Застосування остеопонтину для лікування та/або запобігання неврологічному захворюванню

1. Застосування остеопонтину, вибраного з групи, яка включає: (a) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1; (b) поліпептид, який містить амінокислоти 1-168 або 170 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; (c) поліпептид, який містить амінокислоти 1-16 та 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; (d) поліпептид, який містить амінокислоти 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; (e) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; (f) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; (g) м уте їн будь-яко го з п оліп еп тиді в (а )-(f), амін окисло тна послідовність якого має щонайменше 70%, або 80%, або 90% ідентичність з щонайменше однією з послідовностей поліпептидів (a)-(f); (h) муте їн будь-якого з поліпептиді в (a)-(f), який кодується послі до вністю ДН К , яка гібридиз ується з комплементом нативної послідовності ДНК, що кодує будь-який з поліпептидів (a)-(f) за дуже жорстких умов; (і) мутеїн будь-якого з поліпептидів (a)-(f), причому всі мутації амінокислотно ї послідо вно сті є кон серва ти вними аміноки сло тн ими замінами в амінокислотних послідовностях поліпептидів (а)-(f); (j) сіль, ізоформу або гібридний білок будь-якого з поліпептидів (а)-(f); для ви го то влення лік ар сько го за со бу для лік ува ння неврологічного захворювання та /а бо запобігання неврологічному захворюванню. 2. Застосування за п. 1, причому неврологічне захворювання вибране з групи, яка включає травматичне пошкодження нерва, інсульт, демієлінізуючі захворювання центральної нервової системи або периферичної нервової системи, невропатії та нейродегенеративні захворювання. 3. Застосування за п. 1 або п. 2, причому неврологічне захворювання спричинене вродженим розладом обміну речовин. 4. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, причому неврологічним захворюванням є периферична невропатія. 5. Застосування за п. 4, причому неврологічним захворюванням є діабетична невропатія. UA (21) 20031110269 (22) 08.05.2002 (24) 26.01.2009 (86) PCT/EP02/05081, 08.05.2002 (31) 01111296.8 (32) 17.05.2001 (33) EP (46) 26.01.2009, Бюл.№ 2, 2009 р. (72) БОШЕРТ УРСУЛА, ФЕГЕР ГЕОРГ, СЕЛЬВАРАДЖУ РАГУРАМ, П АПОЯН РУБЕН, БЕРНАСКОНІ ЛІЛІЯ (73) ЕПЛАЙД РІСЬОРЧ СИСТЕМЗ ЕРС ХОЛДІНГ Н.В. (56) WO 0063241 A, 26.10.2000. WO 0124831 A, 12.04.01. WO 0037502 A, 29.06.2000. ELLISON J. A. ET AL: "OSTEOPONTIN AND ITS INTEGRIN RECEPTOR ALPHAVBETA3 ARE UPREGULATED DURING FORMATION OF THE GLIAL SC AR AFTER FOC AL STROKE" STROKE, AMERIC AN HEART ASSOCIATION, D ALLAS TX, US, vol. 29, no. 8, August 1998 (1998-08), pages 1698-1706. WANG X. ET AL: "DELAYED EXPRESSION OF OSTEOPONTIN AFTER FOC AL STROKE IN THE RAT" JOURNAL OF NEUROSCIENCE, NEW YORK, NY, US, vol. 18, no. 6, 15 March 1998 (1998-03-15), pages 2075-2083. (PREVENTION OF RELAPSES AND DISABILITY BY INTERFERON B-1A SUBCUTANEOUSLY IN MULTIPLE SCLEROSIS) STUDY GROUP P: "Randomised double-blind placebo-controlled study of interferon beta-1a in relapsing/remitting multiple sclerosis" LANCET, XX, XX, vol. 352, no. 9139, 7 November 1998 (1998-11-07), pages 1498-1504. LEE M.-Y. ET AL: "TRANSIENT UPREGULATION OF OSTEOPONTIN MRNA IN HIPPOC AMPUS AND STRIATUM FOLLOWING GLOBAL FOREBRAIN ISCHEMIA IN RATS" NEUROSCIENCE LETTERS, LIMERICK, IE, vol. 271, no. 2, 1999, pages 81-84. TAN AKA FU MI ET AL: "Association of osteopontin with ischemic axonal death in periventricular leukomalacia." ACTA NEUROPATHOLOGIC A, vol. 100, no. 1, July 2000 (2000-07), pages 69-74. ELLISON J. A. ET AL: "MATRIX REMODELING AFTER STROKE DE NOVO EXPRESSION OF MATRIX PROTEINS AND INTEGRIN RECEPTORS" 2 (19) 1 3 85368 4 6. Застосування за п. 4, причому неврологічним за18. Застосування вектора для індукування та/або хворюванням є поліневропатія. стимулювання ендогенного продукування остеопон7. Застосування за п. 2, причому неврологічним затину, вибраного з групи, яка включає: хворюванням є невропатія, спричинена хіміотерапі(a) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1; єю. (b) поліпеп тид, який місти ть амінокисло ти 1-168 8. Застосування за п. 2, причому демієлінізуючим або 170 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; захворюванням є розсіяний склероз (MS). (c) поліпептид, який містить амінокислоти 1-16 та 9. Застосування за п. 2, причому нейродегенеративне 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; захворювання вибране з-посеред хвороби Альцгей(d) поліпептид, який містить амінокислоти 170-314 мера, хвороби Паркінсона, хореї Гентингтона та ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; бічного аміотрофічного склерозу (ALS). (e) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; Застосування за будь-яким із пп. 1-9, причому (f) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; 10. остеопонтин злитий з молекулою-носієм, пеп(g) м уте їн будь-яко го з поліпеп ти ді в (a)-(f), тидом або білком, що стимулює подолання гематоамінокисло тна послідовність якого має щонаймененцефалічного бар'єра. ше 70%, або 80%, або 90% ідентичність з щонайме11. Застосування за будь-яким із пп. 1-9, причому нше однією з послідовностей поліпептидів (a)-(f); остеопонтин є пегільованим. (h) муте їн будь-якого з поліпептиді в (a)-(f), який 12. Застосування за будь-яким із пп. 1-9, причокодується послі до вністю ДН К , яка гібридиз уєтьму гібридний білок є білком, злитим з імуноглобуся з комплементом нативної послідовності ДНК, ліном (Ig). що кодує будь-який з поліпептидів (a)-(f) за дуже 13. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, жорстких умов; причому лікарський засіб додатково включає інтер(і) мутеїн будь-якого з поліпептидів (a)-(f), причому всі ферон для одночасного, послідовного або окремого мутації амінокислотно ї послідо вно сті є кон серзастосування. ва ти вними аміноки сло тн ими замінами в аміноки14. Застосування за п. 13, причому інтерфероном є слотних послідовностях поліпептидів (a)-(f); інтерферон-β. (j) сіль, ізоформу або гібридний білок будь-якого з 15. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, поліпептидів (а)-(f); причому кількість застосовуваного остеопонтину або агоніста активності остеопонтину у клітині при становить від приблизно 0,001 мг/кг маси тіла до виготовленні лікарського засобу для лікування 100 мг/кг маси тіла, або від приблизно 1 мг/кг маневрологічного захворювання та /а бо запобігання си тіла до 10 мг/кг маси тіла, або приблизно 5 мг/кг неврологічному захворюванню. маси тіла. 19. Застосування за будь-яким із пп. 16-18 для ген16. Застосування молекули нуклеїнової кислоти, яка ної терапії. містить послідовність, що кодує поліпептид, який 20. Застосування клітини, яка була генетично момістить амінокислотну послідовність, вибрану із дифікована, для продукування остеопонтину, вибгрупи, яка включає: раного з групи, яка включає: (a) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1; (a) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1; (b) поліпеп тид, який місти ть амінокисло ти 1-168 (b) поліпеп тид, який місти ть амінокисло ти 1-168 або 170 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; або 170 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; (c) поліпептид, який містить амінокислоти 1 -1 6 та (c) поліпептид, який містить амінокислоти 1-16 та 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; (d) поліпептид, який містить амінокислоти 170-314 (d) поліпептид, який містить амінокислоти 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; (e) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; (e) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; (f) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; (f) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; (g) м уте їн будь-яко го з поліпеп ти ді в (a)-(f), (g) м утеїн будь-яко го з поліпеп тиді в (а)-(f), аміамінокисло тна послідовність якого має щонайменнокисло тна послідовність якого має щонайменше ше 70%, або 80%, або 90% ідентичність із щонайме70%, або 80%, або 90% ідентичність з щонайменше нше однією з послідовностей поліпептидів (a)-(f); однією з послідовностей поліпептидів (a)-(f); (h) муте їн будь-якого з поліпептиді в (a)-(f), який (h) муте їн будь-якого з поліпептиді в (a)-(f), який кодується послідовністю ДНК , яка гібридиз укодується послі до вністю ДН К , яка гібридиз уєтьється з комплемен том на ти вно ї послідовності ся з комплементом нативної послідовності ДНК, ДНК, що кодує будь-який з поліпептидів (a)-(f) за що кодує будь-який з поліпептидів (a)-(f) за дуже дуже жорстких умов; жорстких умов; (і) мутеїн будь-якого з поліпептидів (a)-(f), причому всі (і) мутеїн будь-якого з поліпептидів (a)-(f), причому всі мутації амінокислотно ї послідо вно сті є кон сермутації амінокислотно ї послідо вно сті є кон серва ти вними аміноки сло тн ими замінами в амінокива ти вними аміноки сло тн ими замінами в амінокислотних послідовностях поліпептидів (a)-(f); слотних послідовностях поліпептидів (a)-(f); (j) сіль, ізоформу або гібридний білок будь-якого з (j) сіль, ізоформу або гібридний білок будь-якого з поліпептидів (а)-(f); поліпептидів (а)-(f); для ви го то влення лік ар сько го за со бу для або агоніста активності остеопонтину при виготолік ува ння неврологічного захворювання та /а бо вленні лікарського засобу для лікування неврологізапобігання неврологічному захворюванню. чного захворювання та /або запобігання неврологіч17. Застосування за п. 16, причому молекула нукленому захворюванню. їнової кислоти додатково містить послідовність век21. Фармацевтична композиція, яка містить остеотора експресії. понтин, визначений в одному з пп. 1 та 10-12, та 5 85368 6 інтерферон, необов'язково - разом з одним або (a) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1; декількома фармацевтично прийнятними напов(b) поліпеп тид, який місти ть амінокисло ти 1-168 нювачами, для лікування неврологічного захворюабо 170 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; вання та /а бо запобігання неврологічному захворю(с) поліпептид, який містить амінокислоти 1-16 та ванню. 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; 22. Спосіб лікування неврологічного захворювання, (d) поліпептид, який містить амінокислоти 170-314 який включає введення пацієнту, який цього потреПОСЛІДОВНОСТІ № 1; бує, ефективної кількості остеопонтину, можливо (e) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; разом із фармацевтично прийнятним носієм, причо(f) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; му остеопонтин вибрано з групи, яка включає: (g) м уте їн будь-яко го з поліпеп ти ді в (a)-(f), (а) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ №1; амінокисло тна послідовність якого має щонаймен(b) поліпеп тид, який місти ть амінокисло ти 1-168 ше 70%, або 80%, або 90% ідентичність із щонаймеабо 170 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; нше однією з послідовностей поліпептидів (a)-(f); (с) поліпептид, який містить амінокислоти 1-16 та (h) муте їн будь-якого з поліпептиді в (a)-(f), який 170-314 ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; кодується послідовністю ДНК , яка гібридиз у(d) поліпептид, який містить амінокислоти 170-314 ється з комплемен том на ти вно ї послідо вності ПОСЛІДОВНОСТІ № 1; ДНК, що кодує будь-який з поліпептидів (а)-(f) за (e) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; дуже жорстких умов; (f) поліпептид, який містить ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; (і) мутеїн будь-якого з поліпептидів (a)-(f), причому всі (g) м уте їн будь-яко го з поліпеп ти ді в (a)-(f), мутації амінокислотно ї послідо вн ості є кон серамінокисло тна послідовність якого має щонайменва ти вними аміноки сло тн ими замінами в амінокише 70%, або 80%, або 90% ідентичність із щонаймеслотних послідовностях поліпептидів (a)-(f); нше однією з послідовностей поліпептидів (a)-(f); (j) сіль, ізоформу або гібридний білок будь-якого з (h) муте їн будь-якого з поліпептиді в (a)-(f), який поліпептидів (а)-(f). кодується послі до вністю ДН К , яка гібридиз уєть24. Спосіб за п. 22, причому неврологічне захвося з комплементом нативної послідовності ДНК, рювання вибране з групи, яка включає травматичне що кодує будь-який з поліпептидів (a)-(f) за дуже пошкодження нерва, інсульт, демієлінізуючі захвожорстких умов; рювання центральної нервової системи або пери(і) мутеїн будь-якого з поліпептидів (a)-(f), причому всі феричної нервової системи, невропатії та нейродемутації амінокислотно ї послідо вно сті є кон сергенеративні захворювання. ва ти вними аміноки сло тн ими замінами в аміноки25. Спосіб за п. 22, причому неврологічним захвослотних послідовностях поліпептидів (a)-(f); рюванням є периферична невропатія. (j) сіль, ізоформу або гібридний білок будь-якого з 26. Спосіб за п. 22, причому неврологічним захвополіпептидів (а)-(f). рюванням є діабетична невропатія. 23. Спосіб лікування неврологічного захворювання, 27. Спосіб за п. 22, причому неврологічним захвоякий включає введення пацієнту, який цього потрерюванням є поліневропатія. бує, ефективної кількості остеопонтину та інтерфе28. Спосіб за п. 22, причому неврологічним захворону, можливо - разом із фармацевтично прийнятрюванням є невропатія, спричинена хіміотерапією. ним носієм, причому остеопонтин вибрано з групи, 29. Спосіб за п. 22, причому демієлінізуючим заяка включає: хворюванням є розсіяний склероз (MS). Цей винахід, взагалі, належить до галузі неврологічних захворювань та розладів. Він має відношення до захисту нервової системи, мієлінізації нервових волокон, утворення та регенерації мієлін-продукуючих клітин. Зокрема, він має відношення до демієлінізації та нейродегенеративних захворювань, невропатій, травматичного пошкодження нервових волокон, інсульту та неврологічних захворювань, що викликаються вродженими розладами обміну речовин. Конкретніше, цей винахід має відношення до застосування остеопонтину або агоніста активності остеопонтину для виготовлення лікарського засобу для лікування та/або запобігання неврологічного захворювання. Мієлінізація нервового волокна є основним процесом утворення та функціонування центральної нервової системи (ЦНС) та периферичної нервової системи. Мієлінова оболонка довкола аксонів є необхідною для відповідної провідності електричних імпульсів вздовж нервових волокон. Втрата мієліну відбувається при цілому ряді за хворювань, до яких належить розсіяний склероз, що уражає ЦНС, синдром Гійєна-Барре (гострий первинний ідіопатичний полірадікулоневрит), хронічна запальна демієлінізуюча полірадікулоневропатія (CIDP) та інші (дивись Абрамскі (Abramsky) та Овадіа (Ovadia), 1997; Тройаборг (Trojaborg), 1998, Гартунг (Hartung) та інші, 1998). Незважаючи на різну етіологію, наприклад, інфекційні патогенні мікроорганізми або автоімунні реакції, усі демієлінізуючі захворювання викликають втрату неврологічної функції і можуть призвести до паралічу та смерті. Незважаючи на те, що сучасні терапевтичні засоби послаблюють запальні реакції при розсіяному склерозі та уповільнюють прогресування захворювання, існує необхідність розробки терапевтичних заходів, які можуть призвести до ремієлінізації та відновлення неврологічної функції (Абрамскі (Abramsky) та Овадіа (Ovadia), 1997; Поло (Pohlau) та інші, 1998). Від пошкоджень центральної нервової системи, викликаних гострими ураженнями, у тому числі 7 85368 8 травмами, гіпоксією та ішемією, можуть страждати стійне пошкодження цієї ділянки головного мозку як нейрони, так і біла речовина. Хоча більша увага або навіть смерть. приділяється процесам, які ведуть до загибелі Інсультом уражаються приблизно 4 з 1000 люнейронів, дані, обсяг яких зростає, дозволяють дей. Це третя головна причина смертності у більзробити припущення, суть якого полягає у тому, шості розвинених країн, у тому числі у Сполучених що пошкодження олігодендроцитів, які мієлінізуШтатах. Частота виникнення інсульту різко зростає ють аксони, є також специфічною складовою ураз віком, причому ризик подвоюється кожні десять ження центральної нервової системи. Так, патолороків після 35-річного віку. Приблизно 5% людей гія олігодендроцитів була продемонстрована на віком понад 65 років мали щонайменш один індуже ранній стадії після інсульту (3год) у пацюків, сульт. Цей розлад у чоловіків трапляється частіше що дозволяє зробити припущення про те, що ці аніж у жінок. клітини є навіть більш уразливими до явищ підсиЯк згадувалось перед тим, інсульт включає лення токсичності, аніж нервові клітини (Пантоні втрату мозкових функцій (неврологічний розлад), (Pantoni) та інші, 1996). Одним із потенційних канщо спричинюється припиненням кровопостачання дидатів, що опосередковують загибель клітин, є ділянок головного мозку. Конкретні неврологічні