як нижчі галоїдалкіли, такі як метил, етил, пропіл і бутилхлорид, броміди і йодиди; діалкілсульфати подібно етану, діетилу, дибутилу; і · діамілсульфати, довголанцюгові галоїди, такі як децил, лаурил, міристил- і стеарилхлориди, броміди і йодиди, аралкілгалогеніди подібно бензил- і фенетилброміду і інші. Солі карбоксильних груп пептиду або варіанту пептиду винаходу можуть бути одержані звичайним способом контактування пептиду з одним або більше еквівалентами бажаної основи такої як, наприклад, гідроксид металу, наприклад гідроксид натрію; карбонат або бікарбонат металу як, наприклад, карбонат або бікарбонат натрію; або аміну як, наприклад, триетиламін, триетаноламін і т.п. N-ацильні похідні аміногруп пептиду або варіантів пептиду винаходу можуть бути одержані, використовуючи N-ацил-захищену амінокислоту для заключної конденсації, або ацилюванням захищеної або незахищеної амінокислоти. О-ацильні похідні можуть бути одержані, наприклад, ацилюванням вільного гідрокси пептиду або полімеру пептиду. Будь-яке ацилювання може бути проведено, використовуючи стандартні ацилювальні реагенти, такі як ацилгалоїди, ангідриди, ацилімідазоли і т.п. 9 96564 Винахід включає проліки для активних фармацевтичних видів описаних пептидів, наприклад у яких одна або більше функціональних груп захищені або дериватизовані, але можуть бути перетворені in vivo до функціональної групи, як у випадку естерів карбонових кислот, конвертованих in vivo до вільної кислоти, або у випадку захищених амінів, до вільної аміногрупи. Термін "проліки", як використовується тут, представляє структури, що швидко перетворюються in vivo до вихідної(материнської) структури, наприклад, гідролізом у крові. Повне обговорення забезпечене в Т. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Функціональна група Карбонова кислота Спирт Аміни Борна кислота Карбоніл(альдегід, кетон) 10 Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987; Η Bundgaard, ed, Design of Prodrugs, Elsevier, 1985; and Judkins, et al. Synthetic Communications, 26(23), 4351-4367 (1996), кожний з яких включений тут як посилання. Тому проліки включають препарати, що мають функціональну групу, що була трансформована в її реверсивну похідну. Зазвичай такі проліки трансформуються до активного препарату шляхом гідролізу. У якості прикладів можуть бути наведені наступні: Реверсивна похідна Естери, включно такі, як ацилоксиалкільні естери, аміди Естери, включно сульфати і фосфати, також як естери карбонової кислоти Аміди, карбамати, іміни, енаміни Діольні естери Іміни, оксими, ацеталі/кеталі, єнольні естери, оксазолідини та тіазоксолідини Проліки також включають сполуки, здатні конвертуватися в активний лікарський засіб шляхом окисної або відновної реакції. У якості прикладів можуть бути наведені: Окисна активація - N- та О-деалкілування - Окисне дезамінування - N-окиснення - Епоксидування Відновна активація - Азо-відновнення - Сульфоксидне відновнення - Дисульфідне відновнення - Біоредуктивне алкілування - Нітро відновнення. Також згадувані як метаболічні активації проліків - нуклеотидна активація, фосфорилювальна активація й декарбоксилювальна активація. Використання захисних груп описано в "Protective Groups in Organic Chemistry", edited by J W F McOmie, Plenum Press (1973), та "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd edition, Τ W Greene & Ρ G Μ Wutz, Wiley-lnterscience (1991). Таким чином, буде оцінено фахівцем у даній галузі, що, хоча захищені похідні описаних пептидів можуть не володіти фармакологічною активністю як такою, вони можуть застосовуватися, наприклад парентерально або перорально і після того перетворюватися при метаболізмі у форми сполук, що є фармакологічно активними. Тому такі похідні - приклади "проліків". Усі проліки описаних сполук в межах винаходу. Подальший аспект винаходу забезпечує фармацевтичну композицію, що включає фармацевтично ефективну кількість принаймні одного з пептидів винаходу або двох, або більше різних пептидів винаходу. Ці пептиди також включають фармацевтично прийнятний носій, ексціпієнт або розріджувач. Вираз "фармацевтично прийнятний", викорисовуваний тут відноситься до тих сполук, речовин, композицій та/або дозованих форм, які у межах медичного судження прийнятні для використання в контакті з тканинами людей або, в залежності від обставин, тварини без надмірної токсичності, подразнення, алергічної реакції, або іншої проблеми, або ускладнення, порівняно щодо резонного співвідношення користь/ризик. Пептиди винаходу корисні, між іншим, як антимікробні пептиди, наприклад, проти бактерій, грибків, дріжджів, паразитів, найпростіших і вірусів. Термін "антимікробний пептид" може використовуватися тут, щоб визначити будь-який пептид, що має бактерицидну та/або бактеріостатичну активність і охоплює, невиключно, будь-який пептид, описаний як такий, що має антибактеріальні, протигрибкові, антимікотичні, антипаразитарні, антипротозойні, противірусні, протиінфекційні, антибактеріальні та/або герміцидні, альгіцидні, амебоцидні, бактерицидні, фунгіцидні, паразитоцидні, протозоацидні властивості. Таким чином, винахід, крім того забезпечує пептид для використання у якості медикамента. Пептиди винаходу можуть застосовуватися як антимікробні агенти in vivo та ex vivo. У переважному аспекті, винахід забезпечує використання пептиду у виробництві медикаменту для лікування мікробної інфекції. Під "мікробною інфекцією" розуміють інфекцію, викликану бактеріальним, паразитарним, протозойним, вірусним або грибковим патогеном. "Патоген" взагалі визначається як будь-який хвороботворний організм. Бактеріальний патоген може бути виділений з видів бактерій, вибраних з групи, що складається з: Staphylococcus spp., наприклад, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Enterococcus spp., наприклад, Enterococcus faecalis; Streptococcus pyogenes; Listeria spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., наприклад, Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., наприклад група А або В, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., наприклад, Helicobacter pylori; Neisseria spp., наприклад, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., наприклад, Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp., наприклад, Haemophilus influenzae; Chlamydia spp., на 11 приклад, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Francisella fularensis; Bacillus spp., наприклад, Bacillus anthracis; Clostridia spp., наприклад, Clostridium botulinum; Yersinia spp., наприклад, Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; наприклад, Burkholderia mallei і В pseudomallei. Вірусний патоген може бути виділений з вірусу, вибраного з групи, що складається з: вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ 1 і 2); вірусу Тклітинної лейкемії людини (HTLV 1 і 2); вірусу Ebola; папіломавірусу людини (наприклад, HPV-2, HPV-5, HPV-8, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-52, HPV-54 і HPV-56); паповавірусу; риновирусу; поліовірусу; вірусу герпеса; аденовірусу; вірусу Епштейна-Барра; вірусу грипу, вірусів гепатитів В і С, Variola вірусу, ротавірусу або SARS коронавірусу. Паразитарний патоген може бути виділений з паразитарного патогену, вибраного з групи, що складається з Trypanosoma