виражене підвищення концентрації глутамату, яке розлади можуть різнитись у залежності від місцесупроводжує багато гострих уражень центральної знаходження, ступеню пошкодження та причини нервової системи (Ліптон (Lipton) та інші, 1994). розладу. Інсульт може викликатись обмеженням Дійсно, було встановлено, що, окрім нейронів, олікровотоку (ішемія), наслідком чого є недостатнє годендроцити також експресують функціональні кровопостачання та загибель тканин на цій ділянці рецептори глутамату, що належать до АМРА (аде(відмирання). Причиною ішемічних нападів є згустнілова кислота)/каїнатного субтипу. Більше того, ки крові, що утворюються у головному мозку (троолігодендроцити демонструють високу вразливість мби) та згустки крові або частинки атеросклеротидо застосування глутамату (Макдональд чних бляшок або іншого матеріалу, які дістаються (McDonald) та інші, 1998). до головного мозку з іншого місця (емболи). КроТравма являє собою ураження або пошковотеча (крововилив) у межах головного мозку модження нервового волокна. Це може бути травма же викликати симптоми, які нагадують інсульт. спинного мозку, яка являє собою пошкодження Найзагальнішим різновидом інсульту є інсульт спинного мозку, що уражає усі нервові функції, які унаслідок атеросклерозу (церебральний тромбоз). контролюються на рівні та нижче рівня пошкоАтеросклероз ("затвердіння артерій") являє собою дження, у тому числі контролювання м'я зів та чуттакий стан, при якому на внутрішній вистілці артеливості, або травма головного мозку, наприклад, рій з'являються жирові відкладення і утворюються травма, викликана закритим пошкодженням череатеросклеротичні бляшки (маса, яка складається з па. жирових відкладень та тромбоцитів). Оклюзія арГіпоксія головного мозку являє собою недотерії розвивається повільно. Атеросклеротичні статність кисню, конкретно, для півкуль головного бляшки не обов'язково спричинюють інсульт. Між мозку. Цей термін частіше використовують для різними мозковими артеріями існує багато невеливизначення недостатнього рівня забезпечення ких сполучень. Якщо кровоток зменшується постукиснем головного мозку у цілому. У залежності від пово, ці невеликі сполучення збільшуються у розтяжкості гіпоксії, симптоми можуть варіювати у мірах і "шунтують" закупорену ділянку межах від сплутаності свідомості до необоротного (колатеральний кровообіг). У разі достатнього копошкодження головного мозку, коми та смерті. латерального кровообігу, навіть повністю заблокоПричиною інсульту є, як правило, ішемія голована артерія може не викликати неврологічних вного мозку. Його називають також апоплексією розладів. Другий механізм безпечності у межах або апоплексичним ударом. Це група розладів головного мозку полягає у тому, що артерії є наголовного мозку, що включає втрату мозкових фустільки довгими, що закупореними можуть бути нкцій, яка має місце у разі припинення кровопос75% кровоносної судини і, незважаючи на це, кротачання до будь-якої частини головного мозку. вопостачання до цієї ділянки головного мозку все Головний мозок потребує приблизно 20% крові, ще буде здійснюватись на належному рівні. що циркулює у тілі людини. Головне постачання Тромботичний інсульт (інсульт, спричинений головного мозку на кров здійснюється через 2 артромбозом) є найпоширенішим у літніх людей і терії на шиї (сонні артерії), які у подальшому розпершопричиною у цьому разі часто виявляється галужуються у межах головного мозку на численні атеросклеротична хвороба серця або цукровий артерії, кожна з яких постачає кров до певної ділядіабет. Інсульт цього типу може трапитись будьнки головного мозку. Навіть короткочасне припиколи, у тому числі під час відпочинку. Людина монення кровотоку може викликати погіршення фунже втратити або ж залишитись при свідомості. кціонування головного мозку (неврологічний Апоплексичні удари, що спричинюються емборозлад). Симптоми різняться у залежності від уралом (рухомим згустком крові) є, найчастіше, насженої ділянки головного мозку і включають, як лідком кардіогенної емболії, тобто згустків крові, правило, такі проблеми, як зміни зору, зміни мовщо утворюються із причини серцевих розладів, і лення, обмеження рухового діапазону або чутлиякі у подальшому пересуваються до головного вості у частині тіла або зміни рівня свідомості. У мозку. Емболія може виникати також на інших діразі, якщо кровоток не відновлюється впродовж лянках, особливо там, де є атеросклеротичні блядекількох секунд, клітини головного мозку на цій шки. Ембол пересувається із кровотоком і застряє ділянці гинуть (відмирають), наслідком чого є поу невеликій артерії головного мозку. Такий інсульт трапляється раптово з негайним максимальним 9 85368 10 неврологічним розладом. Він не пов'язується з валого знаходження у незручному положенні рівнями активності і може трапитись у будь-який (наприклад, під час роботи на городі або у саду). час. При цьому розладі звичайним явищем є серКрововилив до нерва та піддання нервового цеві аритмії, які часто і виявляються причиною волокна впливу холоду або випромінювання може виникнення емболу. Пошкодження головного мозвикликати невропатію. Мононевропатія може бути ку часто є більш тяжким, аніж у разі інсульту, що наслідком прямого проростання пухлини. спричинюється церебральним тромбозом. Людина Множинна мононевропатія є, як правило, насможе втрачати або ж залишатись при свідомості. лідком судинних колагенозів (наприклад, нодозноЙмовірні наслідки погіршуються, якщо кровоносні го поліартеріїту, системного червоного вовчака, судини, пошкоджені інсультом, розриваються і ксеродерматозу, ревматоїдного артриту), саркокровоточать (геморагічний інсульт). їдозу, хвороб обміну речовин (наприклад, діабету, Периферична невропатія являє собою синдамілоїдозу) або інфекційних захворювань (наприром втрати чутливості, слабкості та атрофії м'язів, клад, хвороби Ліма, ВІЛ-інфекції). Мікроорганізми ослаблення глибоких сухожильних рефлексів та можуть викликати множинну мононевропатію шлявазомоторних симптомів, самостійно або у будьхом безпосереднього проникнення до нерва (наякій комбінації. приклад, при проказі). Згадане захворювання може уражати один Поліневропатія унаслідок гострої гарячки може нерв (мононевропатія), два або більше нервів на бути результатом дії токсину (наприклад, при дифрізних ділянках (множинна мононевропатія) або терії) або впливу автоімунної реакції (наприклад, багато нервів одночасно (поліневропатія). Уражапри синдромі Гійєна-Барре); поліневропатія, що тись може, першочергово, аксон (наприклад, при іноді виникає після вакцинації, можливо також є цукровому діабеті, хворобі Ліма, уремії або токсиавтоімунною. чними агентами), мієлінова оболонка або шванівТоксичні речовини, зазвичай, викликають поські клітини (наприклад, у разі гострої або хронічліневропатію, але, подеколи, мононевропатію. До ної запальної поліневропатії, лейкодистрофії або їх числа належать еметин, гексобарбітал, барбіпри синдромі Пйєна-Барре). Наслідком пошкотал, хлорбутанол, сульфонаміди, фенітоїн, нітродження невеликих немієлінізованих та мієлінізовафурантоїн, алкалоїди барвінку (Vinca minor), важкі них нервових волокон є, головним чином, втрата метали, моноксид вуглецю, триортокрезилфосфат, відчуття температури та болю; наслідком пошкоортодинітрофенол, багато розчинників, інші продження великих мієлінізованих нервових волокон є мислові отрути та деякі лікарські засоби для лікурухові дефекти або пошкодження пропріоцептиввання СНІДу (наприклад, зальцитабін, диданозин). них нервових закінчень. При деяких невропатіях Поліневропатію можуть викликати дефіцити (наприклад, унаслідок отруєння свинцем, застосупоживних речовин та хвороби обміну речовин. вання дапсону, укусів кліщів, при порфірії або синПричиною поліневропатії часто є дефіцит вітаміну дромі Пйєна-Барре) уражаються, головним чином, В (наприклад, при алкоголізмі, аліментарному порухові нервові волокна; у разі інших (наприклад, ліневриті (бері-бері), злоякісній анемії, ізоніазидпри раковому гангліоніті заднього корінця спинного індукованій недостатності піридоксину, синдромах мозку, проказі, синдромі набутого імунодефіциту мальабсорбції та нестримному блюванні вагітних (СНІД), цукровому діабеті або хронічній інтоксика(hyperemesis gravidamm)). Поліневропатія часто ції піридоксином) уражаються, головним чином, спостерігається при гіпотиреозі, порфірії, саркоганглії заднього корінця спинного мозку або сенсоїдозі, амілоїдозі та уремії. Цукровий діабет може рні нервові волокна з виникненням сенсорних викликати сенсорно-рухову дистальну поліневросимптомів. Подеколи уражаються також черепні патію (найчастіше), множинну мононевропатію та нерви (наприклад, при синдромі Гійєна-Барре, вогнищеву мононевропатію (наприклад, окорухохворобі Ліма, цукровому діабеті та дифтерії). Іденвого або відвідного черепного нервів). тифікування залучених різновидів допомагає виРозвиток злоякісної пухлини може викликати значити причину. поліневропатію через моноклональну гаммапатію Травма є найбільш поширеною причиною ло(розсіяна мієлома, лімфома), залучення амілоїду калізованого пошкодження одного нерва. Інтенсидо злоякісного процесу, дефіцити поживних речовна м'язова активність або примусове надмірне вин або у формі паранеопластичного синдрому. розтягнення суглобу може спричинити вогнищеву Специфічні мононевропатії: Одиночна або невропатію. До цього ж наслідку можуть призвести множинна мононевропатії характеризуються боі повторні невеликі травми (наприклад, щільне лем, слабкістю та парестезією у розміщені уражезатискування невеликого знаряддя, надмірна вібного нерва. Множинна мононевропатія є асиметрація пневматичних молотків). Параліч унаслідок ричною; нерви можуть бути уражені усі разом або здавлення або защемлення спинного мозку урапоступово. Екстенсивне ураження багатьох нервів жає, як правило, поверхневі нерви (ліктьовий, може нагадувати поліневропатію. променевий, перонеальний) на виступа х кісток Параліч ліктьового нерва часто спричинюється (наприклад, під час глибокого сну або при анастетравмою нерва у ліктьовій борозенці ліктю унаслізуванні худих або виснажених осіб і, часто, алкодок частого спирання на лікоть або асиметричним голіків) або у вузьких каналах (наприклад, синдром розростанням кісткової тканини після перелому, каналу зап'ястя). Параліч унаслідок здавлення або який був перенесений у дитинстві (пізній параліч защемлення спинного мозку може бути також насліктьового нерва). Ліктьовий нерв часто може здалідком пухлин, розростання кісткової тканини, знівлюватись у ліктьовому каналі. Спостерігається мних протезів (гіпсових пов'язок), милиць або трипарестезія та відсутність чутливості у п'ятому та середній половині четвертого пальців; привідний 11 85368 12 м'яз великого пальця, відвідний м'яз п'ятого пальчасто впродовж місяців та років. Вона часто почиця та міжкісткові м'язи є слабкими та атрофованинається з порушень чутливості у нижніх кінцівках, ми. Наслідком тяжкого хронічного паралічу ліктьопричому частіше набагато тяжче дистально аніж вого нерва є кігтиста кисть. Дослідженням проксимально. Часто вираженим є периферичне нервової провідності можна визначити місце урапоколювання, оніміння, пекучий біль або недостаження. Перед тим, як вдаватись до хірургічного тність суглобової пропріоцепції та вібраційної чутвідновлення, слід спробувати провести консерваливості. Біль часто стає інтенсивнішим у нічний тивне лікування. час, і може погіршуватись у разі торкання ураженої Синдром каналу зап'ястя є наслідком здавлюділянки або при зміні температури. У тяжких випавання серединного нерва у долонній частині поведках існують об'єктивні ознаки втрати чутливості. рхні зап'ястя між поперечною поверхневою зап'ясДілянки втрати чутливості, як правило, припадатною зв'язкою та повздовжніми сухожиллями ють на дистальні відділи кінцівок ("шкарпетким'язів, що згинають кисть руки. Згаданий синдром рукавички"). Глибокі рефлекси п'яткового та інших може бути одно- або двобічним. Здавлювання висухожиль є значно послаблені або відсутні. У разі кликає парестезію променево-долонної частини глибокого ступеню втрати чутливості на пальцях поверхні кисті руки та біль у зап'ясті та долоні; можуть з'являтись безболісні виразки або розвиподеколи біль виникає проксимально до місця ватись нейрогенна артропатія (суглоби Шарко). здавлювання у передпліччі та плечі. Біль може Недостатність чутливості або пропріоцепції може бути гострішим у нічний час. Може зникнути чутлипривести до розладів ходи. Наслідком ураження вість у долонній частині поверхні трьох перших рухових нервових волокон є слабкість та атрофія пальців; м'язи, які контролюють відведення та пром'язів. Додатково або вибірково може уражатись тидію великого пальця, можуть стати слабкими та вегетативна нервова система, наслідком чого є атрофованими. Цей синдром слід відрізняти від нічна діарея, нетримання сечі та калу, імпотенція здавлювання корінця С-6 унаслідок цервікальної або ортостатична гіпотензія. Вазомоторні симпторадикулопатії. ми різняться. Шкіра може бути блідшою та сухіПараліч перонеального нерва є, як правило, шою за нормальну, подеколи з порушенням забанаслідком здавлювання згаданого нерва проти рвлення; потіння може бути надмірним. У тяжких, бічної частини поверхні шийки малогомілкової кістривалих випадках захворювання часто спостерітки. Такий параліч є найпоширенішим серед вигаються трофічні зміни (гладка та блискуча шкіра, снажених прикутих до ліжка хворих та худи х осіб, нігті з заглибленнями або виступами, остеопороз). які мають звичку схрещувати ноги. СпостерігаєтьХарчова поліневропатія є поширеною серед ся слабкість при згинанні ступні дозаду та її вивоалкоголіків та осіб із недостатнім або порушеним роті (звисла ступня). Інколи спостерігається відсухарчуванням. Первинна аксонопатія може призветність чутливості на передньо-бічній частині сти до вторинної демієлінізації та розпаду аксонів поверхні гомілки та затилля ступні або на перетиннайдовших та найбільших нервів. Незрозуміло, що ковому просторі між першим та другим плеснами. є причиною: недостатність тіаміну або ж іншого Лікування невропатій, спричинених здавлюванням вітаміну (наприклад, піридоксину, пантотенової нерва, є, як правило, консервативним (наприклад, кислоти, фолієвої кислоти). Невропатія, обумовуникнення схрещування ніг). У разі неповних нелена недостатністю піридоксину, спостерігається, вропатій; як правило, здійснюється клінічне спояк правило, лише у осіб, що приймають ізоніазид із стереження і, зазвичай, відбувається спонтанне приводу туберкульозу; у піридоксин-дефіцитних поліпшення. Якщо видужання не відбувається, або залежних немовлят можуть спостерігатись показаним може бути хірургічне обстеження. конвульсії. Ознаки виснаження та симетричної Параліч променевого нерва (параліч плечовослабкості дистальних частин кінцівок з'являються, го сплетіння, що звичайно спостерігається у п'яяк правило, поступово, але можуть швидко прониць (унаслідок тривалого сну при незручному гресувати, подеколи супроводжувані втратою чутположенні руки) спричинюється здавлюванням ливості, парестезією та болем. Біль (тривалий, нерва проти плечової кістки, наприклад, у тому тупий, але не інтенсивний), судороги, відчуття хоразі коли рука звисає зі спинки стільця у разі інтоклоду, горіння та оніміння у задніх частинах гомілок сикації (сп'яніння) або глибокого сну. Симптоми та ступнях можуть погіршуватись у разі торкання. включають слабкість зап'ястя і розгиначів пальців У разі невизначеної етіології можуть призначатись (звисла кисть) та, подеколи, втрату чутливості на мультивітаміни, однак їхній благотворний вплив у дорсальній частині поверхні першого дорсального цьому разі не має підтвердження. міжкісткового м'яза. Лікування є подібним до того, Зрідка коли, виключно сенсорна поліневропаяке провадять у разі перонеальної невропатії, тія розпочинається з периферичних болів та пареспричиненої здавлюванням нерва. стезії і прогресує до кори головного мозку із втраПоліневропатії є відносно симетричними і частою усі х форм чутливості. Це відбувається, як то уражають чутливі, р ухові та вазомоторні нервовіддалені наслідки карциноми (особливо бронхові волокна одночасно. Вони можуть уражати аксон генної), після прийняття піридоксину у надмірних або мієлінову оболонку і, у будь-якій формі, модозах (>0,5г на добу) та при амілоїдозі, гіпотиреозі, жуть бути гострими (наприклад, синдром Гійєнамієломі та уремії. Викликана піридоксином невроБарре) або хронічними (наприклад, ниркова недопатія зникає у разі припинення прийняття піридокстатність). сину. Поліневропатія, обумовлена хворобами обміСпадкові невропатії класифікуються як сенсону речовин (наприклад, цукровим діабетом) або рно-рухові невропатії або сенсорні невропатії. М'янирковою недостатністю, розвивається повільно, зова атрофія перонеального типу (хвороба Шарко 13 85368 14 Марі-Тута) є найбільш поширеною спадковою сенлу ступню; ортопедична хірургія може допомогти сорно-руховою невропатією. Менш поширені сенстабілізувати ступню. сорно-рухові невропатії розпочинаються з нароДо нейродегенеративних захворювань наледження і спричинюють більший ступень жать, разом з іншими, хвороба Альцгеймера, хвонепрацездатності. При сенсорних невропатіях, які роба Паркінсона, хорея Гентингтона та бічний аміє рідкими, втрата больової чутливості дистальниотрофічний склероз (ALS). ми відділами кінцівок та відчуття температури є Хвороба Альцгеймера являє собою розлад, більш вираженими, аніж втрата вібраційної чутлиякий викликає погіршення розумових функцій, що є вості та відчуття положення. Головною проблемою наслідком змін тканин головного мозку. Сюди вхоє каліцтво ступні унаслідок нечутливості до болю з дить зморщування тканин головного мозку, що не частими інфекціями та остеомієлітом. спричинюється захворюваннями кровоносних суСпадкова рухо ва та сенсорна невропатія типів дин, первинне дегенеративне слабоумство та диІ та II (хвороба Шарко-Марі-Тута, м'язова атрофія фузна атрофія головного мозку. Хворобу Альцперонеального типу) є відносно поширеним, як геймера називають також старечим слабоумством правило, автосомним розладом домінантного тиальцгеймерівського типу (SDAT). Це найбільш пу, що характеризується слабкістю та атрофією, розповсюджена причина погіршення розумових головним чином, перонеальних та дистальних м'яздібностей з віком. Частота ураження цим захвозів ніг. Пацієнти можуть також страждати на інші рюванням становить приблизно 9 випадків на дегенеративні захворювання (наприклад, спадкова 10000 людей. Ця хвороба уражає жінок дещо часатаксія Фрідрейха) або мати їх у родинному анамтіше аніж чоловіків, і трапляється, головним чинезі. У пацієнтів із хворобою Шарко-Марі-Тута типу ном, у літніх осіб. І у до шкільному віці спостерігається звисла ступня Причина цієї хвороби невідома. До нейрохіміта повільно прогресуюча атрофія дистальних м'ячних факторів, які можуть приймати участь у винизів, що призводить до появи "журавлиних ніг". Хакненні цієї хвороби, належить відсутність субстанрактерна виснаженість м'язів рук з'я вляється пізцій, що використовуються нервовими клітинами ніше. Втрата вібраційної, больової та для передачі нервових імпульсів (нейромедіатотемпературної чутливості відбувається за харакрів), у тому числі ацетилхоліну, соматостатину, терною схемою ("шкарпетки-рукавички"). Глибокі субстанції Ρ та норепінефрину. До факторів нарефлекси сухожиль відсутні. Високе склепіння вколишнього середовища належить вплив алюміступні або молотоподібні пальці ступні можуть нію, марганцю та інших речовин. До інфекційних бути єдиними симптомами у менш уражених члефакторів належать пріонні (вірусоподібні мікроорнів родини, які страждають на це захворювання. ганізми) інфекції, що уражають головний та спинШвидкість нервової провідності є низькою, дистаний мозок (центральну нервову систему). У деяких льний латентний стан тривалим. Відбувається родинах (які становлять від 5% до 10% випадків) сегментна демієлінізація та ремієлінізація. Можуть існує спадкова схильність до розвитку цієї хворопальпуватись збільшені периферичні нерви. Хвоби, однак ця схильність не відповідає суворому роба прогресує повільно і не скорочує тривалість (менделівському) характеру спадковості. Діагноз, життя. Розвиток хвороби типу II відбувається повіяк правило, ставлять шляхом виключення інших льніше, слабкість, як правило, виникає на пізніших причин слабоумства. етапах життя. Пацієнти демонструють відносно Дослідники встановили, що у родинах, які манормальну швидкість нервової провідності, однак, ють численних членів із хворобою Альцгеймера, мають низьку амплітуду викликаних потенціалів. існує певна спадкова мінливість, спільна для усіх Біопсійні проби показують вторинну дегенерацію хворих на цю хворобу. Ген, що продукує речовину, нервових волокон. яку називають аполіпопротеїном Е4, не викликає Спадкова рухова та сенсорна невропатія типу хвороби Альцгеймера, однак його присутність проIII (інтерстиціальний гіпертрофічний прогресуючий сто збільшує ймовірність можливого виникнення поліневрит, гіпертрофічний неврит Дежерінацієї хвороби. Існує бага то людей, які мають ген Е4 Сотта), рідкий автосомний розлад рецесивного і у яких ніколи не виникає хвороба Альцгеймера. типу, починається у дитинстві із прогресивної слаПочаток хвороби характеризується ослабленбкості, втрати чутливості та відсутності глибоких ням пам'яті з поступовою втратою розумових фунрефлексів сухожиль. Початково цей розлад нагакцій. Можуть спостерігатись зміни настрою, урадує хворобу Шарко-Марі-Тута, однак слабкість ження мовної здатності, зміни ходи та інші зміни у рухових м'язів прогресує з більшою швидкістю. міру розвитку хвороби. Спостерігається зменшенВідбувається демієлінізація та ремієлінізація, насня розміру (атрофія) тканин головного мозку, збілідком чого є збільшення периферичних нервів та льшення шлуночків (проміжки у межах головного цибулинок, що спостерігається у разі біопсії нермозку) та поява відкладень у тканинах головного вової тканини. мозку. Діагноз підтверджується характерним розподіХвороба Паркінсона являє собою хворобу голом слабкості рухови х м'язів, деформуванням стуловного мозку, що характеризується тремтінням та пнів, родинним анамнезом та електрофізіологічтруднощами у ході, рухливості та координації руними порушеннями. Доступним є генетичний хів. Ця хвороба пов'язується з пошкодженням часаналіз; специфічного лікування немає. Корисними тини головного мозку, яка контролює рухливість можуть бути фа хові рекомендації з метою підготом'язів. Хворобу Паркінсона називають також тремвки пацієнтів молодого віку до прогресування хвотючим паралічем (paralysis agitans). роби. Імобілізація допомагає відкоректувати звисЦя хвороба уражає приблизно 2 з 1000 людей і найчастіше розвивається після 50-річного віку. 15 85368 16 Вона уражає як чоловіків, так і жінок, і є одним із У разі хореї Гентингтона невідомим залишанайбільш розповсюджених неврологічних розладів ється те, яким чином цей широко експресований у літніх людей. Термін "паркінсонізм" означає ген спричинює вибіркову загибель нейронів. Крім будь-який стан, що викликає комбінацію типів змін того, за результатами секвенування не вдалось рухливості, що спостерігається у разі хвороби Павиявити очевидної гомології з іншими відомими ркінсона, яка видається найбільш розповсюджегенами. Не були встановлені також структурні моним станом, що викликає цю груп у симптомів. Пативи або функціональні домени, які забезпечили б ркінсонізм може спричинюватись іншими чітке розуміння його функцій. Зокрема, без відпорозладами або зовнішніми факторами (вторинний віді залишається питання про те, яким чином ці паркінсонізм). широко експресовані гени спричинюють вибіркову Хвороба Паркінсона спричинюється прогресизагибель нейронів. вним пошкодженням нервових клітин частини гоБічний аміотрофічний склероз (ALS) являє соловного мозку, яка контролює рух м'язів (базальні бою розлад, що викликає прогресивну втрату нерядра та екстрапірамідна зона). На цій ділянці, за вового контролю за довільно скоротними м'язами нормальних умов, продукується допамін, що є одіз причини знищення нервових клітин у головному нією з речовин, які використовуються клітинами та спинному мозку. Бічний аміотрофічний склероз, для передачі імпульсів (медіатори). Руйнування який називають також хворобою Шарко, являє цієї ділянки головного мозку зменшує кількість собою розлад, що викликає втрату застосування допаміну, доступну для тіла. Недостатність допата контролю довільно скоротних м'язів. Нерви, які міну порушує рівновагу між допаміном та іншими контролюють ці м'язи, зморщуються і зникають, що медіаторами, такими як ацетилхолін. Без допаміну веде до втрати м'язової тканини унаслідок відсутнервові клітини є неспроможними до відповідної ності нервового стимулювання. Сила та координапередачі інформації, і це приводить до втрати м'я ція дії м'язів слабне, причому спочатку цьому підзової функції. Точна причина того, чому деградудаються довільно скоротні м'язи (м'язи, що ють клітини головного мозку, є невідомою. Згадазнаходяться під свідомим контролем, такі як м'язи ний розлад може уражати один або обидві боки рук та ніг). Ступінь втрати м'язового контролю тіла з різним ступенем втрати функції. продовжує прогресувати і відбувається ураження На додаток до втрати м'язового контролю, девсе більшої та більшої кількості м'язових груп. Моякі люди із хворобою Паркінсона впадають до стаже спостерігатись втрата нервового стимулювання ну тяжкої депресії. Хоча втрата розумових здібнонапівдовільно скоротних м'язів, таких як м'язи, які стей у молодому віці є рідким явищем, особи з контролюють дихання та ковтання. Не спостерігатяжкою хворобою Паркінсона можуть демонструється негативного впливу на здатність думати або вати загальне погіршення розумових здібностей (у міркувати. Причина цієї хвороби невідома. тому числі слабоумство, галюцинації тощо). СлаБічний аміотрофічний склероз уражає приблибоумство може також бути побічним ефектом дезно 1 зі 100000 людей. У деяких випадках на цю яких лікарських засобів, що застосовуються для хворобу постійно страждають деякі родини. Згадалікування цієї хвороби. ний розлад уражає чоловіків частіше аніж жінок. Хорея Гентингтона являє собою спадкову авСимптоми, як правило, з'являються у дорослому тосомну неврологічну хворобу домінантного типу. віці, часто аж після 50 років. Ця хвороба не є поширеною і уражає приблизно 1 Травматичне пошкодження нервів може стоз 10000 індивідів (Брайтон (Breighton) та Хайден сува тись центральної або периферичної нервової (Hayden), 1981). Згадана хвороба набуває клінічсистеми. Черепно-мозкова травма (ТВІ), яку також них ознак не раніше п'ятої декади життя і викликає просто називають травмою черепа або закритою психіатричні відхилення, мимовільні рухові розлачерепною травмою (СНІ), являє собою травму з ди та погіршення розумових здібностей, що пов'япошкодженням головного мозку унаслідок зовнішзується з невблаганним прогресування до смерті, нього удару по голові. Це найчастіше трапляється яка настає, як правило, через 17 років після початпід час дорожньо-транспортних пригод, однак моку захворювання. же бути і результатом утоплення без летального Ген, що відповідає за хорею Гентингтона, нанаслідку, серцевого нападу, інсульту та інфекцій. зивають гентингтином. Він знаходиться на хромоТравматичне пошкодження головного мозку такого сомі 4р і являє собою ефективний засіб постановтипу могло б, звичайно, бути наслідком припиненки передклінічного та антенатального діагнозу. ня постачання кисню або крові до головного мозку Генетична аномалія полягає у надмірній кількості і його можна, таким чином, називати "гіпоксийною тандемно повторюваних нуклеотидних послідовтравмою". ностей CAG. Черепно-мозкова травма або закрита черепна Збільшення розміру повтору CAG у осіб, хвотравма є наслідком удару по голові, наприклад, під рих на хорею Гентингтона, демонструє високозначас дорожньо-транспортної пригоди або падіння. У чущу кореляцію з віком появи клінічних симптомів. цьому разі череп ударяється об нерухомий об'єкт, Цей зв'язок є особливо вражаючим у осіб з появою і головний мозок, що знаходиться усередині черехореї Гентингтона у юнацькому віці, у яких ця анопа, обертається та крутиться на своїй осі (стовбур малія набуває дуже великих розмірів, як правило, мозку) зі спричиненням локалізованого або широбільше за 50 повторів. Довжина повторів CAG у кого пошкодження. Таким чином головний мозок, родинах, хворих на хорею Гентингтона, демонякий являє собою м'яку масу, оточену рідиною, що струє деяку нестабільність, яка є особливо помітнадає йому можливість "плавання", може вдаряною, коли діти спадкують ген гентингтин від уратись і відскакувати від черепа, що спричинює одежених батьків. ржання додаткових пошкоджень. 17 85368 18 Негайно слідом після травми може йти період дві головні групи пошкоджень: відкриті травми та непритомності, тривалість якого може визначатись закриті травми. хвилинами, тижнями або місяцями. З причини пеПри відкритих травмах відбувається безпосерекручування та відскакування, головний мозок реднє пошкодження спинного мозку та нервових пацієнта із травматичним пошкодженням одержує, корінців. Наскрізні травми можуть спричинювати як правило, численні травматичні пошкодження та широкі розриви та кровотечі. Закритими травмами забиті місця. Це називають дифузною травмою є більшість спінальних травм, і вони, як правило, або "незосередженим пошкодженням" головного пов'язуються з переломом/вивихом хребта, що, як мозку. Типи мозкових травм, що трапляються під правило, виявляється при рентгеноскопічному час незосереджених пошкоджень, можуть класиобстеженні. Пошкодження спинного мозку залефікуватись як первинні або вторинні. жить від ступеню пошкодження кісток і може підПервинні травми головного мозку виникають розділятись на два головні етапи: первинне попід час пошкодження, головним чином, на місцях шкодження, яким є контузії, розсікання нервових удару, зокрема, у разі наявності тріщини черепа. волокон та геморагічний некроз, і вторинне пошкоВеликі контузії можуть пов'язуватись із внутрішдження, яким є екстрадуральна гематома, інфаркт, ньомозковим крововиливом або супроводжуватись інфекція та набряк. розривами кори мозку. Розсіяні пошкодження акЗалишковими явищами пошкодження спинносонів виникають як наслідок зсувів та відносної го мозку є: вторинна дегенерація пошкоджених деформації розтягненням відростків нейронів, які висхідних або низхідних нервових волокон, постспричинюються ротаційними рухами головного травматична сирингомієлія та системні явища памозку у межах черепа. Можуть виникати невеликі раплегії, наприклад, інфекція сечових шляхів та геморагічні ураження або розсіяні травми аксонів, грудної клітки, пролежні та виснаження м'язів. які можуть виявлятись лише шляхом мікроскопічНеврологічні розлади можуть додатково виного дослідження. кликатись вродженими захворюваннями обміну Вторинні травми головного мозку виникають як речовин. Мієлінові оболонки, що вкривають багато результат ускладнень, що розвиваються після нервових волокон, складаються з ліпопротеїнових моменту пошкодження. До їх числа належить внушарів, що утворюються на початку життя. Мієлін, трішньочерепний крововилив, травматичне поутворений олігодендроглією у центральній нервошкодження екстрацеребральних артерій, утворенвій системі, відрізняється хімічно та імунологічно ня внутрішньочерепної грижі, гіпоксийне від мієліну, який був утворений шванівськими кліпошкодження головного мозку або менінгіт. тинами периферичної нервової системи, однак Відкрита черепно-мозкова травма є видимим мієлін обох типів має однакову функцію: стимулюрезультатом удару по голові і може бути наслідком вати передачу нервового імпульсу вздовж аксона. вогнепальної рани, дорожньо-транспортної пригоБагато вроджених захворювань обміну речоди або виникнути під дією предмету, що проходить вин (наприклад, фенілкетонурія та інші аміноацичерез череп до головного мозку ("зосереджене дурії; хвороба Тея-Сакса (рання дитяча амавротипошкодження головного мозку"). У разі черепної чна ідіотія), хвороба Німанна-Піка (лшоїдний травми такого типу більш ймовірним є пошкодженгістіоцитоз) та хвороба Гоше (спадковий глюкоценя конкретної зони головного мозку. реброзидоз); синдром Гурлера (мукополісахариТак звані легкі травми головного мозку можуть доз І типу); хвороба Краббе (глобоідно-клітинна траплятись без втрати свідомості або, можливо, лейкодистрофія Краббе) та інші лейкодистрофії) лише з нетривалим відчуттям приголомшення або негативно впливають на мієлінову оболонку, що сплутаності свідомості. Хоча медична допомога, розвивається, головним чином, у центральній нерщо надається, може бути мінімальною, особа із вовій системі. Якщо біохімічний дефект не буде травмою головного мозку без коми може зазнававиправлений або компенсований, наслідком явти симптомів та порушень, подібних до тих, що ляться постійні, часто широкі, неврологічні розлабули перенесені особою, що вижила після коматоди. зної травми. Наприклад, хвороба Краббе або глобоїдноЯк реакція на травму, у головному мозку відклітинна лейкодистрофія Краббе являє собою буваються зміни, що потребують постійного контрозлад, при якому відбувається ураження білої ролювання для запобігання додаткового пошкоречовини периферичної та центральної нервових дження. Розмір головного мозку після тяжкої систем. Наслідком мутацій гена лізосомного ферчерепно-мозкової травми часто збільшується. Це менту галактоцереборозидази (GALC) є низька називають набуханням мозку, і воно відбувається ферментативна активність та ослаблена здатність у разі збільшення кількості крові, що надходить до до розщеплення галактоліпідів, які знаходяться головного мозку. На пізніших стадіях перебігу хвомайже виключно у мієліні. Процес мієлінізації роби у головному мозку може збиратись вода, що та/або ремієлінізації, що триває у пацієнтів, потреназивають набряком мозку. Наслідком як набуханбує функціональних ендогенних олігодендроцитів ня, так і набряку є надмірне підвищення тиску у або трансплантування нормальних олігодендроголовному мозку, який називають внутрішньочецитів чи стовбурови х клітин, які можуть диференрепним тиском ("ІСР"). ціюватись у олігодендроцити, з метою забезпеТравми спинного мозку є причиною більшості чення достатнього рівня експресії GALC (Венгер випадків госпіталізування із приводу параплегії та (Wenger) та інші, 2000). тетраплегії. Більше за 80% є результатом дорожНейрофіброматоз 1 (NF1) являє собою заганьо-транспортних пригод. Клінічно розпізнаються льний автосомний розлад із широким діапазоном неврологічних проявів. 