spp. (Trypanosoma cruzi, Trypansosoma brucei), Leishmania spp., Giardia spp., Trichomonas spp., Entamoeba spp., Naegleria spp., Acanthamoeba spp., Schistosoma spp., Plasmodium spp., Crytosporidium spp., Isospora spp., Balantidium spp., Loa Loa, Ascaris lumbricoides, Dirofilaria immitis, Toxoplasma ssp., наприклад Toxoplasma gondii. Грибковий патоген може бути виділений із грибкового патогена, що є сімейством Candida spp., (наприклад, C.albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporiim spp., Trichophyton spp., (наприклад T.rubrum і T.interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp., Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp., Wangiella spp. Мікробні інфекції, що піддаються лікуванню пептидами представленого винаходу можуть бути вибрані від будь-якого бактеріального, грибкового, паразитарного, вірусного патогена людини, наведені в Таблиці 1. Таким чином, винахід забезпечує використання пептиду у виробництві медикамента для лікування мікробної інфекції, причому мікробна інфекція є системною, місцевою, підшкірною, шкірною або мікозом слизуватої оболонки. Мікози можуть класифікуватися як системні, що означає, що інфекція є глибокою і вражає вну 96564 12 трішньошні органи або кров або місцевою (дерматофіт), що означає, що інфекція є поверхневою і зустрічається на шкірі. Крім того, грибкові інфекції можуть вражати слизові оболонки. Грибкові інфекції можуть також бути системними (наприклад, кандидемія і інші часто фатальні стани). Мікози на шкірі звичайно лікуються кремами або мазями (місцеві протигрибкові препарати). Однак, системні інфекції, грибкові інфекції або місцеві інфекції, що не виліковуються після обробки кремами або мазями, потребують лікування системними антимікотичними препаратами (перорально або внутрішньовенно). Ці препарати використовуються, наприклад, для лікування загальних мікозів, таких як мікоз, викликаний Trichophyton rubrum, що зустрічається на шкірі або кандидоз (мікотична інфекція, також відома як кандидозний стоматит), що може зустрічатися в трахеї, піхві або в інших частинах тіла. Системні антимікотичні препарати також використовуються для лікування інших глибоких мікозів, таких як гістоплазмоз, бластомікоз і аспергільоз, котрі можуть вражати легені та інші органи. Вони іноді використовуються для профілактики або лікування мікозів у людей, імунна система яких ослаблена, таких як пацієнти після трансплантації кісткового мозку або органів і пацієнти зі СНІДом. Місцева або дематофітна інфекція, яка водночас хоч і не спричиняє смерть або важке захворювання, є розповсюдженою й економічно важливою внаслідок дорогого лікування. Місцеві або поверхневі мікози можуть включати такі на шкірі, рогівці, нігтях і волоссі. Шкірні інфекції - інфекції шкіри і нігтів. У переважному аспекті винаходу мікотичною інфекцією є оніхомікоз. Оніхомікоз може бути викликаний, але не обмежений сімейством Trichophyton spp., наприклад, Trichophyton interdigitale або Trichophyton rubrum. Термін "оніхомікоз" включає, але не обмежується: дистальний латеральний піднігтьовий, поверхневий білий, проксимальний білий піднігтьовий, вторинний дистрофічний, первинний дистрофічний, нігтьовий, кандидозний (наприклад, оніхоліз і шкірно-слизуватий кандидоз) типи оніхомікоза. Оніхомікоз - значний фактор ризику для більш серйозних клінічних ускладнень, таких як гострий бактеріальний целюліт кінцівок та інших вторинних бактеріальних інфекцій, таким чином, представлений винахід охоплює лікування цих інфекцій. Пептиди винаходу - потужні антимікробні пептиди проти широкого спектру патогенних організмів. Однак, пептиди винаходу можуть також бути корисні у лікуванні інших станів, включаючи, але не обмежуючи: кістозний фіброз та інші стани, пов'язані з інфекціями слизових оболонок, наприклад, шлунково-кишкові, урогенітальні або респіраторні інфекції. Пептиди винаходу можуть також бути корисні у лікуванні або профілактиці, між іншим, ран, виразок і уражень наприклад, шкірні рани, такі як порізи або опіки і пов'язані з ними стани. Термін «лікування» стосується ефектів пептидів, описаних тут, що надає користі пацієнтам, 13 хворим на інфекційне захворювання, включаючи покращення стану пацієнта або ремісію захворювання. Як використовується тут "лікування рани" може включити загоєння рани і пов'язані стани і терапію, що сприяє, збільшує або прискорює загоєнню тканин і включає післяопераційне рубцювання, опіки, псоріаз, прискорення реконструювання тканини, наприклад, після косметичного хірургічного втручання і трансплантації органа. Таким чином, в подальшому аспекті винаходу забезпечений субстрат, до якого пептид винаходу застосований або приєднаний. Переважно, субстрат є прийнятним для застосування до ран або постачання до сайтів ран. Переважно, субстрат дозволяє трансфер пептидів винаходу від субстрату до дна рани, щоб досягти антибіотичного ефекту. Субстрат може бути перев'язувальним засобом, наприклад, пов'язка на рану. Пов'язка може включати тканинний матеріал або може бути колагеноподібним матеріалом. Пептиди винаходу можуть також знайти застосування як дезинфікуючі засоби. У цьому контексті, можуть бути застосовані пептид або фармацевтичні композиції винаходу самостійно або в комбінації з іншими дезінфектантами до обробляємої поверхні. Як використовується тут "поверхня, що обробляється" може бути субстратом, як визначено тут або медичним пристроєм. В подальшому аспекті, винахід забезпечує спосіб лікування або профілактики мікробної інфекції у суб'єкта, що полягає у призначенні згадуваному суб'єктові терапевтично ефективної кількості пептиду згідно з винаходом. У переважному способі винаходу, мікробна інфекція - мікотична інфекція. У способі винаходу пептид може бути застосований до шкіри або нігтів згадуваному суб'єктові. Ссавців, птахів й інших тварин можуть лікувати пептидами, композиціями або способами, описаними тут. Такі ссавці і птахи включають собак, котів і домашню худобу, таких як коні, рогата худоба, вівці, кози, кури і індики і т.п. Крім того, рослини можуть також оброблятися пептидами, композиціями або способами винаходу. У випадку, коли суб'єкт - тварина, спосіб винаходу може бути здійснений подібно щодо нігтів, включаючи, але не обмежуючи копита, кігті. Спосіб винаходу може включати, окрім лікування пептидом, лікування, що може підсилити проникнення пептиду в ніготь. Це може полегшуватися хімічними або фізичними засобами. Фізичні обробки, такі як гравірування нігтя або шліфування дорсального шару нігтя можуть підсилити проникність пептидів винаходу. Хімічне підвищення проникності нігтя для пептидів винаходу може досягатися руйнуванням фізичних або хімічних зв'язків в межах кератину пластини нігтя (нігтьової пластини). Пом'якшувачі нігтя, включають, але не обмежуються, сечовину і саліцилову кислоту, які збільшують гідратацію нігтя, зменшують щільність нігтя і, тому, можуть збільшити проникність для пептидів винаходу. Сполуки, що містять сульфгідрильні групи можуть розщіплювати дисульфідні зв'язки в кератині нігтя і можуть призводити до дестабіліза 96564 14 ції і збільшеної проникності препаратів. Сполуки включають, але не обмежуються ацетилцистеїном і похідними меркаптоетанолу, можуть використовуватися в комбінації пептидами. Інші відомі інертні