19 85368 20 Множинна системна атрофія (MSA) являє совстановлені мутаціїмітохондріальної ДНК, що бою спорадичне нейродегенеративне захворюспадкується по материнській лінії. вання невідомої етіології, що з'являється у доросHTLV-асоційована мієлопатія (HTLV - вірус лому віці. Цей стан може займати унікальне місце людського Т-клитинного лейкозу), повільно просеред нейродегенеративних захворювань завдяки гресуюче захворювання спинного мозку, що пов'япомітній, якщо не головній, ролі, яка відіграється зується з інфікуванням людським Т-клітинним ліолігодендрогліальними клітинами у патогенетичмфотрофним вірусом, характеризується ному процесі. Головна відмінність від хвороби Паспастичною слабкістю обох ніг. ркінсона полягає у тому, що пацієнти, хворі на Додаткові неврологічні розлади включають множинну системну атрофію, не реагують на лікуневропатії з аномальною мієлінізацією; огляд цих вання L-ДОФА. розладів наведено нижче. Демієлінізація на пізніших етапах життя є хаІмунні: гостра невропатія, синдром Гійєнарактерною ознакою багатьох неврологічних розБарре, хронічна невропатія, хронічна імунна деміладів; вона може бути результатом пошкодження єлінізуюча полірадикулоневропатія (CIDP), баганервових волокон або мієліну унаслідок місцевої товогнищева CIDP, багатовогнище ва невропатія травми, ішемії, впливу токсичних речовин або зарухових нервів (MMN), анти-MAG (міннесотовий хворювань обміну речовин. Існують також дані, що антилімфобластний глобулін) синдром, синдром демієлінізація може додавати свій внесок до шиGALOP, синдром анти-сульфатидних антитіл (із зофренії. Слідом за екстенсивною втратою мієліну сироватковим М-білком), синдром анти-GM2 антиіде, як правило, переродження аксонів і, часто, тіл, синдром POEMS, поліневропатична органомепереродження тіла клітини. Обидва згадані процегалія, ендокринопатія або набряк, М-білок, переси можуть бути необоротними. Однак у багатьох родження шкіри, периневрит, синдром випадках відбувається ремієлінізація і репарація, (періодичний) IgM анти-GDlb антитіл. регенерація та повне відновлення нервової функТоксини: дифтерія, жостер, гексахлорофен, ціції може бути швидким процесом. Демієлінізація анат натрію, телур. нервових волокон центральної нервової системи Лікарські засоби: Головним чином, демієліні(тобто спинного мозку, головного мозку або зорозуючі: хлороквін (chloroquine), FK506 (такролім вих нервів) є переважним наслідком первинних (tacrolimus)), пергексилін (perhexiline), прокаїнамід демієлінізуючих захворювань, етіологія яких є не(procainamide), цимельдин (zimeldine); змішані девідомою. Найвідомішим із цих захворювань є розмієлінізуючі/аксонні: аміодарон (amiodarone), синсіяний склероз (MS). дром еозинофілії-міалгії, голд (gold), сурамін Характерними ознаками гострого дисемінова(suramin), таксол (taxol). ного енцефаломієліту, постінфекційного енцефаСпадкові: вуглевод-де фіцитна глікопротеїнова ломієліту є периваскулярна демієлінізація центраневропатія, катаракти/лицьовий дисморфізм, синльної нервової системи, яка може відбуватись дром Коккейна, вроджена гіпомієлінізація, вроджеспонтанно, але, як правило, відбувається після на м'язова дистрофія: мерозин-дефіцитна, синдвірусної інфекції або вакцинації вірус-вакциною ром Фарбера (вроджений дисемінований (або, дуже рідко, вакцинації бактеріальною вакцизлоякісний ліпогранулематоз), HMSN (спадкова ною), що дозволяє припустити імунологічну причибагатовогнищева склеротизуюча невропану. Гострі запальні периферичні невропатії після тія)/хронічний розсіяний тендиніт домінантного вакцинації вірус-вакциною або синдрому Гійєнатипу: ІА, IB, III, HNPP, EGR2, термочутлива, рецеБарре (гострий первинний ідіопатичний полірадісивного типу: III (гіпертрофічний неврит Дежерінакулоневрит) є подібними демієлінізуючими розлаСотта); 4 А; 4В; 4В2; 4С; 4D (LOM), 4E, 4F; H MSN-R дами з таким саме гіпотетичним імунопатогенезом, (спадкова багатовогнищева склеротизуюча неврооднак вони уражають лише периферичні структупатія рецесивного типу); ЦНС, зчеплена з Хри. хромосомою: IX, хвороба Краббе (дифузний інфаМета хроматична лейкодистрофія являє собою нтільний склероз Краббе), синдром Марінескуще одне демієлінізуюче захворювання. АдреноШегрена, метахроматична лейкодистрофія, хволейкодистрофія та адреномієлоневропатія є рідроба Німанна-Піка (ліпоїдний гістіоцитоз), хвороба кими зчепленими із Х-хромосомою захворювання Пуліцеуса-Мерцбахера (суданофільна лейкодистобміну речовин рецесивного типу, які характерирофія) (PLP), синдром Рефсума, пріонний білок зуються дисфункцією надниркових залоз та широ(РrР27-30): мутація Glu200Lys, хвороба Крейтцкою демієлінізацією нервової системи. Адренолейфельда-Якоба (кортико-стріоспінальна дегенеракодистрофія трапляється у молодих хлопців, ція), мишача модель: надекспресія пріонів, хвороадреномієлоневропатія у підлітків. Можуть мати ба Салла, SOX10, тенасцин-ХА, нерівномірне місце погіршення розумових здібностей, м'язова ущільнення периферичних мієлінових оболонок, спастичність та сліпота. Адренолейкодистрофія є синдром Елерса-Данлоса (гіпереластична шкіра). незмінно фатальною. Вивчаються харчовий та Обміну речовин (незвичні): діабет (унаслідок імуномодуляторний методи лікування. одночасної хронічної імунної демієлінізуючої поліСпадкова атрофія зорового нерва Лебера та невропатії), гіпотиреоз, хвороби печінки. споріднені мітохондріальні розлади характеризуМіто хондріальні: синдром MNGIE, міопаються, головним чином, двобічною втратою центтія/зовнішня хронічна офтальмоплегія, невропатія, рального зору і уражають, як правило, молодих енцефалопатія шлунково-кишкового тракту, синдчоловіків віком 19-20 років. Спадкова атрофія зором NARP, невропатія, атаксія, ретиніт, пігменторового нерва Лебера може нагадувати ретробульза. барний неврит при розсіяному склерозі. Були 21 85368 22 Інфекції: хвороба Крейтцфельда-Якоба (корванням провідності нервових імпульсів. У пацієнтико-стріоспінальна дегенерація), дифтерія, ВІЛ: тів, хворих на розсіяний склероз, спостерігається асоційована хронічна імунна демієлінізуюча політакож розсікання та загибель аксонів (Б'яртмар невропатія, проказа: лепроматоз; змішана аксон(Bjartmar) та інші, 1999). Результати досліджень демієлінізуюча невропатія; колонізовані шванівські патологічного матеріалу показали, що основне клітини, різновид хвороби Крейтцфельда-Якоба. ураження обмежується зоровими нервами, периДодаткові подробиці можна одержати на навентрикулярною білою речовиною, стовбуром моведеному далі інтернет-сайті: зку та спинним мозком (Сторч (Storch) та інші, http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/my 1998). Наслідками цих дефектів ЦНС є симптоми elin.html. гострої диплопії, оніміння та непевна хода, а також Розсіяний склероз (MS) являє собою запальне хронічні симптоми, наприклад, спастичний парадемієлінізуюче захворювання центральної нервопарез та нетримання. вої системи (ЦНС), яке набуває рецидивноМолекулярні механізми, що лежать у основі ремітуючого або прогресуючого перебігу. Розсіяпатогенезу розсіяного склерозу, як видається, коний склероз є не тільки демієлінізуючим захворюріняться у генетичних факторах та факторах наванням. Двійником цього захворювання у перифевколишнього середовища, у тому числі вірусних та ричній нервовій системі є хронічна запальна бактеріальних інфекціях. Ці механізми стимулюдемієлінізуюча полірадикулоневропатія (CIDP). ють посилену міграцію Т-лімфоцитів та макрофагів Крім того, існують гострі монофазні розлади, такі через гематоенцефалічний бар'єр до тканини як запальна демієлінізуюча полірадикулоневропацентральної нервової системи. тія, яку називають синдромом Гійєна-Барре (GBS) Демієлінізація спричинюється нападом на мієу периферичній нервовій системі та гострий диселін активованих макрофагів та мікроглії, а також мінований енцефаломієліт (ADEM) у центральній пошкодженням мієлінізуючих клітин, механізм яконервовій системі. Як розсіяний склероз, так і синдго коріниться у передачі сигналу Fas-лігандом та ром Гійєна-Барре є гетерогенними синдромами. У комплемент- або антитіло-опосередкованій циторазі розсіяного склерозу різні екзогенні фактори токсичності. Таким чином, демієлінізація відбуваразом із генетичними факторами можуть призвесється унаслідок як безпосереднього нападу на ти до перебігу захворювання, який, врешті-решт, мієлінові оболонки, так і унаслідок знищення клівідповідатиме діагностичним критеріям. При обох тин, які продукують та підтримують мієлін. захворюваннях пошкодження аксонів може додаГенетичні елементи та елементи навколишватись до переважно демієлінізуючого ураження і нього середовища викликають підвищений приспричинювати постійні неврологічні розлади. плив запальних клітин через гематоенцефалічний Розсіяний склероз є найбільш поширеним із бар'єр. Наслідком цього є посилена міграція автовищезгаданих демієлінізуючих захворювань. Це реактивних Т-лімфоцитів та макрофагів до тканини захворювання характеризується як автоімунний центральної нервової системи. Секретування цирозлад, під час якого лейкоцити імунної системи токіну Т-клітинами активує антиген-презентуючі "атакують" білу речовину центральної нервової клітини (APCs). Коли автореактивні Т-клітини у системи(ЦНС). Може також уражатись сіра речоконтексті молекул головного комплексу гістосумісвина. Незважаючи на те, що точна етіологія розсіності класу II на антиген-презентуючих клітинах яного склерозу є невідомою, сприяючими фактозустрічають гіпотетичні "антигени розсіяного склерами можуть бути генетичні, бактеріальна та розу", якими часто є білкові складові мієлінової вірусна інфекція. У своєму класичному прояві оболонки, вони можуть активува тись. У такому (85% усіх випадків) розсіяний склероз характериразі можуть спрацьовувати декілька подальших зується почерговими рецидивно/ремітуючими фамеханізмів із пошкодженням олігодендроцитів та зами, які відповідають нападам порушення невромієліну. Більша частина пошкоджень у деяких палогічних функцій, що тривають впродовж декількох цієнтів може спричинюватись комплемент- та антижнів після значного або повного видужання (Нотитіло-опосередкованою цитотоксичністю, у той узворті (Noseworthy), 1999). Періоди ремісії з чачас як у інших біла речовина може піддаватись сом стають коротшими. Після цього багато пацієннападу у результаті передачі сигналу Fas-лігандом тів вступають до кінцевої фази захворювання, яка та виділення CD4+ Т-клітинами передзапальних характеризується поступовою втратою неврологіцитокінів, наприклад, TNF (некротичний пухлинний чних функцій із частковим відновленням або без фактор)-a. Активовані макрофаги можуть також відновлення. Це називають вторинним прогресиввідігравати роль за посередництвом підсиленого ним розсіяним склерозом. Невелика частка (~15% фагоцитозу та секретування факторів. Це виклиусі х пацієнтів, хворих на розсіяний склероз) стракає широку демієлінізацію та подальшу втрату ждає від поступового та безперервного погіршення провідної ефективності серед аксонів центральної неврологічних функцій з самого початку захворюнервової системи. Подальші репараційні механізвання (первинний прогресивний розсіяний склеми можуть, однак, започаткувати ремієлінізацію роз). Зараз не існує певних способів лікувального після припинення запального процесу. Ремієлінівпливу на найтяжчі форми розсіяного склерозу, зовані аксони пацієнтів, що страждають на розсіяякі, як правило, є фатальними. ний склероз, розпізнаються при дослідженні патоГоловною ознакою розсіяного склерозу є демілогічного матеріалу завдяки тонким оболонкам єлінізаційні бляшки з утворенням реактивного глідовкола ремієлінізованих аксонів. У демієлінізоваального рубця, які спостерігаються у білій речовині них аксонних мембранах часто виявляються додаголовного та спинного мозку. Демієлінізація пов'яткові натрієві канали, які компенсують втрату прозується з функціональним погіршенням або блокувідної ефективності. Попередники олігодендроглії 23 85368 24 можуть стимулювати ремієлінізацію уражень, що O2А. Ці клітини можуть породжувати олігодендровиникають у разі розсіяного склерозу. цити або астроцити типу 2. Розвиток продовжуєтьОлігодендроцит виконує численні функції, пося через передолігодендрогліальні та передв'язані із продукуванням ним та підтримкою мієліGA1C+ стадії перед фактичною диференціацією на нової оболонки. Він забезпечує ізоляцію, підтримку олігодендроцити. Кінцеві етапи олігодендрогліальта стимулювання провідності для аксонів численного напрямку диференціації визначаються незданих нейронів. Один олігодендроцит може мієлінітністю цих клітин до проліферації. Зрілі олігодендзувати до 50 різних аксонів. Мієлінізація обмежуроцити, разом з експресією мієлін-специфічних ється лише певними аксонами великого діаметру; білків, експресують клітинно-специфічні маркери дендрити та інші відростки клітини, наприклад, GA1C та сульфатид (SUL). відростки астроцитів, залишаються немієлінізоваОлігодендроцити, таким чином, диференціюними. Аксони, як видається, здійснюють контроль ють із мітотично активних мігруючих клітиннад рядом мієлінізуючих оліщдендроцитів, оскільпопередників. Після того як ці клітини стають постки розсікання аксонів у парадигмі зорового нерва мітотичними, вони транскрибують та транслюють пацюка пригнічує відновлення мієліну та продукугени, що кодують мієлін-специфічні білки. Виробвання попередника олігодендроциту (оглядова лення мієлінової оболонки, що обгортає аксон, стаття Баррес (Barres) та Рафф (Raff), 1999). Прозапускається прямим контактом між відростками ліферація та міграція олігодендроцитів може стизрілого олігодендроциту та самим аксоном. Промулюватись факторами, що виділяються аксонами цес утворення оболонок аксонів центральної неру процесі розвитку. Таким чином, кількість олігодевової системи завершується ущільненням мієлінондроцитів та аксонів чітко узгоджується у межах вої оболонки, яка, у своїй кінцевій формі, нагадує центральної нервової системи. рідкий кристал, що містить макромолекули у склаОлігодендроцити, перинейронні опорні клітини дній формації (Шерер (Scherer), 1997). Стимулюцентральної нервової системи, мієлінізують провівання мієлінізації потребує розгляду точного стедні шляхи аксонів і служать для підсилення трансхіометричного відношення між окремими дукції імпульсів. Вони відіграють роль у виживаноструктурними білками мієлінової оболонки, оскільсті та функціонуванні аксонів. Слід звернути увагу ки наслідком збільшення або зменшення кількості на те що, як показано на схемі, олігодендроцит однієї складової може бути порушення усієї стр укпростягає лише один відросток до кожного аксона, тури оболонки. який він мієлінізує. Нездатність олігодендроцитів до підтримуванБагатошарова мієлінова оболонка є спеціаліня репарації демієлінізованих аксонів додає свій зованою ділянкою плазматичної мембрани гліальвнесок до кумулятивної неврологічної дисфункції, них клітин, що є багатою на ліпіди і бідною на біщо характеризує розсіяний склероз. Стимулюванлок. Вона використовується для підтримування ня ремієлінізації у пацієнтів, хворих на розсіяний аксонів та поліпшення ефективності проведення склероз, може захистити від втрати аксонів і, тим електричних сигналів у центральній нервовій сиссамим, обмежити прогресування непрацездатностеми шляхом запобігання втрати заряду до навкоті, пов'язаної із загибеллю аксонів у центральній лишньої тканини. Перехвати Ранвьє являють сонервовій системі. бою ділянки оболонки вздовж аксона, де Демієлінізуючий фенотип розсіяного склерозу відбувається стрибкоподібна провідність. обумовлює необхідність проведення екстенсивних У головному мозку дорослої особи олігоденддосліджень відносно природи активних склеротичроцити розвиваються із все ще слабо вивчених них уражень. Оголені аксони та відсутність мієлініклітин-попередників у субвентрикулярній зоні та у зуючих олігодендроцитів вказує на руйн ування спинному мозку (Найт-Умесмар (Nait-Oumesmar) нормального мієліну та відхилення у процесі реміта інші, 1999). Ці попередники є проліферативними єлінізації, пов'язані з розсіяним склерозом. Було і експресують мієлінові транскрипти та білки; спепоказано, що приблизно 40% склеротичних ураршу вони з'являються у вентральній ділянці спинжень демонструє ознаки передчасно припиненої ного мозку зародка за декілька тижнів до мієлініремієлінізації, зокрема, на початкових стадіях зазації (Хайгоссейні (Hajihosseini) та інші, 1996). хворювання (Прінеас (Prineas) та інші, 1993). Це Процес мієлінізації відбувається у постнатальному показує реальні перспективи щодо того, що розвиголовному мозку. У процесі постнатального розвиток стратегій стимулювання відновлення мієліну тку ці попередники мігрують до нейронних шляхів, може запобігти постійному пошкодженню нервової які повинні мієлінізуватись. системи. Ймовірність успіху є особливо високою у Олігодендроцити визрівають зі своїх клітинразі ушкоджень центральної нервової системи, які попередників визначеним та специфічним чином з'явились дещо пізніше, і які, як уже було показано, (дивись огляд, наприклад, у Роджістер (Rogister) були піддані початковій ремієлінізації. Однак мієта інші, 1999). Розвиток олігодендроциту прохолінізуючий або ремієлінізуючий олігодендроцит є дить певним шляхом, кожен етап якого позначаклітиною, що знаходиться у стані надзвичайного ється декількома клітинно-специфічними маркеметаболічного стресу, і яка під тиском навіть нерами: фактор адгезії ендотеліальних невроцитів значних додаткових пошкоджень може бути не(E-NCAM), віментин, А2В5, фактор транскрипції оборотно зруйнованою (Сколдінг (Scolding) та ЛаPOU Tst-1/Oct6/SCIP, передолігодендробластний ссман (Lassmann), 1996). Це зменшує ймовірність антиген (РОА), галактоцереброзид (GA1C), O1, O4 спонтанного відновлення у активному склеротичта мієлін-специфічні білки PLB, МВР та MOG. Нейному ушкодженні, де запалення та інші пошкоронні стовбурові клітини породжують біполярні дження стають перешкодою для ремієлінізації. перед-GD3+ клітини, які стають попередниками Стратегії, що стимулюють відновлення мієліну, 25 85368 26 можуть, таким чином, забезпечити додаткові переції клітин олігодендроцитарного напрямку дифеваги на користь ремієлінізації та захисту аксонів у ренціації, вказує на позитивні перспективи активних склеротичних ураженнях. ремієлінізації як терапевтичної стратегії для розсіБуло показано, що центральна нервова сисяного склерозу. Важливо було б також ідентифікутема дорослої людини включає в себе клітинивати молекули, які пригнічують синтез мієліну, попередники олігодендроцитів, які є здатними до оскільки вони можуть знижувати ефективність проліферації, і які можуть визрівати у мієлінізуючі стратегій відновлення, наприклад, трансплантуолігодендроцити. Видається, крім того, що попування олігодендрогліальних клітин при розсіяному ляції ендогенних попередників олігодендроцитів, склерозі. прилеглі до склеротичних уражень, вичерпуються Процес ремієлінізації міг би спрацювати у спопід час хронічних стадій захворювання унаслідок лученні із протизапальними шляхами загоєння пригнічення здатності цих попередників до проліпошкодження та захисту аксонів від розсікання та ферації та диференціації (Волсвік (Wolswijk), загибелі. 1998). Такі клітини-попередники знаходяться, як Олігодендроцити можуть бути індуковані до правило, у стані спокою у оточенні хронічного ремієлінізації аксонних трактів у центральній нерсклеротичного ураження, що перешкоджає їм привовій системі, з внесенням, тим самим, вкладу до йняти активну участь у ремієлінізації. Ситуація при поліпшення хворобливого стану. Стимулювання хронічних склеротичних ураженнях, таким чином, ремієлінізації могло б протидіяти попередньому залучає фактори, що перешкоджають регенерації пошкодженню, яке було спричинене вторгненням олігодендроглії або при ній бракує факторів, необклітин імунної системи до тканини центральної хідних для стимулювання популяції клітиннервової системи та їх нападом на мієлінові обопопередників олігодендроцитів (Волсвік (Wolswijk), лонки. 1998). Ця концепція веде до гіпотези, яка полягає Декілька аналізів диференціації олігодендрогу тому, що е фективна терапія розсіяного склерозу ліальних клітин та уражень при розсіяному склероне повинна обмежуватись пригніченням запалензі здійснили із застосуванням візуалізації мікропоня, але повинна також сприяти ремієлінізації. Реслідовностей диференційної експресії генів (DGE, мієлінізуючі клітини можуть походити з різноманітScarlato (Скарлато) та інші, 2000; Уітні (Whitney) та них джерел, у тому числі вони можуть бути з числа інші, 1999). Для аналізу різних наборів генів були нативних для цього ураження олігодендроцитів, використані суттєво інші методики одержання пощо залишились живими, клітин, які одержали зі слідовностей. Результати аналізу експресії генів як згаданих олігодендроцитів, що залишились живиу олігодендроцитів у процесі диференціації, так і ми, або прилеглих клітин-попередників. Було покапри склеротичних ураженнях, продемонстрували зано, що індукування зрілих олігодендроцитів до значні зміни у експресії мієлін-специфічних генів. дедиференціації та проліферації може здійснюваКрім того, були точно визначені інші гени як такі, тись такими факторами, наприклад, як основний що регулюються диференційовано. Було відомо, фактор росту фібробластів (bFGF), що дозволяє що багато з них є залученими до таких процесів, припустити існування механізму регенерації олігояк контроль клітинного циклу, реорганізація цитосдендрогліального напрямку диференціації після келету та спрямована черезоболонкова міграція демієлінізуючої хвороби (Грінспан (Grinspan) та (Скарлато (Scarlato) та інші, 2000). інші, 1996; Грінспан (Grinspan) та інші, 1993). Остеопонтин являє собою високофосфорилоДодаткові свідчення щодо позитивних ефектів ваний сіалопротеїн, що є одним із головних комремієлінізації при демієлінізуючих розладах, таких понентів мінералізованих екстрацелюлярних матяк розсіяний склероз, надаються дослідженнями, риксів кісток та зубів. Характерним для проведеними з факторами росту глії як лікувальостеопонтину (OPN) є присутність послідовності ними засобами на тваринних моделях цього заполіаспарагінової кислоти, ділянок фосфорилухворювання. На мишачій моделі (експериментальвання Ser/Thr, яке опосередковує зв'язування гідний автоімунний енцефаломієліт) розсіяного роксиапатиту, та висококонсервативного мотиву склерозу було показано, що фактор росту глії 2 RGD, який опосередковує прикріплення клі(нейрогулін/GGF-2), фактор росту центральної тин/передачу сигналу. Експресія остеопонтину у нервової системи, який, як відомо, стимулює прорізноманітних тканинах вказує на численні функції, ліферацію та виживаність олігодендроцитів, защо залучають один або декілька з цих консерватримує початок захворювання, полегшує клінічну тивних мотивів. У той час як відсутність явно витяжкість та скорочує частоту рецидивів (Марконні раженого фенотипу у мишей з "нокаутом" OPN не (Marchionni) та інші, 1999). Було показано, що нейдозволяє встановити точно визначену роль остеорегулін має позитивний ефект на виживаність зріпонтину у будь-якій тканині, результати нещодавлих олігодендроцитів і продукується аксонами ніх досліджень надали деякі нові та цікаві факти (Фернандес (Fernandez) та інші, 2000). щодо універсальності цього білка у різних біологіБуло показано, що інші фактори росту, у тому чних явищах, у тому числі еволюційних процесах, числі тромбоцитарний фактор росту (PDGF) та заживленні ран, імунологічних реакціях, онкогенеінсуліноподібний фактор росту (IGF-1), стимулюзі, резорпції кісток та кальцифікації. Здатність осють ремієлінізацію і демонструють терапевтичні теопонтину до стимулювання активності клітин ефекти на моделях експериментального автоімунчерез численні рецептори, пов'язані з декількома ного енцефаломієліту (огляд у Дюбуа-Дальк інтерактивними сигнальними шляхами, може слу(Dubois-Dalcq) та Муррей (Murra y), 2000). Успіх, жити поясненням більшої частини його функціонадосягнутий зі стимулюванням ремієлінізації шляльної універсальності (Содек (Sodek) та інші). хом індукування проліферації та/або диференціа 27 85368 28 Було показано також, що остеопонтин експреферон, індукований одним вірусом, є ефективним сується первинними сенсорними нейронами у проти цілого ряду інших вірусі в. Вони, однак, є спинному мозку та трійчастому нерві пацюків як у видоспецифічними, тобто інтерферон, продуковатілі нервових клітин, так і у аксонах (Ішікава ний одним видом, буде стимулювати антивір усну (Ichikawa) та інші, 2000). активність лише у клітинах того саме або тісносЯк показано результатами гібридизації in situ, порідненого виду. Інтер ферони були першою грумРНК остеопонтину експресується у головному пою цитокінів, які почали використовува ти завдяки мозку дорослої особи. Експресію було виявлено у їх протипухлинній та антивірусній активності. нейронах нюхової цибулини та стовбура головного Три головні інтерферони позначають як IFN-a, мозку, причому експресія у нейронах стовбура IFN-b та IFN-g. Такі головні види інтерферонів були головного мозку була виявлена на функціонально початково класифіковані відповідно до їхніх клітин різних ділянках, у тому числі на ділянках, пов'язапоходження (лейкоцит, фібробласт або Т-клітина). них з руховими нервами, у сенсорній системі та у Однак стало зрозумілим, що однією клітиною моретикулярній формації (Шін (Shin) та інші, 1999). жуть продукуватись інтерферони декількох типів. Під час проведення іншого дослідження виТаким чином, лейкоцитарний інтерферон зараз вчали просторову та часову експресію мРНК осназивають IFN-a, фібробластний інтерферон є теопонтину після перебіжної ішемії переднього IFN-b та Т-клітинний інтерферон є IFN-g. Існує тамозку у пацюків. Перебіжна індукція мРНК OPN кож інтерферон четвертого типу, лімфобластоїдпісля глобальної ішемії відбувалась раніше у смуний інтерферон, що продукується лінією клітин гастому тілі, аніж у гіпокампі. Перед тим як клітини "Namalwa" (яка була одержана з лімфоми Бьоркімікроглії стали більш реактивними, індукція була та), і яка, як видається, продукує суміш як лейкоявно вираженою у дорсомедіальному смугастому цитарного, так і фібробластного інтерферонів. тілі поблизу від бічного шлуночка, у субзоні СА1 та Інтерферонова одиниця є критерієм активності у опорній структурі гіпокампа. Індукція могла також інтерферону, яка визначається (дещо необгрунтовиявлятись у зубчастих воротах та, на зникаюче вано), як кількість, необхідна для захисту 50% клімалому рівні, у субзоні СА3 (Лі М.І. (Lee M.Y.), Шін тин проти пошкодження вірусом. С.Л. (Shin S.L.), Чоу І.С. (Choi Y.S.), Кім Е.Дж. (Kim Кожен клас інтерферонів включає декілька ріE.J.), Ча Дж.Х. (Cha J.H.), Чан М.Х. (Chun М.Н.), Лі зних типів. Кожен з IFN-b та IFN-g є продуктом одСБ. (Lee S.B.), Кім С.I. (Кіm S.Y.), Neurosci Lett, ного гена. Різниці між окремими типами головним 1999, Aug 20 271:2 81-4). чином обумовлюються, як видається, варіаціями Остеопонтин називають також Eta-1. У [WO процесу глікозилування. 00/63241] розкривають способи модулювання імуІнтерферони альфа є найбільш різноманітною нних реакцій, зокрема, способи модулювання імугрупою, що включає приблизно 15 типів. На хронних реакцій типу 1 із застосуванням модуляторів мосомі 9 існує кластер генів IFN-a, що включає Eta-1 (активація ранніх Т-лімфоцитівщонайменш 23 члени, 15 з яких є активними і 1)/остеопонтину. Повідомляють, що модулятори транскрибуються. Зрілі інтерферони альфа не остеопонтину є придатними для лікування інфекглікозилуються. цій, імунних розладів та захворювань, автоімунних IFN-a та IFN-b мають однакову довжину (165 розладів, у тому числі розсіяного склерозу, різних або 166 амінокислот) і однакову біологічну активімунодефіцитів та раку. Усі модулятори остеопонність. Інтерферони гамма мають у довжину 146 тину, розкриті у [WO 00/63241], які розглядаються амінокислот і не так близько нагадують класи a та як придатні при автоімунних захворюваннях, у тоb. Лише IFN-g можуть активувати макрофаги або му числі розсіяному склерозі, є інгібіторами остеоіндукувати визрівання Т-клітин-кілерів. Фактично ці понтину/Eta-1, як докладно пояснюється у [розділі терапевтичні агенти нових типів можуть називаV "Clinical Applications of the Modulatory Methods of тись модифікаторами біологічної реакції (BRMs), the Invention", D "Autoimmune Diseases" на сторіноскільки вони мають ефект на реакцію організму ках 51-53 WO 00/63241]. на пухлину і впливають на розпізнавання через Інтерферони є субкласом цитокінів, що демонімуномодуляцію. струють протизапальну, антивірусн у та антипроЗокрема, людський фібробластний інтерферон ліферативну активність. На основі біохімічних та (IFN-b) має антивірусну активність і може також імунологічних властивостей, природні людські інстимулювати природні клітини-кілери проти неоптерферони об'єднуються у три класи: інтерферон ластичних клітин. Він являє собою поліпептид маальфа (лейкоцит), інтерферон бета (фібробласт) сою приблизно 20000Да, що індукується вірусами та інтерферон гамма (імунний). Альфа-інтерферон та двонитковими РНК. З нуклеотидної послідовнозараз схвалено у Сполучених Штатах та інших сті гена фібробластного інтерферону, клонованого країнах для лікування волосатоклітинного лейкозу, методом рекомбінантних ДНК, Деринк та інші (Дегострокінцевих кондилом, саркоми Капоші (рак, ринк P. (Derynk R.) та інші, 1980) вивели повну який звичайно уражує пацієнтів, що страждають на амінокислотну послідовність цього білка. Він скласиндром набутого імунодефіциту людини (СНІД)) дається у довжину із 166 амінокислот. та хронічного ні-А, ні-В гепатиту. Шепард та інші (ШепардХ.М. (Shepard H.M.) та Далі, інтерферони (IFNs) є глікопротеїнами, інші, 1981) описав мутацію на основі 842 (Cys®Tуr що продукуються організмом у відповідь на вірусу положенні 141), яка знищує його антивірусну ну інфекцію. Вони пригнічують розмноження віруактивність, та варіантний клон із делецією нуклеосів у захи щених клітинах. Інтер ферони складаютьтидів 1119-1121. ся з низькомолекулярного білка і є надзвичайно неспецифічними за своєю дією, наприклад, інтер 29 85368 30 Марк та інші (Марк Д.Ф. (Mark D.F.) та інші, моделі розсіяного склерозу та периферичних не1984) вставив штучн у мутацію шляхом заміни освропатій. нови 469 (Т) на (А), унаслідок чого відбулась заміТаким чином, цей винахід має відношення до застосування остеопонтину або агоніста активносна амінокислоти Cys®Ser у положенні 17. Повідті остеопонтину при неврологічному захворюванні, омлялось, що IFN-b, який одержали, мав таку саме наприклад, травматичному пошкодженні нервів, активність, що і "нативний" IFN-b і залишався стаінсульті, демієлінізуючих захворюваннях центрабільним впродовж довгострокового зберігання (льної нервової системи або периферичної нерво70°С). Ò вої системи, невропатіях та нейродегенеративних Rebif (рекомбінантний людський інтерферон захворюваннях. бета) являє собою останню розробку у інтерфеЗа цим винаходом остеопонтин може також ронній терапії розсіяного склерозу і є значним дозастосовуватись у поєднанні з інтерфероном для сягненням у лікуванні. RebifÒ являє собою інтерлікування та/або запобігання неврологічних захвоферон (ІFN)-бета 1а, який продукується лініями рювань. У межах обсягу цього винаходу знахоклітин ссавців і є фактично ідентичним до природдиться також застосування нуклеїновокислотних ної людської молекули. молекул, векторів експресії, що включають остеоМе ханізми, за посередництвом яких інтерфепонтин, та клітин, що експресують остеопонтин, рони здійснюють свої ефекти, є не повністю зродля лікування та/або запобігання неврологічного зумілими. Однак у більшості випадків їхня дія позахворювання. Цей винахід додатково надає фарлягає у впливі на індукцію або транскрипцію мацевтичні композиції, що включають остеопонтин певних генів, і, таким чином, у впливі на імунну та інтерферон, факультативно разом з одним або систему. Дослідження in vitro показали, що інтердекількома фармацевтично прийнятними наповферони є здатними до індукування або супресії нювачами. приблизно 20 генних продуктів. На Фіг.1А показана гістограма, що відображає IFN-b може діяти у разі розсіяного склерозу рівні експресії остеопонтину (за результатами трьома головними шляхами: аналізу TaqManÒ ) після періодів обробки купризо- регуляція Т-клітинних функцій, наприклад, ном різної тривалості. 3/5т.куп.=три або п'ять тижактивації, проліферації та функціонування супренів обробки купризоном, 5т.куп.+1/3/6т.