ексціпієнти/ад'юванти проникності нігтя, що можуть використовуватися в комбінації пептидами винаходу, включають метилсульфонілметан, сечовину, поліетиленгліколь, N-(-2меркаптопропіоніл)гліцин, диметилсульфон і 2-nноніл-1,3-діоксолан. В подальшому аспекті, винахід забезпечує спосіб лікування рани у суб'єкта, що включає застосування до рани терапевтично ефективної кількості пептиду або субстрату згідно з винаходом. Пептиди винаходу, включаючи їх солі, застосовуються, щоб досягти зменшення принаймні одного симптому, пов'язаного з інфекцією, показанням або захворюванням, або зменшення кількості антитіл, пов'язаних захворюванням. Щоб досягати бажаного ефекту(ів), пептид, його варіант або їх комбінація, може призначатися як однократні або розподілені дози, наприклад, від принаймні приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 500750 мг/кг, від принаймні приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 300-500 мг/кг, принаймні від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 100-300 мг/кг або, принаймні, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 50-100 мг/кг ваги тіла або, принаймні, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 20 мг/кг ваги тіла, хоча інші дозування можуть забезпечити позитивні результати. Застосовувана кількість може варіюватися в залежності від різних факторів, включаючи, але не обмежуючи обраний пептид і його клінічні ефекти, хвороби, вагу, фізичний стан, здоров'я, вік ссавця, успішності профілактики або лікування, і, якщо, пептид хімічно модифікований. Такі фактори можуть бути визначені клініцистом, що досліджує емпіричні дані клінічних досліджень і доклінічних досліджень на тваринах, або інших дослідних системах, що є доступні в даній галузі. Призначення терапевтичних агентів згідно з представленим винаходом може бути однократною або багатократними дозами, у безперервному або пульсовому режимі, в залежності, наприклад, від фізіологічного стану реціпієнта або цілі призначення: терапевтичної або профілактичної і інших факторів, відомих фахівцям. Призначення пептидів винаходу може бути постійним протягом попередньо встановленого періоду часу або серіями роздільних доз. І місцеве і системне призначення розглянуто. Щоб одержати композицію, пептиди синтезують або отримують іншим способом, очищують в міру необхідності, потім ліофілізують і стабілізують. Пептид потім можуть регулювати до прийнятної концентрації і довільно об'єднувати з іншими агентами. Абсолютна вага даного пептиду, включеного в одиничну дозу може широко варіюватися. Наприклад, можуть застосовуватися, від приблизно 0,01 до приблизно 2 г або від приблизно 0,01 до приблизно 500 мг принаймні одного пептиду винаходу або множинності пептидів, специфічних щодо конкретного типу клітин. Альтернативно, одинична доза може варіюватися від приблизно 0,01 г до приблизно 50 г, приблизно від 0,01 г до приблизно 15 35 г, приблизно від 0,1 г до приблизно 25 г, приблизно від 0,5 г до приблизно 12 г, приблизно від 0,5 г до приблизно 8 г, приблизно від 0,5 г до приблизно 4 г, або приблизно від 0,5 г до приблизно 2 г. Добові дози пептидів винаходу можуть варіюватися також. Такі добові дози можуть знаходитися в межах, наприклад, приблизно від 0,001 г/день до приблизно 100 або 50 г/день, приблизно від 0,1 г/день до приблизно 25г/день, приблизно від 0,1 г/день до приблизно 12 г/день, приблизно від 0,1 г/день до приблизно 5 г/день, приблизно від 0,1 г/день до приблизно 2,5 г/день, приблизно від 0,1 г/день до приблизно 2 г/день, приблизно від 0,5 г/день до приблизно 8 г/день, приблизно від 0,5 г/день до приблизно 4 г/день, приблизно від 0,5 г/день до приблизно 2 г/день, і приблизно від 0,5 г/день до приблизно 1 г/день. Таким чином, одна або більше прийнятних одиничних дозованих форм, що включають терапевтичні пептиди винаходу можуть призначатися різними шляхами введення, включаючи пероральний, парентеральний (включаючи підшкірний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий і інтраперитонеальний), ректальний, дермальний, трансдермальний, інтраторакальний, інтрапульмонарний і інтраназальний (респіраторний). Терапевтичні пептиди можуть також бути утворені в ліпідну композицію або пролонгованого вивільнення (наприклад, використовуючи мікрокапсулювання, див. WO 94/07529 і патент США 4962091). Композиції, коли прийнятно, можуть бути зручно представлені у дискретних одиничних дозованих формах і можуть бути виготовлені будь-яким способом, відомим у фармації. Такі способи можуть включати стадію змішування терапевтичного агента з рідкими носіями, твердими матрицями, напівтвердими носіями, тонко подрібненими твердими носіями або їх комбінаціями і потім, у разі потреби, введення або формування продукту у бажану систему доставки. Коли терапевтичні пептиди винаходу виготовлені для перорального призначення, вони взагалі комбінуються з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або ексціпієнтом, щоб утворити фармацевтичну композицію, або одиничну дозовану форму. Для перорального призначення пептиди можуть бути представлені як порошок, гранули, розчин, суспензія, емульсія або у вигляді природного або синтетичного полімера, або смоли для внутрішнього прийому активних інгредієнтів від жувальної гумки. Активні пептиди можуть також бути представлені як болюси або пасти. Перорально застосовувані терапевтичні пептиди винаходу можуть також бути утворені як пролонгованого вивільнення, наприклад, пептиди можуть бути вкриті оболонкою, мікрокапсульовані або іншим способом розміщені в межах пролонгованого засобу доставки. Загальна кількість активних інгредієнтів у таких композиціях складає від 0,1 до 99,9% від ваги композиції. Фармацевтичні композиції, що містять терапевтичні пептиди винаходу, можуть бути виготовлені згідно з процедурами, відомими в даній галузі з використанням відомих і доступних інгредієнтів. 96564 16 Наприклад, пептид може бути утворений із загальними ексціпієнтами, розріджувачами або носіями у таблетки, капсули, розчини, суспензії, порошки, аерозолі і т.п. Приклади ексціпієнтів, розріджувачів і носіїв, прийнятних для таких композицій, включають буфери, так само як наповнювачі і розріджувачі, такі як крохмаль, целюлоза, цукор, манніт, і кремнієві похідні. Зв'язувальні агенти можуть також бути включені, такі як карбоксиметилцелюлоза, гідроксиметилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза і інші похідні целюлози, альгінати, желатин і полівінілпірролідон. Зволожувальні агенти можуть бути включені, такі як гліцерин, дезінтегратори, такі як карбонат кальцію і бікарбонат натрію. Агенти для сповільнення розчинення можуть також бути включені, такі як парафін. Каталізатори ресорбції, такі як сполуки четвертинного амонію можуть також бути включені. Поверхнево-активні агенти, такі як цетиловий спирт і моностеарат гліцерину можуть бути включені. Адсорбційні носії, такі як каолін і бентоніт можуть бути додані. Лубриканти, такі як тальк, кальцію стеарат і стеарат магнію, тверді поліетиленгліколі можуть також бути включені. Консерванти також можуть бути додані. Композиції винаходу можуть також містити загущувачі, такі як целюлоза та/або похідні целюлози. Вони можуть також містити камеді, такі як ксантанова, гуарова або аравійська камедь, або, альтернативно, поліетиленгліколі, бентоніти і монтморилоніти і т.