=п'ять тижсорних клітин; нів обробки купризоном і, після припинення - модуляція продукування цитокінів: супресія обробки купризоном, один/три або шість тижнів передзапальних цитокінів та активація пригнічувавідновлення. льних, протизапальних цитокінів; На Фіг.1В показане регулювання конформації - регуляція міграції та інфільтрації Т-клітин до мРНК остеопонтину, МВР та PLP, порівняно з концентральної нервової системи через гематоенцетрольними рівнями С1, за визначенням TaqManÒ , фалічний бар'єр (ВВВ). на різних стадіях розвитку мозочка. С1Дослідженням PRISMS була встановлена 20=постнатальний мозочок на день 1-20, ефективність інтерферону бета-1а, який вводили СА=мозочок дорослої особи. підшкірно тричі на тиждень при лікуванні рецидивНа Фіг.2 схематично показана структура осно-ремітуючого розсіяного склерозу (RR-MS). Ретеопонтину та його відомих ізоформ, а також С- та зультати цього дослідження показали, що інтерN-кінцевих генно-інженерних конструкцій. ферон бета-1а може мати позитивний ефект на На Фіг.3 схематично показана плазміда Рас, довгостроковий перебіг розсіяного склерозу шлящо містить кодувальну послідовність остеопонтихом зменшення кількості та послаблення тяжкості ну. рецидивів та зменшення важкості хвороби та її На Фіг.4 показана гістограма, яка ілюструє акактивності за результатами визначення засобами тивацію конформації мРНК остеопонтину у лінії ЯМР-томографії. (Randomised, Double-Blind, олігодендроцитарних клітин oli-neu, що обробляPlacebo-Controlled Study of Interferon beta-la in лись цАМФ впродовж 6год (1), 2 днів (2), 6 днів (3) Relapsing-remitting Multiple Sclerosis", The Lancet або 10 днів (4), у порівнянні з контролем. Стовпчи1998; 352 (7 november, 1998); 1498-1504). ки 5 та 6 відображають рівні мРНК остеопонтину з Цитування будь-якого документа у цьому описі експерименту з купризоном. (5): 3 тижні обробки не повинно розглядатись як визнання того, що купризоном, (6): 5 тижнів обробки купризоном. такий документ має відношення до попереднього На Фіг.5 схематично показана плазміда pDEST рівня техніки або розглянутий матеріал до патен12.2, що містить кодувальну послідовність остеотоздатності будь-якого пункту формули цієї заявки. понтину. Будь-яке твердження щодо вмісту або дати будьНа Фіг.6 схематично показана плазміда pDEST якого документа грунтується на інформації, досту12.2, що містить кодувальну послідовність остеопній заявникам на момент подання цієї заявки, і не понтину плюс кодувальну послідовність EGFP, є визнанням правильності такого твердження. флуоресцентного маркера. Метою цього винаходу є надання нових засоНа Фіг.7 схематично показана плазміда pDEST бів для лікування та/або запобігання неврологічно12.2, що містить кодувальну послідовність остеого захворювання. понтину з HIS-міткою. Цей винахід грунтується на встановленні того На Фіг.8 показана проліферація клітин лінії oliфакту, що білок остеопонтин стимулює проліфеneu після вирощування на мінімальному безінсулірацію та диференціацію гліальних клітин і тим сановому живильному середовищі та 24год обробки мим стимулює мієлінізацію та регенерацію нервів. остеопонтином, експресованим у бакуловірусі За цим винаходом додатково було встановлено, (Baculo-OPN) або остеопонтином, експресованим що остеопонтин має позитивний ефект на тваринні 31 85368 32 клітинами НЕK (культура клітин нирки людського позитивної контрольної сполуки (4-МС, 4ембріона) (HEK-OPN). Зчитується флуоресценція метилкатехол) або 100мкг/кг денатурованого осAlamar Blue, фарбника для забарвлювання живих теопонтину (Ost-D). клітин. На Фіг.18 показана амплітуда м'язового потенНа Фіг.9 показана дозозалежна крива проліціалу дії сполуки у невропатичних мишей, які підферації клітин лінії oli-neu після вирощування на давались обробці носієм, 1мкг/кг, 10мкг/кг або мінімальному безінсуліновому живильному сере100мкг/кг остеопонтину (Ost), 10мкг/кг позитивної довищі та 24год обробки остеопонтином, експреконтрольної сполуки (4-МС) або 100мкг/кг денатусованим бакуловірусом (BAC-OPN) або остеопонрованого остеопонтину (Ost-D). тином, експресованим клітинами НЕK (HEK-OPN). На Фіг.19 показана латентність м'язового поНа Фіг.10 показана проліферація клітин лінії тенціалу дії сполуки у невропатичних мишей, які oli-neu після вирощування на мінімальному безінпіддавались обробці носієм, 1мкг/кг, 10мкг/кг або суліновому живильному середовищі та обробки 100мкг/кг остеопонтину (Ost), 10мкг/кг позитивної непроцесованим остеопонтином, експресованим контрольної сполуки (4-МС) або 100мкг/кг денатубакуловірусом (BacOPN) або N-кінцевим фрагменрованого остеопонтину (Ost-D). том остеопонтину (N-кінцевий BacOPN). На Фіг.20 показана тривалість м'язового потеНа Фіг.11 показана імуногістохімія МВР (оснонціалу дії сполуки у невропатичних мишей, які підвний мієліновий білок) у змішаних кортикальних давались обробці носієм, 1мкг/кг, 10мкг/кг або культурах, що піддавались обробці 100нМ експре100мкг/кг остеопонтину (Ost), 10мкг/кг позитивної сованого бакуловірусом рекомбінантного остеопоконтрольної сполуки (4-МС) або 100мкг/кг денатунтину. контроль = А ; оброблені = В OPN; рованого остеопонтину (Ost-D). С=збільшення В ; D=інше поле змішаних кортикаНа Фіг.21 показано відсоток дегенерованих льних клітин, оброблених OPN, де не видно аксоволокон у невропатичних мишей, які піддавались нів. обробці носієм, 1мкг/кг, 10мкг/кг або 100мкг/кг осНа Фіг.12 показане збільшення об'єму МВР у теопонтину (Ost), 10мкг/кг позитивної контрольної процесі мієлінізації змішаних кортикальних культур сполуки (4-МС) або 100мкг/кг денатурованого оспісля обробки LIF (фактор індукування лімфоцитів) теопонтину (Ost-D). та остеопонтином, експресованим бакуловірусом, На Фіг.22 показана загальна кількість волокон за результатами визначення за допомогою ELISA на поле у невропатичних мишей, які піддавались (твердофазний імуноферментний аналіз). обробці носієм, 1мкг/кг, 10мкг/кг або 100мкг/кг осНа Фіг.13 показана проліферація клітин CG4 теопонтину (Ost), 10мкг/кг позитивної контрольної після обробки різними дозами (10пМ, 10нМ, сполуки (4-МС) або 100мкг/кг денатурованого ос100нМ) фосфорилованого in vitro, експресованого теопонтину (Ost-D). E.coli остеопонтину (OPN-E-coli) або остеопонтину, Цей винахід грунтується на встановленні того експресованого бакуловірусом (OPN Вас). факту, що остеопонтин по-різному експресується На Фіг.14 показані периваскулярні запальні під час диференціації олігодендроцитів та під час інфільтрати, присутні у спинних мозках ЕАЕ мирозвитку мозочка. Додатково було встановлено, шей, яким підшкірно вводили носій (забуферений що експресія кДНК остеопонтину у олігодендроцифосфа том фізіологічний розчин), носій плюс 0,1% тів веде до диференційованого фенотипу цих клісироваткового альбуміну великої рогатої худоби, тин in vitro. У разі експресії остеопонтину олігоде1мкг/кг, 10мкг/кг або 100мкг/кг AS900011 (остеопондроцити демонструють фенотип, подібний до нтин) або комбінацію 100мкг/кг AS900011 та фенотипу мієлінізуючих клітин, що диференцію20000Од/мишу мишачого інтерферону бета (mIFNються. Окрім цих, встановлених in vitro фактів, було показано, що остеопонтин і, зокрема, комбіb) або 20000Од/мишу лише mIFN-b. нація остеопонтину та інтерферону, має позитивНа Фіг.15 показано відсоток демієлінізованої ний ефект у встановленій моделі розсіяного склеплощі у спинному мозку ЕАЕ мишей, яким підшкіррозу. У експериментальній моделі периферичної но вводили носій (забуферений фосфатом фізіологічний розчин), носій плюс 0,1% сироваткового невропатії, остеопонтин мав явно виражений позитивний ефект на активність нервів і значно змеальбуміну великої рогатої худоби, 1мкг/кг, 10мкг/кг ншував відсоток дегенерації та стимулював обсяг або 100мкг/кг AS900011 (остеопонтин) або комбімієлінізації. націю 100мкг/кг AS900011 та 20000Од/мишу миЕкспериментальні дані, наведені у цьому опишачого інтерферону бета (mIFN-b) або сі, надають, таким чином, нову можливість ліку20000Од/мишу лише mIFN-b. вання неврологічних захворювань, зокрема, заНа Фіг.16 показано клінічні оцінки у балах на хворювань, пов'язаних із функціонуванням кінці обробки запальної інфільтрації та демієлінінервових та гліальних клітин. Ці дані викликають зації у ЕАЕ мишей, яким підшкірно вводили носій особливий подив, оскільки у [WO 00/63241] вказу(забуферений фосфатом фізіологічний розчин), ється на необхідність інгібування остеопонтину з носій плюс 0,1% сироваткового альбуміну великої метою лікування розсіяного склерозу. рогатої худоби, 1мкг/кг, 10мкг/кг або 100мкг/кг Цей винахід, таким чином, пов'язується з заAS900011 (остеопонтин) або комбінацію 100мкг/кг стосування остеопонтину або агоніста активності AS900011 та 20000Од/мишу мишачого інтерфероостеопонтину для виготовлення лікарського засону бета (mIFN-b) або 20000Од/мишу лише mIFN-b. бу для лікування та/або запобігання неврологічних На Фіг.17 показана маса тіла мишей із неврозахворювань. патією, індукованою роздробленням сідничного Термін "остеопонтин", який використовується у нерва, які піддавались обробці носієм, 1мкг/кг, цьому описі, означає непроцесований людський 10мкг/кг або 100мкг/кг остеопонтину (Ost), 10мкг/кг 33 85368 34 остеопонтин, який має амінокислотну послідовчас як N-кінцева частина остеопонтину, як гаданість, відому з кінця вісімдесятих років (Олдберг ють, залучається до взаємодії з рецепторами інте(Oldberg) та інші, 1986; Кіфер (Kiefer) та інші, грину, проліферації, виживаності та диференціації 1989). Послідовність людського остеопонтину намакрофагів. N-кінцева частина остеопонтину також водиться у цьому описі як Послідовність №1 у лісіндукує виділення IL (інтерлейкіну)-12 та IL-10. тингу послідовностей, що додається. Термін "осБудь-який агоніст, стимулятор або енхансер будьтеопонтин", який використовується у цьому описі, якого з цих рецепторів охоплюється терміном додатково означає будь-який остеопонтин, одер"агоніст активності остеопонтину", який використожаний від тварин, наприклад, остеопонтин мишавується у цьому описі. чий, великої рогатої худоби або пацючий, доти, Термін "агоніст активності остеопонтину", який доки існує достатній ступінь ідентичності для підвикористовується у цьому описі, додатково ознатримання активності остеопонтину та доти, доки чає агенти, що стимулюють активність, опосередодержана молекула не буде імуногенною для люковану остеопонтином, наприклад, стимулювання дей. прикріплення клітин до складових екстрацелюлярТермін "остеопонтин", який використовується у ного матриксу, морфогенез клітин олігодендроцицьому описі, додатково означає біологічно активні тарного напрямку диференціації на мієлінпродумутеїни та фрагменти, наприклад, природні ізофокуючі клітини, стимулювання рекрутмента, рми остеопонтину. Остеопонтин експресується у проліферацію, диференціацію або визрівання кліфункціонально різних формах, які різняться на тин олігодендроцитарного напрямку диференціації рівні транскрипції (альтернативний сплайсинг) та (наприклад, клітин-попередників), стимулювання посттрансляційних модифікацій (фосфорилування, захисту клітин олігодендроцитарного напрямку глікозилування). Поки що відомо три розщеплені диференціації від апоптозу та пошкодження. варіанти остеопонтину, які позначаються як OPN-a Терміни "лікування" та "запобігання", які вико(який у цьому описі називають також "непроцесористовуються у цьому описі, слід розуміти як запованим" остеопонтином), OPN-b та OPN-c (Послібігання, пригнічення, послаблення, поліпшення довності №1, №2 та №3 лістингу послідовностей, або реверсування одного або декількох симптомів що додається, а також зображені на Фіг.2). Ізофоабо причини (причин) неврологічного захворюванрми були описані, наприклад, Кон (Kоn) та іншими ня, а також симптомів, захворювань або усклад(2000); характеристики ізоформ були визначені, нень, що супроводжують неврологічне захворюнаприклад, Сайто (Saitoh) та іншими (1995) та Кон вання. У разі "лікування" неврологічного (Kоn) та іншими (2002). захворювання, речовини за цим винаходом ввоРозщеплення тромбіну дає два фрагменти, що дяться після початку захворювання, "запобігання" піддаються протеолітичному розщепленню in vivo і означає введення речовин до того, як у пацієнта включають N- та С-кінцеві ділянки білка. Фосфобудуть помічені ознаки захворювання. рилування остеопонтину, зокрема, С-кінцевої часТермін "неврологічні захворювання", який витини білків, може бути важливим для функціонукористовується у цьому описі, охоплює усі відомі вання остеопонтину. Термін "остеопонтин", який неврологічні захворювання, розлади або пошковикористовується у цьому описі, означає, таким дження центральної нервової системи або перичином, також ці протеолітичні фрагменти та дифеферичної нервової системи, із включенням тих ренційовано фосфориловані форми остеопонтину. захворювань, докладний опис яких наведено у Термін "остеопонтин", який використовується у розділі "Передумови створення винаходу". цьому описі, додатково означає ізоформи, мутеїНеврологічні захворювання включають розлани, гібридні білки, функціональні похідні, активні ди, пов'язані з порушенням функціонування фракції або фрагменти, кільцево пермутовані поцентральної нервової системи або периферичної хідні або їхні солі. Ці ізоформи, мутеїни, гібридні нервової системи, наприклад, захворювання, побілки або функціональні похідні, активні фракції в'язані з передачею нервових імпульсів, головним або фрагменти, кільцево пермутовані похідні збеболем, черепно-мозковими травмами, інфекціями рігають біологічну активність остеопонтину. За центральної нервової системи, розладами нейроваріантом, якому віддається перевага, вони мають офтальмологічних та черепних нервів, функціонубіологічну активність, яка є поліпшеною, порівняно ванням та розладом функцій часток головного до остеопонтину дикого типу. мозку, розладами руху, ступором та комою, демієТермін "агоніст активності остеопонтину", який лінізуючими захворюваннями, делірієм та слабовикористовується у цьому описі, означає молекуумством, аномаліями краніоцервікального стику, лу, яка стимулює або імітує активність остеопонепілептичними нападами, розладами спинного тину, наприклад, агоністичні антитіла рецептора мозку, розладами сну, розладами периферичної остеопонтину або низькомолекулярні агоністи, що нервової системи, цереброваскулярними захвоактивізують передачу сигналу через рецептор осрюваннями або розладами функціонування м'язів. теопонтину. Остеопонтин опосередковує свою Визначення цих розладів дивись, наприклад, на функцію через щонайменш дві групи рецепторів. http:/www.merck.com/pubs/mmanual/section14/sec14 .htm. По-перше, він взаємодіє з an-інтегринами (рецепЗа варіантом, якому віддається перевага, неторами інтегринів anb3 та anb5) через мотив приврологічні захворювання за цим винаходом вибикріплення клітин RGD (Arg-Gly-Asp) під позитивним рають з групи, що включає травматичне пошковпливом марганцю (Куніцкі (Kunicki) та інші, 1997). дження нервів, інсульт, демієлінізуючі По-друге, він взаємодіє з варіантними ізоформами захворювання центральної нервової системи або CD44 v6-vlO. С-кінцева частина остеопонтину, як гадають, залучається до взаємодії з CD44, у той 35 85368 36 периферичної нервової системи та нейродегенетруднощами у ході, рухливості та координації руративні захворювання. хів. Ця хвороба пов'язується з пошкодженням часТравматичне пошкодження нервів може мати тини головного мозку, яка контролює рухливість відношення до периферичної нервової системи м'язів, і її називають також тремтючим паралічем або центральної нервової системи, це може бути (paralysis agitans). черепно-мозкова травма або травма спинного моХорея Гентингтона являє собою спадкову авзку, у тому числі, параплегія, як описано у наведетосомну неврологічну хворобу домінантного типу. ному вище розділі "Передумови створення винаБічний аміотрофічний склероз (ALS) являє соходу". бою розлад, що викликає прогресивну втрату нерІнсульт може спричинюватись гіпоксією або вового контролю за довільно скоротними м'язами ішемією головного мозку. Його називають також із причини знищення нервових клітин у головному цереброваскулярним захворюванням або апоплета спинному мозку. Бічний аміотрофічний склероз, ксичним ударом. Інсульт може викликати втрату який називають також хворобою Шарко, являє мозкових функцій (неврологічний розлад), що собою розлад, що викликає втрату застосування спричинюється припиненням кровопостачання до та контролю м'язів. ділянок головного мозку. Причиною припинення Розсіяний склероз (MS) являє собою запальне кровопостачання можуть бути згустки крові, що демієлінізуюче захворювання центральної нервоутворюються у головному мозку (тромби) або часвої системи (ЦНС), яке набуває рецидивнотинки атеросклеротичних бляшок або іншого маремітуючого або прогресуючого перебігу. Розсіятеріалу, які дістаються до головного мозку з іншого ний склероз є не тільки демієлінізуючим захворюмісця (емболи). Кровотеча (крововилив) у межах ванням. Двійником цього захворювання у перифеголовного мозку може викликати симптоми, які ричній нервовій системі є хронічна запальна нагадують інсульт. Найзагальнішим різновидом демієлінізуюча полірадикулоневропатія (CIDP). інсульту є інсульт унаслідок атеросклерозу (цереКрім того, існують гострі монофазні розлади, набральний тромбоз) і, таким чином, цей винахід приклад, запальна демієлінізуюча полірадикулотакож має відношення до лікування атеросклероневропатія, яку називають синдромом Гійєназу. Барре (GBS) у периферичній нервовій системі та Периферична невропатія може пов'язуватись гострий дисемінований енцефаломієліт (ADEM) у із синдромом втрати чутливості, слабкості та атцентральній нервовій системі. рофії м'язів, ослаблення глибоких сухожильних Додаткові неврологічні розлади включають рефлексів та вазомоторних симптомів, самостійно невропатії з аномальною мієлінізацією, наприклад, або у будь-якій комбінації. Невропатія може ураневропатії, перелік яких наведено у наведеному жати один нерв (мононевропатія), два або більше вище розділі "Передумови створення винаходу", а нервів на різних ділянках (множинна мононевротакож синдром каналу зап'ястя. Травматичне попатія) або багато нервів одночасно (поліневропашкодження нервів може супроводжуватись ортотія). Першочергово може уражатись аксон (наприпедичними ускладненнями спинного мозку, які клад, при цукровому діабеті, хворобі Ліма, уремії також входять до числа захворювань за цим винаабо токсичними агентами), мієлінова оболонка або ходом. шванівські клітини (наприклад, у разі гострої або Неврологічні розлади можуть додатково вихронічної запальної поліневропатії, лейкодистрокликатись вродженими розладами обміну речовин. фії або при синдромі Гійєна-Барре). Додаткові неЗа варіантом втілення цього винаходу, якому відвропатії, які можуть лікуватись за цим винаходом, дається перевага, неврологічне захворювання, можуть виникати, наприклад, унаслідок отруєння таким чином, спричинюється вродженим розладом свинцем, застосування дапсону, укусів кліщів, при обміну речовин. порфірії або синдромі Гійєна-Барре, і вони можуть Вродженими захворюваннями обміну речовин, уражати, головним чином, рухові нервові волокна. що входять до обсягу цього винаходу, можуть буІнші невропатії, наприклад, при раковому гангліоти, наприклад, фенілкетонурія та інші аміноацидуніті заднього корінця спинного мозку, проказі, синрії; хвороба Тея-Сакса (рання дитяча амавротична дромі набутого імунодефіциту (СНІД), цукровому ідіотія), хвороба Німанна-Піка (ліпощний гістіоцидіабеті або хронічній інтоксикації піридоксином, тоз) та хвороба Гоше (спадковий глюкоцереброзиможуть уражати, головним чином, ганглії заднього доз), синдром Гурлера (мукополісахаридоз І типу); корінця спинного мозку або сенсорні нервові волохвороба Краббе (глобоїдно-клітинна лейкодисткна з виникненням сенсорних симптомів. Можуть рофія Краббе) та інші лейкодистрофії. Вони моуражатись також черепні нерви, наприклад, при жуть уражати мієлінову оболонку, що розвиваєтьсиндромі Гійєна-Барре, хворобі Ліма, цукровому ся, головним чином, у центральній нервовій діабеті та дифтерії. системі. Хвороба Альцгеймера являє собою розлад, Неврологічні захворювання, які спричинюютьякий викликає погіршення розумових функцій, що є ся вродженими розладами обміну речовин, також наслідком змін тканин головного мозку. Сюди входокладно обговорювались у розділі "Передумови дить зморщування тканин головного мозку, перстворення винаходу". винне дегенеративне слабоумство та дифузна Менш відомі неврологічні захворювання також атрофія головного мозку. Хворобу Альцгеймера входять до обсягу цього винаходу, наприклад, називають також старечим слабоумством альцнейрофіброматоз або множинна системна атрофія геймерівського типу (SDAT). (MSA). Додаткові розлади, що можуть лікуватись Хвороба Паркінсона являє собою хворобу гоза цим винаходом, докладно описувались у навеловного мозку, що характеризується тремтінням та 37 85368 38 деному вище розділі "Передумови створення виється з комплементом нативної послідовності ДНК, находу". що кодує будь-який із поліпептидів (a)-(f) за помірЗа додатковим варіантом втілення, якому відно жорстких або за дуже жорстких умов; дається перевага, неврологічним захворюванням є (і) Мутеїн будь-якого поліпептиду з (а) до (f), периферична невропатія, за варіантом, якому відде будь-які мутації амінокислотної послідовності є дається найбільша перевага, діабетична невропаконсервативними амінокислотними замшами амітія. Перевага за цим винаходом віддається також нокислотних послідовностей у поліпептидах (a)-(f); невропатіям, пов'язаним із хіміотерапією. (j) Сіль або ізоформу, гібридний білок, функціТермін "діабетична невропатія" означає будьональну похідну, активну фракцію або кільцево яку форму діабетичної невропатії або один (декіпермутовану похідну будь-якого з поліпептидів (a)лька) симптом(-ів) чи розлад(-ів), що супроводжу(f). ють або спричинюються діабетичною невропатією, Активні фракції або фрагменти можуть вклюабо ускладнення діабету, що уражають нерви, як чати будь-яку частин у або ділянку будь-якої ізодокладно описано у наведеному вище розділі "Пеформи остеопонтину, наприклад, N-кінцеву ділянредумови створення винаходу". Діабетична неку або С-кінцеву ділянку або будь-яку з-посеред вропатія може бути поліневропатією. У разі діабеOPN-a, -b або -с, як показано на Фіг.2. Мотив тичної поліневропатії одночасно уражаються GRGDS може бути присутнім, відсутнім або мутобагато нервів. Діабетична невропатія може також ваним. Місце зв'язування гепарину може бути мубути мононевропатією. У разі вогнищевої мононетованим, завдяки чому остеопонтин позбавляєтьвропатії, наприклад, захворювання уражає один ся здатності до зв'язування гепарину. нерв, наприклад, окоруховий або відвідний черепНепроцесований остеопонтин або будь-який актиний нерв. Це може також бути множинна мононеввний фрагмент остеопонтину може фосфорилуваропатія, коли на різних ділянках уражаються два тись на одному або декількох із нижченаведених або декілька нервів. серинових залишків, наприклад, серинових залишЗа ще іншим варіантом втілення, якому віддаках у таких положеннях: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, ється перевага, неврологічне захворювання є де62, 65, 83, 86, 89, 92, 101, 104, 107, 110, 113, 153, мієлінізуючим захворюванням. До числа демієліні155, 175, 179, 199, 203, 208, 212, 218, 223, 227, зуючих захворювань, за варіантом, якому 238, 242, 247, 251, 254, 259, 264, 275, 287, 292, віддається перевага, належать демієлінізуючі ста294, 295. На додаток до цього, місця фосфоритуни центральної нервової системи, наприклад, госвання серину можуть мутувати з серину на глутатрий дисемінований енцефаломієліт (ADEM) та матні залишки для імітації фосфорилування. розсіяний склероз, а також демієлінізуючі захвоФахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що нарювання периферичної нервової системи. До чисвіть невеликі частини остеопонтину можуть бути ла останніх належать такі захворювання, як хронідостатніми для здійснення його функцій, напрична запальна демієлінізуюча клад, активний пептид, що включає залишки незаполірадікулоневропатія (CIDP) та гості монофазні мінних амінокислот, необхідні для здійснення фунрозлади, наприклад, запальна демієлінізуюча покцій остеопонтину. лірадикулоневропатія, яку називають синдромом Фахівцям у цій галузі буде також зрозуміло, що Гійєна-Барре (GBS). мутеїни, солі, ізоформи, гібридні білки, функціонаДодатковий варіант втілення цього винаходу, льні похідні остеопонтину, активні фракції або кіякому віддається перевага, має відношення до льцево пермутовані похідні остеопонтину будуть лікування та/або запобігання нейродегенеративнозберігати подібну, або навіть кращу, біологічну го захворювання. Нейродегенеративне захворюактивність остеопонтину. Біологічна активність вання вибирають із групи, що включає хворобу остеопонтину та мутеїнів, ізоформ, гібридних білАльцгеймера, хворобу Паркінсона, хорею Гентингків або функціональних похідних, активних фракцій тона та бічний аміотрофічний склероз. або фрагментів, кільцево пермутованих похідних За варіантом, якому віддається перевага, осабо його солей може визначатись шляхом аналізу теопонтин вибирають з-посеред пептиду, поліпепметодом спільного культивування, наприклад, як тиду або білка, які вибирають із групи, що вклюописано далі у Прикладі 8. Змішані кортикальні чає: культури включають олігодендроцити, а також інші (a) Поліпептид, що містить Послідовність №1; клітини, що походять із центральної нервової сис(b) Поліпептид, що містить амінокислоти 1-168 теми (наприклад, нейрони, астроцити, мікроглія), і або 170 ПослідовностІ №1; індукують або активують типові гени, залучені до (c) Поліпептид, що містить амінокислоти 1-16 мієлінізації, наприклад, Р0, МВР або MAG, після та 170-314 Послідовності №1; інкубування з OPN або мутеїном, ізоформою, фра(d) Поліпептид, що містить амінокислоти 170гментом, активною фракцією, функціональною 314 Послідовності №1; похідною або сіллю. Експресія цих генів може ви(e) Поліпептид, що містить Послідовність №2; значатись кількісним аналізом RT-PCR (ревертаз(f) Поліпептид, що містить Послідовність №3; но-полімеразна ланцюгова реакція) (TaqManÒ RT(g) Мутеїн будь-якого поліпептиду з (а) до (f), PCR) у реальному масштабі часу, що докладно де амінокислотна послідовність має щонайменш пояснюється у наведених нижче прикладах. Дода40% або 50%, або 60%, або 70%, або 80%, або тковим простим аналізом для визначення активно90% ідентичність із щонайменш однією з послідості остеопонтину є аналіз проліферації олігодендвностей поліпептиду (a)-(f); роцитів, що включає інкубування відповідної лінії (h) Мутеїн будь-якого поліпептиду з (а) до (f), олігодендроцитарних клітин, наприклад, клітин який кодується послідовністю ДНК, що гібридизулінії oli-neu або CG4, з остеопонтином або мутеї 39 85368 40 ном, ізоформою, фрагментом, активною фракцією, 20°С нижче розрахованої Тm (температура плавфункціональною похідною або сіллю, як описано, лення ДНК) експериментального гібрида, напринаприклад, у наведеному нижче Прикладі 7. клад, 2´SSC (стандартний цитратний фізіологічАктивні фракції, яким віддається перевага, ний розчин) та 0,5% SDS (додецилсульфат натрію) мають активність, яка дорівнює або є кращою за впродовж 5хв, 2´SSC та 0,1% SDS впродовж 15хв; активність непроцесованого остеопонтину, або які 0,1´SSC та 0,5% SDS при температурі 37°С впромають додаткові переваги, наприклад, крашу стадовж 30-60хв, після чого 0,1´SSC та 0,5% SDS при більність або слабкішу токсичність чи імуногентемпературі 68°С впродовж 30-60хв. Пересічному ність, або їх легше одержати у більших кількостях фа хівцю у цій галузі зрозуміло, що жорсткість умов чи легше очищати. Досвідченим у цій галузі фахівзалежить також від довжини послідовностей ДНК, цям буде зрозуміло, що мутеїни, активні фрагменолігонуклеотидних зондів (наприклад, 10-40 основ) ти та функціональні похідні можна одержати шляабо змішаних олігонуклеотидних зондів. У разі хом клонування відповідних кДНК у відповідних використання змішаних зондів, перевага віддаєтьплазмідах і перевірки їх аналізом за методом спіся застосуванню тетраметиламонію хлориду льного культивування, як згадувалось вище. (ТМАС) замість SSC. Дивись Осубел (Ausubel) Білки за цим винаходом можуть бути глікозивище. лованими або неглікозилованими, вони можуть За варіантом втілення, якому віддається перебути одержаними із природних джерел, напривага, будь-який з таких мутеїнів має 40% ідентичклад, рідин у тілі людини, або вони можуть бути, за ність або гомологію з Послідовністю №1, Послідоваріантом, якому віддається перевага, продуковані вністю №2 або Послідовністю №3 лістингу рекомбінантними методами. Рекомбінантну експослідовностей, що додається. За варіантом, якопресію можна здійснювати у прокаріотичних сисму віддається більша перевага, він має щонайтемах експресії, наприклад, Е.coli, або у еукаріотименш 50%, щонайменш 60%, щонайменш 70%, чних, наприклад, клітинах комах, та за варіантом, щонайменш 80% або за варіантом, якому віддаякому віддається перевага, у системах експресії ється найбільша перевага, щонайменш 90% іденссавців, наприклад, клітинах СНО (культура клітин тичність або гомологію з нею. яєчника китайського хом'ячка) або клітинах HEK Ідентичність відбиває взаємозв'язок між двома (культура клітин нирки людського ембріона). або декількома поліпептидними послідовностями Термін "мутеїни", який використовується у або двома чи декількома полінуклеотидними поцьому описі, означає аналоги остеопонтину, у яких слідовностями, визначений шляхом порівняння один або декілька амінокислотних залишків припослідовностей. Взагалі, ідентичність означає точродного остеопонтину замінені іншими амінокисну відповідність між нуклеотидами або амінокислотними залишками або піддані делеції, або один лотами двох полінуклеотидних або двох поліпепчи декілька амінокислотних залишків додані до тидних послідовностей, відповідно, за довжиною природної послідовності остеопонтину, без значної послідовностей, які порівнюються. зміни активності одержаних продуктів, порівняно з У разі послідовностей, що не мають точної остеопонтином дикого типу. Ці мутеїни одержують відповідності, може бути визначений "процент ідевідомими методами синтезу та/або методами нтичності". Взагалі, дві послідовності до порівнянсайт-спрямованого мутагенезу, або іншими відоня впорядковано розміщаються для забезпечення мими придатними для цього методами. максимальної кореляції між послідовностями. Це Мутеїни остеопонтину, які можуть використоможе включати введення "проривів" до будь-якої вуватись за цим винаходом, або нуклеїнові кислоабо обох послідовностей для підвищення ступеню ти, які їх кодують, включають кінцевий набір по суті впорядкованого розміщення. Процент ідентичності відповідних послідовностей у вигляді пептидів або може визначатись вздовж усієї довжини кожної з полінуклеотидів заміщення, які можуть бути просто послідовностей, що порівнюються (так зване глоодержані пересічним фахівцем у цій галузі без бальне впорядковане розміщення), що є особливо зайвого експериментування, скориставшись цим прийнятним для послідовностей однакової або описом та представленими у ньому роз'ясненнядуже подібної довжини, або вздовж коротшої, вими. значеної довжини (так зване локальне впорядкоМутеїни за цим винаходом включають білки, ване розміщення), що є більш прийнятним для які кодуються нуклеїновою кислотою, наприклад, послідовностей різної довжини. ДНК або РНК, що гібридизується з ДНК або РНК, Методи порівняння ідентичності та гомології яка кодує остеопонтин за цим винаходом за помідвох або декількох послідовностей є добре відомі рно або дуже жорстких умов. Термін "жорсткі умоу цій галузі. Так, наприклад, програми, доступні у ви" означає умови гібридизації та подальшого пакеті програм Wisconsin Sequence Analysis промивання, на які пересічні фахівці у цій галузі Package, версія 9.1 (Деверо Дж. (Devereux J.) та звичайно посилаються, як на "жорсткі". [Дивись інші, 1984), наприклад, програми BESTFIT та GAP, Осубел (Ausubel) та інші, Current Protocols in можуть використовуватись для визначення процеMolecular Biology, supra. Interscience, N.Y., §6.3 та нта ідентичності між двома полінуклеотидами і §6.4 (1987, 1992) та Сембрук (Sambrook) та інші процента ідентичності та процента гомології між (Сембрук Дж.К. (Sambrook J.C.), Фрітш Е.Ф. (Fritsch двома поліпептидними послідовностями. ПрограE.F.) та Маніатіс Т. (Maniatis T.) (1989) Molecular ма BESTFIT використовує алгоритм "локальної Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor гомології" Сміта (Smith) та Уотермана (Waterman) Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)]. (1981) і знаходить одну найкращу ділянку подібноБез обмежень, приклади жорстких умов вклюсті між двома послідовностями. У цій галузі відомі чають умови промивання при температурі на 12також інші програми для визначення ідентичності 41 85368 42 та/або подібності між послідовностями, наприклад, них послідовностях без зміни їхньої функції, зоксімейство програм BLAST (Альтшуль С.Ф. (Altschul рема, якщо інсерції або делеції залучають лише S.F.) та інші, 1990, Альтшуль С.Ф. (Altschul S.F.) та декілька амінокислот, наприклад, менше тридцяти, інші, 1997, доступні на сайті NCBI за адресою а за варіантом, якому віддається перевага, менше www.ncbi.nlm.nih.gov) та FASTA (Пірсон В.