п. Наприклад, таблетки або каплети, що містять пептиди винаходу, можуть включати буферні агенти, такі як карбонат кальцію, окис магнію і карбонат магнію. Прийнятні буферні агенти можуть також включати оцтову кислоту у солі, лимонну кислоту у солі, борну кислоту у солі і фосфорну кислоту у солі. Каплети і таблетки також можуть включати інертні інгредієнти, такі як целюлоза, гель крохмалю, діоксид кремнію, гідроксипропілметилцелюлоза, стеарат магнію, мікрокристалічна целюлоза, крохмаль, тальк, двоокис титану, бензойна кислота, лимонна кислота, кукурудзяний крохмаль, мінеральне масло, поліпропіленгліколь, фосфат натрію, стеарат цинку, і т.п. Тверді або м'які желатинові капсули, що містять принаймні один пептид винаходу, можуть містити інертні інгредієнти, такі як желатин, мікрокристалічна целюлоза, лаурилсульфат натрію, крохмаль, тальк, і двоокис титана, і т.п., так само як рідкі носії, такі як поліетиленгліколі (ПЕГ) і рослинна олія. Крім того, вкриті кишково-розчинною оболонкою каплети або таблетки, що містять один або більше пептидів винаходу, призначені для резистентності щодо дезінтеграції у шлунку і розчинні у більш нейтральному до лужного середовищі дванадцятипалої кишки. Терапевтичні пептиди винаходу можуть також бути утворені як еліксири або розчини для загальноприйнятного перорального введення, або як розчини, прийнятні для парентерального введення, наприклад внутрішньом'язово, підшкірно, інтраперитонеально або внутрішньовенно. Фармацевтичні композиції терапевтичних пептидів винаходу також можуть бути у формі водного або 17 безводного розчину, або дисперсії, або альтернативно у формі емульсії або суспензії, або мазі. Таким чином, терапевтичні пептиди можуть бути утворені для парентерального введення (наприклад ін'єкцією, наприклад, ін'єкцією болюсу або безперервним інфузією) і можуть бути представлені в одиничній дозованій формі в ампулах, попередньо заповнених шприцах, контейнерах малих ємностей або в багатодозових контейнерах. Як визначено вище, консерванти можуть бути додані для підтримання строку зберігання дозованої форми. Активні пептиди й інші інгредієнти можуть утворити суспензії, розчини або емульсії в масляному або водному носії і можуть містити ад'юванти, такі як суспенгатори, стабілізатори та/або диспергатори. Альтернативно, активні пептиди й інші інгредієнти можуть у формі порошку, отриманого асептичним виділенням стерильного порошку або ліофілізацією з розчину для поєднання з прийнятним розбавником, наприклад, стерильною, апірогенною водою перед використанням. Ці композиції можуть містити фармацевтично прийнятні носії, розбавники і ад'юванти, що є добре відомими в даній галузі. Можливо, наприклад, виготовити розчини, використовуючи один або більше органічних розчинників, що є прийнятними з фізіологічної точки зору, вибраних, окрім води, такі як ацетон, оцтова кислота, етиловий спирт, ізопропіловий спирт, диметилсульфоксид, гліколеві ефіри, такі як комерційні продукти під назвою "Dowanol", полігліколі і поліетиленгліколі, С1-С4 алкільні естери коротколанцюгових кислот, етилабо ізопропіллактат, триглицериди жирної кислоти, такі як комерційні продукти під назвою "Miglyol", ізопропілміристат, тваринні, мінеральні і рослинні масла і полісилоксани. Переважно, фармацевтичні композиції терапевтичних пептидів винаходу можуть також можуть бути у формі розчинника або розріджувача, що включає пептид. Розчинники або розріджувачі можуть включати кислі розчини, диметилсульфон, N-(2-меркаптопропіоніл) гліцин, 2-n-ноніл-1,3діоксолан і етанол. Переважно розчинник/розріджувач - кислий розчинник, наприклад, оцтова кислота, лимонна кислота, борна кислота, молочна кислота, пропіонова кислота, фосфорна кислота, бензойна кислота, масляна кислота, яблучна кислота, малонова кислота, щавлева кислота, бурштинова кислота або винна кислота. Більш переважно, розчинник - розчин оцтової кислоти. Розчинник, наприклад розчин оцтової кислоти, може бути присутній у композиції у концентрації меншій, ніж 1%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,01% 0,05%. В подальшому аспекті представленого винаходу забезпечено використання кислоти у виробництві медикаменту для лікування мікробної інфекції, особливо мікотичної. Мікотична інфекція може бути оніхомікозом. Оніхомікоз може бути викликаний грибками, не обмежуючись, виду: Trichophyton spp., наприклад, грибок може бути Trichophyton interdigitale або Trichophyton rubrum. Кислота може бути як вищеописано. Переважна кислота - оцтова кислота. Переважно, кислота забезпечена в розчині в концентрації менше, ніж 1%, 0,5%, 0,25%, 96564 18 0,1%, 0,01% 0,05%, наприклад, оцтова кислота. Звичайно, медикамент адаптують для місцевого застосування для лікування, наприклад, нігтів. Як використовується далі, термін "активний агент" охоплює окремий пептид згідно з винаходом або комбінації пептидів, як описано тут. Термін "активний агент" може також включати фармацевтично ефективну кількість кислоти, як тут описано. Активні агенти можуть застосовуватися одночасно, послідовно або окремо. Взагалі переважно, що таке застосування є місцевим. Активні агенти можуть застосовуватися в синергично ефективних кількостях. Тому винахід включає використання синергично ефективних кількостей активних агентів, наприклад пептиду згідно з винаходом і фармацевтично ефективної кількості кислоти, як тут описано, для виробництва продукту, наприклад медикамента, для одночасного, окремого або послідовного призначення сказаних агентів у лікуванні мікробної інфекції. Можливо додати, у разі потреби, ад'ювант, обраний з антиоксидантів, поверхнево-активних речовин, інших консервантів, плівкоутворювальних, кератолітичних або комедолітичних агентів, парфумів, ароматизаторів і фарбників. Антиоксиданти, такі як трет-бутилгідрохінон, бутильований гідроксианізол, бутильований гідрокситолуол і альфа-токоферол і його похідні можуть бути додані. Також розглянуті комбіновані продукти, що включають один або більше пептидів представленого винаходу і один або більше інших антимікробних або протигрибкових агентів, наприклад, полієни, такі як амфотерицин В, амфотерицин В ліпідний комплекс (ABCD), і ліпосомальний ністатин, азоли і триазоли, такі як вориконазол, флуконазол, кетоконазол, інтраконазол, позаконазол і т.п.; інгібітори синтази глюкану, такі як каспофунгін, ммікафунгін(FK463), і Vехінокандин(LY303366); грізеофульвін; алліламіни, такі як тербінафін; флуцитозин або інші антимікотичні агенти, включаючи описані тут. Крім того, вважають, що пептиди могли б бути скомбіновані з місцевими антимікотичними агентами, такими як циклопіроксоламін, галопрогін, толнафтат, ундециленат, ністатин, аморолфін, бутенафін, нафтифін, тербінафін і інші місцеві агенти. Додатково, пептиди добре прийнятні для утворення пролонгованого вівильнення дозованих форм і т.п. Композиції можуть бути так утворені, що вони вивільняють активний пептид, наприклад, у певній частині кишкового або респіраторного тракту протягом часу. Захисні покриття і захисні матриці можуть бути виготовлені, наприклад, із полімерних субстанцій, таких як полілактидглюконати, ліпосоми, мікроемульсії, мікрочастинки, наночастинки або воски. Ці захисні покриття і захисні матриці корисні для покриття засобів, що контактують із внутрішнім середовищем організму, наприклад, судинні ендопротези, катетери, трубка перитонеального діалізу, дренажні засоби і т.п. Для місцевого застосування, активні агенти можуть бути утворені, як відомо у даній галузі для безпосереднього застосування до ураженої ділянки тіла. Форми, в основному пристосовані для міс 19 цевого застосування, наприклад, креми, гелі, порошки, дисперсії або мікроемульсії, лосьйони, згущені в більшій або меншій мірі, імпрегновані серветки, мазі, аерозольні композиції (наприклад, спреї або піни), мила, детергенти, лосьйони. Інші звичайні форми для цієї мети включають пов'язку на рану, вкриті бандажі або інші полімерні покриття, мазі, креми, лосьйони, пасти, гелі, спреї і аерозолі. Таким чином, терапевтичні пептиди винаходу можуть доставлятися через пластирі або бандажі для призначення на шкіру. Альтернативно, пептид може бути утворений як частина адгезивного полімеру, таких як поліакрилат або акрилат/вінілацетатний співполімер. Для довготривалого застосування було б бажано використовувати мікропористі та/або повітропроникні захисні шари так, що гідратація або мацерація шкіри були б мінімізовані. Захисний шар може бути будь-якої прийнятноїтовщини, що забезпечить бажаний захист і підтримає функції. Прийнятна товщина взагалі буде від приблизно 10 до приблизно 200 мікрон. Місцеве застосування може бути у вигляді засобу для покриття нігтя або лаку. Наприклад, антимікотичні пептиди можуть бути в розчині для місцевого застосування, що містить етилацетат (NF), ізопропіловий спирт (USP) і бутиловий моноестер полі[метилвініл етер/малеїнова кислота] у ізопропіловому спирті. Фармацевтичні композиції для місцевого застосування можуть включати, наприклад, фізіологічно прийнятний буферний сольовий розчин, що містить приблизно між 0,001 мг/мл і приблизно 100 мг/мл, наприклад між 0,1 мг/мл і 10 мг/мл одного або більше пептидів представленого винаходу, визначеного для показань або захворювання, що підлягає лікуванню. Мазі і креми можуть, наприклад, бути утворені з водною або масляною основою з додаванням прийнятних загущувачів та/або гелетвірних засобів. Лосьйони можуть бути утворені з водною або масляною основою і будуть взагалі також містити один або більше емульгаторів, стабілізаторів, диспергаторів, суспенгаторів, загущувачів або пігментів. Активні пептиди можуть також бути доставлені через іонтофорез, наприклад, як розкрито в патенті США 4140122; 4383529; або 4051842. Масова концентрація у відсотках терапевтичного агента винаходу, присутня в місцевій композиції буде залежати від різних факторів, але взагалі буде від 0,01% до 95% від загальної ваги композиції і, звичайно, 0,1-85% від ваги. Краплі, такі як очні або краплі в ніс, можуть бути утворені з одним або більше терапевтичних пептидів у водній або неводній основі, що також включає один або більше диспергаторів, солюбілізаторів або суспенгаторів. Рідкі спреї, можуть бути оснащені насосом або зручно постачатися з герметичних контейнерів. Краплі можуть бути, доставлені через просту крапельницю на флаконі, через пластмасовий флакон, пристосований до доставки рідини крапельно або через спеціальну кришку флакону. Терапевтичний пептид може крім того бути утворений для місцевого застосування у роті або горлі. Наприклад, активні інгредієнти можуть бути 96564 20 утворені як таблетка, що включає ароматизовану основу, звичайно сахарозу та акацієву камедь або трагакант; пастилки, що включають композицію в інертній основі, такій як желатин і гліцерин або сахароза й акацієва камедь; і рідини для полоскання рота, що включають композицію представленого винаходу в прийнятному рідкому носії. Фармацевтичні композиції представленого винаходу можуть включати, як додаткові інгредієнти, фармацевтично прийнятні носії, розріджувачі, солюбілізатори або емульгатори і солі, використовувані в даній галузі. Приклади таких субстанцій включають фізіологічні розчини, такі як фізіологічний буферний сольовий розчин і воду. Конкретні необмежувані приклади носіїв та/або розріджувачів, що є корисними у фармацевтичних композиціях представленого винаходу, включають воду і фізіологічно прийнятний буферний сольовий фізіологічний розчин, такий як фосфатний буферний сольовий фізіологічний розчин рН 7,0-8,0. Пептиди винаходу можуть також призначатися для респіраторного введення. Таким чином, представлений винахід також забезпечує аерозольні фармацевтичні композиції і дозовані форми для використання в способах винаходу. Загалом, такі дозовані форми включають принаймні один з агентів винаходу, ефективний для лікування або профілактики клінічних симптомів визначеної інфекції, показань або захворювання. Будь-яке статистично суттєве зменшення одного або більше симптомів інфекції, показань або захворювання, що лікувалися згідно із способом представленого винаходу, як вважають, є лікуванням такої інфекції, показань або хвороби в межах винаходу. Альтернативно, для введення інгаляційно або інсуфляцією, композиція може бути у формі сухого порошку, наприклад, суміш порошку терапевтичного агента і прийнятної порошкової основи, такої як лактоза або крохмаль. Порошкова композиція може бути представлена у формі одиничної дози в, наприклад, капсулах або картриджах або, наприклад, желатинових або блістерних упаковках, з яких порошок може застосовуватися за допомогою інгалятора, інсуфлятора, або дозованого інгалятора (див., наприклад, герметичний дозований інгалятор (MDI) і порошковий інгалятор, розкритий у Newinan, S. P. in Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. and Davia, D. eds., pp. 197-224, Butterworths, London, England, 1984). Терапевтичні пептиди представленого винаходу можуть також застосовуватися у водному розчині, коли вводяться в аерозолі або інгаляційній формі. Таким чином, інші аерозольні фармацевтичні композиції можуть включати, наприклад, фізіологічно прийнятний буферний сольовий розчин, що містить приблизно між 0,001 мг/мл до приблизно 100 мг/мл одного або більшої кількості пептидів представленого винаходу, визначених для показань або хвороби, що підлягають лікуванню. Сухий аерозоль у формі тонко подрібненого твердого пептиду або частинок нкулеїнової кислоти, що не розчиняються, або суспендуються в рідині, також корисні у практиці представленого винаходу. Пептиди представленого винаходу можуть бути утворені як присипки і містити частинки тонкого 21 помелу, що мають середню величину частинок приблизно між 1 і 5 м, альтернативно між 2 і 3 м. Частинки тонкого помелу можуть бути виготовлені розпиленням і просіюванням через сито, використовуючи способи, відомі в даній галузі. Частинки можуть вводитись інгаляцією попередньо визначеної кількості речовини тонкого помелу, що може бути у формі порошку. Буде оцінено, що зміст одиниці активного інгредієнта або інгредієнтів, що містяться в · індивідуальній дозі аерозолю кожної дозованої форми не потребують у своєму складі ефективної кількості для лікування конкретної інфекції, показання або захворювання, тому що необхідна ефективна кількість може досягатися введенням численних одиниць дозування. Крім того, ефективна кількість може бути досягнута використанням меншої, ніж доза у дозованій формі кожна індивідуально, або серіями введень. Для введення у верхній або нижній респіраторний тракт інгаляційно, терапевтичні пептиди винаходу зазвичай доставляються з небулайзера або герметичного балона, або інших зручних засобів доставки аерозольного спрея. Герметичні балони можуть включати прийнятний пропелент, такий як дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторетан, двоокис вуглецю або інший прийнятний газ. У випадку герметичного аерозолю, одиниця дозування може бути визначена забезпеченням клапану для постачання виміряної кількості. Небулайзери включають, але не обмежуються, описаними в патентах США №№ 4624251; 3703173; 3561444; і 4635627. Типи систем доставки аерозолю, розкриті тут, доступні з численних комерційних джерел, включаючи Fisons Corporation (Bedford, Mass.), Schering Corp. (Kenilworth, NJ) and American Pharmoseal Co. (Valencia, CA). Для інтраназального введення, терапевтичний агент може також застосовуватися у вигляді крапель для носа, рідкого спрея, такого як пластмасовий аерозольний апарат або дозований інгалятор. Типові аерозольні апарати - Mistometer (Wintrop) і Medihaler (Riker). Крім того, активні інгредієнти можуть також використовуватися в комбінації з іншими терапевтичними агентами, наприклад, аналгетиками, протизапальними агентами, антигістамінними, бронхолітичними засобами і т.п. для станів, описаних тут або інших станів. Представлений винахід також забезпечує скринінгове дослідження для пептидів, що мають низьку токсичність для людини або клітин тварин, але мають бажані антимікробні, наприклад протигрибкові властивості (проникнення через мембрани мікотичних клітин, лізис або кілерство, або інгібування росту грибків). Кандидати пептидів можуть бути отримані з бібліотек пептидів винаходу, як описано тут. Пептиди можуть також бути індивідуально або раціонально розроблені, щоб мати визначені структурні особливості. Винахід буде тепер описано за допомогою прикладів тільки як посилання на наступні фігури: Фіг. 1 - показує амінокислотні послідовності чотирьох пептидів згідно з винаходом; 96564 22 Фіг. 2 - гістограма, що демонструє ріст Т. interdigitale після (а) 4 днів і (b) 7 днів лікування пептидами Фіг. 1; Фіг. 3 - гістограма, що демонструє ріст Т. rubrum після (а) 4 дні і (b) 7 днів лікування пептидами Фіг. 1; Фіг. 4 - гістограма, що демонструє ріст Candida albicans, після (а) 24 години і (b) 48 годин лікування пептидами Фіг. 1; Фіг. 5 - гістограма, що показує дозо-залежні результати експеримента для пептиду 1 (показаного на Фіг. 1) щодо росту Candida albicans після 24 годин лікування; Фіг. 6 - графік, що показує виживання Candida spp. протягом 24 години в присутності діапазону доз пептиду 4 як показано на Фіг. 1; Фіг. 7 - графік, що показує виживання 3 різних штамів бактерій протягом 24 години в присутності діапазону доз пептиду 4, як показано на Фіг. 1; Фіг. 8 - гістограма, що демонструє синергічну активність 0,01% оцтової кислоти щодо протигрибкової активності (проти Т. rubrum) пептиду 4 (1 мг/мл) на 3 день росту; Фіг. 9 - гістограма, що демонструє інгібування T. interdigitale і Т. rubrum пептидом 4; Фіг. 10 - гістограма, що показує ефекти пептидів 3 і 4 на T. interdigitale. Фіг. 11 - гістограма, що показує ефект оцтової кислоти на ріст Т. interdigitale; Фіг. 12 - гістограма, що показує ефект полілізину на ріст Т. interdigitale; Фіг. 13 - гістограма, що показує ефекти полілізину і поліаргініну на ріст Т. rubrum; Фіг. 14 - гістограма, що показує інгібування T. interdigitale і Т. rubrum полі-L-аргініном; Фіг. 15 - гістограма, що показує ефект зниженої концентрації поліаргініну на Т. rubrum і T. interdigitale; Фіг. 16 - гістограма, що показує ефект тримерів на ріст Т. rubrum; Фіг. 17 - гістограма, що показує ефект пептиду 4 і NaCI на ріст T. interdigitale; Фіг. 18 - графік, що показує ефект пептиду 4 на Candida albicans при збільшених концентраціях солі; Фіг. 19 - гістограма, що показує ефекти полілізину і поліаргініну на виживання Candida albicans; Таблиця 1 - перелік бактеріальних, мікотичних, паразитарних й вірусних патогенів, що піддаються лікуванню пептидами винаходу; Таблиця 2 деталізує пептиди, що відповідають кодам амінокислотних полімерів, показаних у Результатах і Фігурах. Винахід буде тепер описаний тільки за допомогою посилання на наступні приклади. Приклади Матеріали і способи Усі пептиди були одержані або твердофазним синтезом згідно з контрактом Invitrogen-Evoquest, Carlsbad, CA, USA або були отримані від постачальника пептидів NeoMPS SA (Strasbourg, France) or Sigma-Aldrich Chemical Company Ltd. (Poole, UK). Для тестів із грибками, ліофілізований пептид одержували як основний розчин 1,000 г/мл у тестованому буфері. Як детально викладено в експе 23 риментах, від яких були одержані Фіг. 2-8 і Фіг. 11, оцтова кислота додавалася як розчинник до кінцевої концентрації 0,5%. Πатогени Штами T. interdigitale (NCPF 117) і Trichophyton rubrum (NCPF 335) були отримані від Національної Колекції Патогенних Грибків, Бристоль(МСТС) і підтримувались у культурі трансфером приблизно місячними інтервалами на нахили агару Sabuoraudi і картопляно-декстрозного агару при 30°С. Штам Candida albicans 3179 (одержаний з Національної Колекції Типів Культур [NCTC], Colindale) підтримувався в бульйоні Oxoid Mueller Hinton при 37°С. Штам Streptococcus pyogenes 8198, штам Staphylococcus aureus 10642 (резистентний до метицилину), і штам Е. coli 0157 12900 були отримані від NCTC, Colindale і підтримувались в бульйоні Oxoid Mueller Hinton при 37°С. Тести чутливості росту грибків Щоб визначати чутливість штамів грибків до кожного із тестованих пептидів, їхню активність на ріст грибків оцінювали наступним чином. Суспензії фрагментів гіфів і конідій Т. interdigitale і Т. rubrum одержували додаванням 10 мл свіжого Nutrient Glucose Вroth(глюкозно-бульйонний нутрієнт) (NGB) (Oxoid Nutrient бульйон містить 2% ваг./об. глюкози) до культури і перемішували шпателем. Одержану суспензію фрагментів конідії/гіфи фільтрували через 2 шари стерильної хірургічної марлі, щоб видалити великі гіфальні матриці і частини агару. 20 л цієї суспензії (абсорбція при 540 нм 6 приблизно 0,1, що відповідає приблизно 10 поширення/мл) вводили в кожну стерильну лунку 96лункового планшету, до яких попередньо додавали загальним об'ємом 80 л живильного середовища (NGB) і прийнятної кількості розчину пептиду. Контрольні лунки були тими, у яких заключний тестований об'єм 100 л був одержаний виключно з NGB середовища плюс розчинник (якщо прийнятно і в тій же самій концентрації як зразки пептиду). Ріст грибків у межах планшетів перевіряли абсорбцією при 540 нм на Microtek спектрофотометрі після 24-годин, 4 дні і 7 днів інкубації при 30°С. Тести на виживання Candida albicans Щоб визначити чутливість штамів грибків до кожного з тестованих пептидів, їх активність на виживання Candida оцінювали наступним чином. Культури C. albicans були вирощені протягом 1824 годин, потім зберігалися при 4°С до використання. Свіжі культури, вирощені протягом ночі центрифугували при 2000 x g протягом 10 хвилин і промивали свіжим бульйоном Муллера Хайнтона (Mueller Hinton Broth), регулюючи кількість життє6 7 здатних клітин між 5x10 і 1x10 / мл. Тестовий буфер одержували, додаючи 100 л NGB живильного середовища до 6,9 мл 10 мМ буфера фосфату нартрію, рН 7,7. 35 л Тестованого буфера з або без діапазону концентрацій пептиду додавали до стерильної поліпропіленової пробірки з ковпачком і додавали 15 л вищеописаного посівного матеріалу Candida albicans. Пробірки піддавали інкубації при 37°С на водяній бані протягом 2 годин і кількість виживших Candida spp. визначали серійним розведенням у стерильному буферному 96564 24 фосфатному сольовому розчині (PBS) і осаджували в чашки Петрі на 9 см, що містять середовище Oxoid Sabouraud's Agar (20 мл). Розрахунки здійснювали після інкубації цих планшетів при 37°С протягом 18-24-год. Тести на виживання бактерій Штам Streptococcus pyogenes 8198, Штам Staphylococcus aureus 10642 (резистентний до метицилину) і штам Е. coli 0157 12900 (усі одержані від NCTC, Colindale) були вирощені протягом 1824 годин, потім зберігалися при 4°С до використання. Свіжі культури, вирощені протягом ночі, центрифугували 2000 x g протягом 10 хвилин і промивали свіжим бульйоном Муеллера Хайнтона (Mueller Hinton Broth). Чутливість до кожного з цих чотирьох пептидів випробувалася щодо вищеописаної С albicans. Для Ε. coli і S. aureus, стартова кількість клітин для тесту чутливості пептиду скла8 дала 10 /мл і живильним середовищем, використовуваним для перерахування було живильний агар (Nutrient Agar Oxoid). St. pyogenes росли менш добре, ніж інші штами на агарі Муеллера Хайнтона і стартова кількість клітин для цих тестів 6 була нижчою, ніж для інших штамів - 10 /мл. Виживання St. pyogenes визначали використанням Oxoid Tryptose Soya Agar замість Nutrient Agar. Результати Інгібування росту Trichophtyon spp. пептидами 1-4 Два клінічно релевантних шкірних мікотичних патогенів, Trichopyton rubrum і Trichopyton interdigitale, культивувалися, як описано попередньо в секції матеріалів і способів, у середовищі для вирощування самостійно(контрольні культури) або в середовищі для вирощування, що містить 50 г/мл пептиду 1, 2, 3 або 4 (показані на Фіг. 1). Ріст Т. interdigitale і Т. rubrum оцінювали вимірюванням оптичної щільності (абсорбція при 540 нм) після 4 і 7 днів у культурі. У порівнянні з контролем, у необроблених зразках, кожен тестований пептид, суттєво інгібував ріст Т. interdigitale (Фіг. 2) і Т. rubrum (Фіг. 3) між 4 і 7 днями. Контрольні культури кожного тестованого штаму продовжували рости, як позначено збільшенням оптичної щільності між 4 і 7 днями. Інгібування росту і виживання Candida spp. пептидами 1-4 Candida albicans культивували, як описано попередньо в секції матеріалів і способів, у середовищі для вирощування самостійно(контрольні культури) або в середовищі для вирощування, що містить 50 г/мл або 100 г/мл і 300 г/мл або 500 г/мл пептиду 1, 2, 3 або 4. Ріст С. albicans оцінювали, вимірюючи оптичну щільність (абсорбція при 540нм) після 24 годин (Фіг. 4а) і 48 годин (Фіг. 4b) у культурі. У порівнянні з контролем, у необроблених зразках, кожен тестований пептид суттєво інгібував ріст С. albicans і під час і при дозозалежному режимі. Дозо-залежне інгібування росту було, крім того, підтверджене в експериментах, у яких ріст С. albicans оцінювали оптично після 24 годин у культурі при контролі (середовище для вирощування самостійно) або в присутності діапазону концентрацій пептиду 1 від 50 г/мл до 500 г/мл (Фіг. 5). В окремих експериментах виживання 25 С. albicans оцінювали після 18-24 годин у культурах, вирощених у живильному самостійно (контрольні групи) або у тих, що включають діапазон концентрацій пептиду 4 від 1 г/мл до 1000 г/мл (Фіг. 6). Виживання С. albicans оцінювали індексами життєздатності після 24 годин у культурі убуванням дозо-залежного режиму (Фіг. 6). Інгібування виживання бактерій пептидом 4 Три клінічно релевантні бактеріальні патогени Е. coli 0157, метицилін-резистентний Staphylococcus aureus (MRSA) і Streptococcus pyogenes піддавали, як описано попередньо в секції матеріалів і способів, дії діапазону концентрацій пептиду 4. Після 3-х годинного періоду, зразки кожної бактеріальної культури були переміщені на планшети з прийнятним середовищем росту твердої фази і кількості життєздатних колоній у контролі (середовище для вирощування самостійно) і оброблені зразки (середовище для вирощування, що містить пептид 4) оцінювали після 18-24 годин. Після 3-х годинної експозиції, пептид 4 суттєво інгібував виживання кожного бактеріального штаму (Фіг. 7) у порівнянні з контролем (необроблені культури) в дозо-залежному режимі. Оцтова кислота як підсилювач антимікотичної активності пептиду 4 Середовище як контрольних груп (необроблені пептидом), так і тестованих (містять пептид 1, 2, 3 або 4) в експериментах, показаних на Фіг. 2 і 3 містить оцтову кислоту 0,5% як розчинник пептиду (детально у секції матеріалів і способів), окремий експеримент був постановлений, щоб визначити, чи могла б сама оцтова кислота відігравати роль в активності пептиду та/або виживанні грибків. До цього експерименти росту Т. rubrum були встановлені згідно із способами і матеріалами секції, із середовищем для вирощування самостійно, із середовищем для вирощування, що містить тільки оцтову кислоту 0,01%, із середовищем для вирощування, що містить 1мг/мл пептиду 4 і з середовищем для вирощування, що містить 1мг/мл пептиду 4 і оцтову кислоту 0,01%. Ріст грибка визначали вимірюванням оптичної щільності, як попередньо описано після 3-х днів у культурі. Як очікувалося, пептид 4 інгібував ріст Т. rubrum, 0,01% оцтова кислота самостійно не мала ніякого суттєвого ефекту на ріст Т. rubrum (Фіг. 8), але коли включена в живильне середовище з пептидом 4, присутність 0,01% оцтової кислоти суттєво інгібувала ріст Т. rubrum більше, ніж пептид 4 1 мг/мл самостійно. Інгібування росту Т. interdiqitale і Т. rubrum т пептидом 4 Інгібувальні ефекти пептиду 4 щодо росту Trichophyton spp. визначали тестом росту грибків згідно з матеріалами і способами. Т. rubrum і Т. interdigitale культивувалися в живильному середовищі самостійно або в живильному середовищі, що містить 3 різні концентрації пептиду 4. Оцтова кислота не була присутня ні в яких зразках. Живильне середовище самостійно як контрольні групи використовувалося, щоб ілюструвати фонову абсорбції світла середовища. Ріст грибка визначали вимірюванням оптичної щільності, як попередньо описано після 96 годин інкубації при 30°С. Як по 96564 26 казано на Фіг. 9, ці тести підтверджували інгібувальний ефект пептиду 4 на ріст обох видів грибків, Т. interdigitale головним чином більш чутливі щодо інгібувальних ефектів при обробці пептидом 4, ніж Т. rubrum. Ріст Т. interdigitale інгібувався при концентраціях пептиду 0,55 мг/мл. Ефекти пептидів 3 і 4 на ріст Т. Interdiqitale Оцінювали антимікотичний потенціал пептиду 3 і пептиду 4 на Т. interdigitale. Тести інгібування росту виконувалися згідно з матеріалами і способами за відсутності оцтової кислоти. Оскільки пептиди 1-3 дуже гідрофобні і тому нерозчинні, вони були тільки попередньо протестовані щодо Trichophyton spp. в оцтовій кислоті як розчиннику. Коли культури Т. interdigitale були вирощені протягом 7 днів за наявності пептиду 3, пептиду 4 або живильному середовищі самостійно без оцтової кислоти і ріст оцінювали визначенням оптичної щільності, пептид 4 показав суттєве інгібування росту грибків (Фіг. 10), тоді як пептид 3 не показав ніякої інгібувальної активності (Фіг. 10). Ця збільшена активність катіонного пептиду 4 проти гідрофобного пептиду 3 за відсутності 0,5% оцтової кислоти припускає значну роль оцтової кислоти щодо активності, показаної попередньо для гідрофобних пептидів. Ефект оцтової кислоти на ріст Т. interdiqitale Інгібування росту Т. interdigitale оцтовою кислотою оцінювали, застосовуючи експерименти вирощування грибків згідно з секціями способів і матеріалів. Вирощені культури Т. interdigitale не обробляли або обробляли 3 різними концентраціями оцтової кислоти при 30°С протягом 96 годин (Фіг. 11). Це ілюструє суттєвий ефект 0,5% оцтової кислоти тієї ж самої концентрації, що використовували попередньо з пептидами 1-4 як розчинник. Цей експеримент разом з недостатньою активністю Пептиду 3 за відсутності оцтової кислоти означає, що Пептид 4 - найбільш активна сполука проти Trichophyton spp. Ефект полілізину на ріст Т. interdiqitale Оскільки Пептид 4 - висококатіонний пептид, що включає лізин і залишки аргініну, антимікотична активність полі-L форм цих амінокислот була протестована щодо Т. Interdigitale, використовуючи тести інгібування росту, як деталізовано в матеріалах і способах за відсутності оцтової кислоти. Використовували контрольні, необроблені культури Т. interdigitale і ті, що містять між 1 мг/мл і 50 г/мл молекули полі-L-лізину у межах від 27-100 залишків і 100-200 залишків у довжині. Ріст Т. interdigitale у кожній культурі оцінювали після 96 годин при 30°С. Обидва розміри молекул полі-Lлізина інгібували ріст Т. interdigitale (Фіг. 12), але водночас, більша молекула сповільнювала ріст при всіх концентраціях, інгібувальна активність молекули з 27-100 амінокислотами у довжині була помічена тільки при більш високих концентраціях (Фіг. 12). Це означає, що ефекти інгібування росту лізином Trichophyton spp. залежить від розміру і дози. Ефекти полі-L-аргініну і полі-L-лізину на ріст Т. Rubrum Протестована антимікотична активність полі-Lаргініну порівняно з полі-L-лізином проти Т. 27 rubrum. Інгібування росту визначали згідно з матеріалами і способами за відсутності оцтової кислоти. Т. rubrum культивували в живильному середовищі самостійно, у живильному середовищі, що містить полі-L-аргінін (28-86 амінокислот у довжині) і полі-L-лізин (100-200 амінокислот). Незасіяне живильне середовище (контроль) також використовували. Культури підтримувалися і ріст перевіряли протягом 96 годин при 30° С І полі-L-аргінін і полі-L-лізин інгібували ріст Т. rubrum (Фіг. 13). Полі-L-аргінін мав більшу інгібувальну активність проти Т. rubrum, чим полі-L-лізин, коли тестували в еквівалентних дозах, повне інгібування росту - при 1мг/мл (Фіг. 13). Інгібування Т. interdiqitale і Т. rubrum полі-Lаргініном Інгібування росту Trychophyton spp. полі-Lаргініном перевіряли, застосовуючи експерименти росту грибків згідно з матеріалами і секціями способів. Вирощені культури Т. rubrum і Т. interdigitale в живильному середовищі самостійно або в живильному середовищі, що містить 3 різні концентрації полі-L-аргініну. Оцтова кислота не була присутня ні в яких зразках. Контрольні живильні середовища, використовували для ілюстрації фонової міри абсорбції світла середовища. Ріст грибка визначали вимірюванням оптичної щільності, як попередньо описано після 96 годин інкубації при 30°С (Фіг. 14). Поліаргінін показав активність проти обох видів грибків нижче 0,55 мг/мл (Фіг. 14). Ефект зниженої концентрації (100 г/мл) поліаргініну щодо Т. rubrum і Т. interdiqitale Інгібування росту Trychophyton spp. поліаргініном проводили, використовуючи експерименти росту грибків згідно з матеріалами і секціями способів. Кожну з вирощених культур Т. rubrum і Т. interdigitale обробляли або не обробляли однією концентрацією поліаргініну (100 г/мл), без оцтової кислоти в будь-яких зразках. Контрольні живильні середовища використовувалися, щоб ілюструвати фонову абсорбції світла середовища. Ріст грибка визначали вимірюванням оптичної щільності, як попередньо описано після 96 годин інкубації при 30°С (Фіг. 15). Знижена концентрація веде до втрати активності, це ілюструє ефект дози поліаргініну на Trychophyton spp. Ефект тримерів пептиду (3 амінокислоти) на ріст Т. rubrum Була перевірена активність пептидних тримерів: полі-L-Лізин, полі-L-Аргінін, полі-L-гістидин і полі-L-триптофан на ріст Т. rubrum. Інгібування росту - згідно з матеріалами і способами, і Т. rubrum або залишали необробленим або піддавали експозиції 2 мг/мл кожного з тримерів. Культури підтримувалися протягом 96 годин при 30°С. Ріст грибків визначали вимірюванням оптичної щільності і результати показували як відсоток від росту 96564 28 щодо необробленої культури (Фіг. 16). Полі-Lаргінін був найбільш активним пептидом проти Т. Rubrum, поліпептид тільки з 3 амінокислотами обов'язково виявляє значне інгібування росту Т. rubrum. Ефект Пептиду 4 (1,2 мг/мл) і NaCI на ріст Т. interdiqitale Досліджували ефект різних концентрацій солі на антимікотичну активність пептиду 4 щодо Т. interdigitale. Тести інгібування росту Т. interdigitale проводили згідно з матеріалами і способами за відсутності оцтової кислоти. Культури залишали необробленими або піддавали експозиції пептидом 4 плюс діапазону NaCI концентрацій від 100 мМ до 500 мМ Культури Т. interdigitale підтримувалися 96 год. при 30°С і ріст оцінювали вимірюванням оптичної щільності, як вищеописано (Фіг. 17). Антимікотична активність Пептиду 4 не була викликана концентраціями солі, рівними або вище тих, що знайдені при фізіологічних станах (Фіг. 17). Про антимікробні активності ендогенних бетадефензинів повідомлено, як інгібувальні навіть при низьких концентраціях солі. Ефект пептиду 4 щодо Candida albicans при високих концентраціях солі Виживання С. albicans оцінювали, як деталізовано в способах і матеріалах з наступною інкубацією при 37°С протягом 2-х годин з діапазоном концентрацій пептиду 4. Дві концентрації NaCI були введені в середовище для вирощування, щоб установити ефект фізіологічних і дуже високих концентрацій солі (як відомо, для інгібування активності ендогенних бета-дефензинів). Значну кілерну активність пептиду 4 спостерігали при навіть дуже високих концентраціях солі (Фіг. 18). Оскільки концентрація пептиду 4 збільшена, може бути помічено, що ефект більш високої концентрації солі зменшений (Фіг. 18). Тому, фунгіцидна активність Пептиду 4 не інгібується солями. Активність полі-L-лізину, полі-Р-лізину і полі-Раргініну щодо Candida albicans Оцінювали антимікотичну активність полі-Lаргініну порівняно з полі-L-лізином, порівняно з полі-L-лізином, щоб визначити, котрий з цих варіантів пептиду демонструє збільшену активність щодо Candida albicans. Candida spp. піддавали інкубації, як описано в секції матеріалів і способів протягом 2 годин при 37°С за наявності 100 г/мл, 1 мг/мл і 10 мг/мл полі-D-лізину, полі-L-лізину і полі-L-аргініну. Виживання оцінювали, як вищеописано і була продемонстрована збільшена антимікотична активність полі-L-аргініну порівняно з полі-L-лізином (Фіг. 19). Це також демонструє, що полі-D-лізин має дуже подібну антимікотичну активність, як і полі-L-лізин. 29 96564 30 31 96564 32 33 96564 34 35 96564 36 37 96564 38 39 96564 40 41 96564 42 43 96564 44 45 96564 46 47 96564 48 49 96564 50 51 96564 52 53 96564 54 55 96564 56 57 96564 58 59 96564 60