Р. десяти, і не видаляють або заміщують амінокис(Pearson W.R.), 1990; Пірсон (Pearson), 1988). лот, які є критичними для функціональної конфорЗмінами, яким віддається перевага, для мутеїмації, наприклад, цистеїнові залишки. Білки та нів за цим винаходом є такі, що відомі як "консермутеїни, продуковані такими делеціями та/або вативні" заміни. Консервативні амінокислотні заміінерціями, входять до обсягу цього винаходу. ни поліпептидів остеопонтину можуть включати За варіантом, якому віддається перевага, грусинонімічні амінокислоти у межах групи, яка має пами синонімічних амінокислот є групи, визначені достатньо подібні фізико-хімічні властивості для у Таблиці І. За варіантом, якому віддається більша того, щоб заміна між членами групи зберігала біоперевага, групами синонімічних амінокислот є грулогічну функцію молекули (Грантем (Grantham), пи, визначені у Таблиці II; та за варіантом, якому 1974). Зрозуміло, що інсерції та делеції амінокисвіддається найбільша перевага, групами синонімілот можуть також здійснюватись у вищевизначечних амінокислот є гр упи, визначені у Таблиці III. 43 85368 44 45 85368 Приклади здійснення амінокислотних замін у білках, які можуть використовуватись для одержанням мутеїнів остеопонтину, поліпептидів або білків для використання за цим винаходом, включають будь-які відомі методи, наприклад, наведені у [патентах США №4,959,314, №4,588,585 та №4,737,462 на ім'я Марк (Mark) та інші; №5,116,943 на ім'я Коте (Koths) та інші, №4,965,195 на ім'я Неймен (Namen) та інші; №4,879,111 на ім'я Чонг (Chong) та інші; та №5,017,691 на ім'я Лі (Lee) та інші]; та білків із заміщенням лізину, наведені у [патенті США №4,904,584 (Шоу (Shaw) та інші)]. Термін "гібридний білок" означає поліпептид, що містить остеопонтин або мутеїн чи його фрагмент, злитий з іншим білком, який, наприклад, має подовжений час перебування у рідинах у тілі людини. Остеопонтин може, таким чином, зливатись з іншим білком, поліпептидом тощо, наприклад, імуноглобуліном або його фрагментом. 46 Термін "функціональні похідні", який використовується у цьому описі, означає похідні остеопонтину, їхні мутеїни та гібридні білки, які можуть одержуватись із функціональних груп, які існують у вигляді бічних ланцюгів на залишках або N- чи Скінцевих гр упах, засобами, відомими у цій галузі, і включаються до винаходу доти, доки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто вони не знищують активності білка, яка є по суті подібною до активності остеопонтину, і не надають токсичних властивостей композиціям, що їх містять. До цих похідних можуть, наприклад, належати бічні ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати ділянки детермінанти та подовжувати час перебування остеопонтину у рідинах у тілі людини. До інших по хідних належать аліфатичні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, які одержують шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, N-ацильні похідні вільних аміногруп амінокислотних залишків, утворених з ацильними складовими (напри 47 85368 48 клад, алканоїльними або карбоциклічними ароїльТаким чином, за варіантом втілення цього виними групами) або О-ацильні похідні вільних гідронаходу, якому віддається перевага, остеопонтин є ксильних груп (наприклад, вільних гідроксильних пегільованим. груп серилових або треонілових залишків), які За додатковим варіантом втілення цього винаодержують з ацильними складовими. ходу, якому віддається перевага, гібридний білок Як "активні фракції" остеопонтину, мутеїни та одержують шляхом злиття з імуноглобуліном (Ig). гібридні білки, цей винахід включає будь-які фрагЗлиття може бути безпосереднім або здійснюваменти або попередники поліпептидного ланцюга тись за посередництвом короткого лінкерного пепбілкової молекули самостійно або разом з асоцітиду, довжина якого може становити усього від 1 йованими молекулами або залишками, зв'язаними до 3 амінокислотних залишків, або він може бути з ними, наприклад, цукровими або фосфатними довшим, наприклад, довжиною 13 амінокислотних залишками, або агрегати білкових молекул або залишків. Такий лінкер може бути, наприклад, трицукрових залишків самих по собі, за умови, що пептидом із послідовністю E-F-M (Glu-Phe-Met) або згадана фракція має по суті активність, подібну до 13-амінокислотною лінкерною послідовністю, що активності остеопонтину. містить Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-GlyТермін "солі" у цьому описі означає як солі каGln-Phe-Met, і вводиться, наприклад, між послідорбоксильних груп, так і солі, що одержують доданвністю остеопонтину і послідовністю імуноглобуліням кислоти, аміногруп молекули остеопонтину ну. Одержаний гібридний білок має поліпшені влаабо його аналогів. Солі карбоксильної групи мостивості, наприклад, подовжений час перебування жуть одержуватись засобами, відомими у цій галуу рідинах у тілі людини (час напівжиття) або підзі, і включають неорганічні солі, наприклад, солі вищену питому активність, підвищений рівень екснатрію, кальцію, амонію, заліза або цинку то що, і пресії. Злиття з імуноглобуліном може також полесолі з органічними основами, наприклад, солі, які гшити очи щення гібридного білка. одержують, наприклад, з амінами, такими як триЗа ще іншим варіантом втілення, якому віддаетаноламін, аргінін або лізин, піперидин, прокаїн ється перевага, остеопонтин зливається з констатощо. Солі, що одержують доданням кислоти, нтною ділянкою молекули імуноглобуліну. За варівключають, наприклад, солі з мінеральними кисантом, якому віддається перевага, він зливається лотами, наприклад, хлористоводневою кислотою з ділянками важкого ланцюга, наприклад ділянкаабо сірчаною кислотою, та солі з органічними кисми СН2 та СН3 людського IgG1. Інші ізоформи імулотами, такими як оцтова кислота або щавлева ноглобулінових молекул є також придатними для кислота. Звичайно, будь-яка з таких солей повинна одержання гібридних білків за цим винаходом, зберігати біологічну активність остеопонтину за наприклад, ізоформи IgG2 або IgG4, або імуноглоцим винаходом, тобто проявляти проліферативний буліни інших класів, наприклад, IgM. Гібридні білки ефект відносно олігодендроцитів. можуть бути мономерними або мультимерними, За варіантом втілення цього винаходу, якому гетеро- або гомомультимерними. Імуноглобуліновіддається перевага, остеопонтин зливається з ва частина гібридного білка може додатково момолекулою-носієм, пептидом або білком, що стидифікуватись таким чином, щоб не активува ти мулює проникнення через гематоенцефалічний зв'язування комплементу, шля ху активації комбар'єр ("ВВВ"). Це прислуговується відповідному плементу або зв'язування з Fc-рецепторами. цілеспрямуванню молекули до місця дії у ти х виЦей винахід має додаткове відношення до западках, коли до захворювання є залученою стосування комбінації остеопонтину та імуносупцентральна нервова система. Способи доставки ресорного агента для одержання лікарського залікарського засобу через гематоенцефалічний собу для лікування та/або запобігання бар'єр включають розрив гематоенцефалічного неврологічних розладів, для одночасного, послібар'єра осмотичними засобами або біохімічним довного або окремого застосування. Імуносупрешляхом завдяки застосуванню вазоактивних речосорними агентами можуть бути стероїди, метотревин, наприклад, брадикініну. Інші стратегії прохоксат, циклофосфамід, антилейкоцитарні антитіла дження через гематоенцефалічний бар'єр вклю(наприклад, САМРАТН-1) то що. чають застосування ендогенних транспортних Цей винахід має додаткове відношення до засистем, у тому числі транспортерів, опосередковастосування комбінації остеопонтину та інтерфероних носієм, наприклад, глюкозними та амінокислону для одержання лікарського засобу для лікувантними носіями; рецептор-опосередкованого ня та/або запобігання неврологічних розладів, для трансцитозу для інсуліну або трансферину; та акодночасного, послідовного або окремого застосутивних відтокових транспортерів, наприклад, рвання. глікопротеїну. Стратегії для доставки лікарського Значення терміну "інтерферон", який викорисзасобу через гематоенцефалічний бар'єр додаткотовується у цій заявці на патент, поширюється на во включають інтрацеребральну імплантацію. будь-яку молекулу, яка визначається як така у ліФункціональні похідні остеопонтину можуть тературі, з включенням, наприклад, інтерферонів спрягатись із полімерами з метою поліпшення будь-якого виду, що згадувались у вищенаведевластивостей білка, наприклад, стабільності, часу ному розділі "Передумови створення винаходу". напівжиття, біодоступності, стерпності людським Інтерферон у варіанті, якому віддається перевага, організмом або імуногенності. Для досягнення цієї може бути людським, однак він може одержувамети, остеопонтин може зв'язуватись, наприклад, тись і від інших видів доти, доки його біологічна із поліетиленгліколем (PEG). Пегілування може активність є подібною до активності людських інздійснюватись відомими методами, опис яких натерферонів, і молекула не є імуногенною для люведено, наприклад, у [WO 92/13095]. дини. 49 85368 50 Зокрема, вищенаведене визначення включає що одержують доданням кислоти, включають, наприклад, солі з мінеральними кислотами, наприбудь-які види IFN-a, IFN-b та IFN-g. Інтерфероном, якому віддається перевага, за цим винаходом є клад, хлористоводневою кислотою або сірчаною кислотою, та солі з органічними кислотами, наприIFN-b. клад, з оцтовою кислотою або щавлевою кислоТермін "інтерферон бета (IFN-b)", який викотою. Звичайно, будь-яка з таких солей повинна ристовується у цьому винаході, включає людський зберігати біологічну активність білків (остеопонтифібробластний інтерферон, який одержують шляну та інтерферону бета, відповідно) за цим винахом виділення з біологічних рідин або методами ходом, тобто проявляти здатність до зв'язування з рекомбінантних ДНК із прокаріотних або еукаріотвідповідним рецептором та ініціювати передачу них клітин-хазяїв, або його солі, функціональні сигналу рецептором. похідні, варіанти, аналоги та фрагменти. Інтерферони можуть також спрягатись із поліТермін "функціональні похідні", який викорисмерами з метою поліпшення стабільності білків. товується у цьому описі, означає похідні, які моОпис кон'югату інтерферону бета та поліолполіежуть одержуватись із функціональних груп, які тиленгліколю наведено, наприклад, у [WO існують у вигляді бічних ланцюгів на залишках або 99/55377]. N- чи С-кінцевих гр упах, способами, відомими у цій За іншим варіантом втілення цього винаходу, галузі, і включаються до цього винаходу доти, доки якому віддається перевага, інтерферон є інтерфевони залишаються фармацевтично прийнятними, роном бета (IFN-β), та за варіантом, якому віддатобто вони не знищують біологічної активності ється більша перевага, IFN-b1a. білків, як описувалось вище, наприклад, здатності Остеопонтин за варіантом, якому віддається до зв'язування відповідного рецептора та ініціюперевага, застосовується з інтерфероном одночавання передачі сигналу рецептором, і не наділясно, послідовно або окремо. ють токсичними властивостями композиції, до За варіантом втілення цього винаходу, якому складу яких вони входять. Похідні можуть мати віддається перевага, остеопонтин застосовується хімічні складові, наприклад, вуглеводи або фосу кількості приблизно 0,0001-100мг/кг маси тіла, фатні залишки, за умови, що така похідна зберігає або приблизно 0,01-10мг/кг маси тіла, або приблибіологічну активність білка і залишається фармазно 1-5мг/кг маси тіла, або у кількості приблизно цевтично прийнятною. 2мг/кг маси тіла. До числа похідних можуть бути віднесені, наЦей винахід додатково має відношення до заприклад, аліфатичні складні ефіри карбоксильних стосування молекули нуклеїнової кислоти для груп, аміди карбоксильних груп, які одержують одержання лікарського засобу для лікування шляхом реакції з аміаком або з первинними чи та/або запобігання неврологічного захворювання, вторинними амінами, N-ацильні похідні вільних де згадана молекула нуклеїнової кислоти містить аміногруп амінокислотних залишків, утворених з послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує поліацильними складовими (наприклад, алканоїльнипептид, який включає амінокислотну послідовми або карбоциклічними ароїпьними групами) або ність, яку вибирають із групи, що включає: О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (на(a) Поліпептид, що включає Послідовність №1; приклад, вільних гідроксильних груп серилових (b) Поліпептид, що включає амінокислоти 1або треонілових залишків), які одержують з ациль168 або 170 Послідовності №1; ними складовими. Такі похідні І можуть також (c) Поліпептид, що включає амінокислоти 1-16 включати, наприклад, бічні ланцюги поліетиленгліта 170-314 Послідовності №1; колю, які можуть маскувати ділянки детермінанти (d) Поліпептид, що включає амінокислоти 170та подовжувати час перебування молекули у ріди314 Послідовності №1; нах у тілі людини. (e) Поліпептид, що включає Послідовність №2; Особливе значення має білок, який деривати(f) Поліпептид, що включає Послідовність №3; зували або об'єднали з комплексоутворювальним (g) Мутеїн будь-якого поліпептиду з (а) до (f), агентом для подовження тривалості його існуванде амінокислотна послідовність має щонайменш ня. Застосовува тись за цим винаходом можуть, 40%, або 50%, або 60%, або 70%, або 80%, або наприклад, пегільовані варіанти, як згадувалось 90% ідентичність із щонайменш однією з послідоперед тим, або білки, які одержали засобами генвностей поліпептиду (а)-(f); ної інженерії і які демонструють довготривалу ак(h) Мутеїн будь-якого поліпептиду з (а) до (f), тивність у організмі. який кодується послідовністю ДНК, що гібридизуТермін "похідні" включає лише ті похідні, які не ється з комплементом нативної послідовності ДНК, замінюють одну амінокислоту з числа двадцяти що кодує будь-який із поліпептидів (a)-(f) за поміррозповсюджених природних амінокислот на іншу. но жорстких або за дуже жорстких умов; Термін "солі" у цьому описі означає як солі ка(і) Мутеїн будь-якого поліпептиду з (а) до (f), рбоксильних груп, так і солі, що одержують доданде будь-які мутації амінокислотної послідовності є ням кислоти, аміногруп білків, опис яких було наконсервативними амінокислотними замінами аміведено вище, або їхніх аналогів. Солі нокислотних послідовностей у поліпептидах (a)-(f); карбоксильної групи можуть одержуватись засо(j) ізоформу, гібридний білок, функціональну бами, відомими у цій галузі, і включають неорганіпохідну, активну фракцію або кільцево пермутовачні солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, ну похідну будь-якого з поліпептидів (a)-(f). заліза або цинку тощо, і солі з органічними осноНуклеїнова кислота може, наприклад, вводивами, наприклад, солі, які одержують, наприклад, з тись у ви гляді "оголеної" молекули нуклеїнової амінами, наприклад, триетаноламіном, аргініном або лізином, піперидином, прокаїном тощо. Солі, 51 85368 52 кислоти, наприклад, шляхом внутрішньом'язової лення лікарського засобу для лікування та/або ін'єкції. запобігання неврологічних захворювань. Таким Вона може додатково містити векторні послічином, клітинно-терапевтичний підхід може застодовності, наприклад, вірусну послідовність, придасовува тись із метою доставки лікарського засобу тну для експресії гена, що кодується молекулою до відповідних частин людського тіла. нуклеїнової кислоти у організмі людини, за варіанЦей винахід додатково має відношення до том, якому віддається перевага, у відповідних кліфармацевтичних композицій, особливо придатних тинах або тканинах. для запобігання та/або лікування неврологічних Таким чином, за варіантом втілення, якому захворювань, які включають терапевтично ефеквіддається перевага, молекула нуклеїнової кислотивну кількість остеопонтину та терапевтично ти додатково включає послідовність вектора ексефективну кількість інтерферону, факультативно з пресії. Послідовності векторів експресії є добре додатковою терапевтично ефективною кількістю відомими у цій галузі, вони включають додаткові імунодепресанту. елементи, які служать для експресії необхідного Визначення "фармацевтично прийнятний" гена. Вони можуть включати регуляторну послідоохоплює будь-який носій, який не перешкоджає вність, наприклад, промоторні та енхансерні поефективності біологічної активності активного інгслідовності, послідовності селективного маркера, редієнта і, тим самим, не є токсичним для хазяїна, точки ініціації розмноження тощо. Таким чином, якому він уводиться. Наприклад, у разі парентерадля лікування та/або запобігання захворювання льного введення, активний білок (білки) може застосовують генно-терапевтичний підхід. Перевавключатись до складу дозованої лікарської форми га полягає у тому, що експресія остеопонтину у для введення шляхом ін'єкції у таких носіях, як такому разі буде відбуватись in situ. фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватЗа варіантом втілення, якому віддається перековий альбумін або розчин Рінгера-Локка. вага, вектором експресії є вектор лентивірусного Активні інгредієнти фармацевтичної композиції походження. Було показано, що вектори на основі за цим винаходом можуть вводитись особі різними лентивірусу є дуже ефективними у перенесенні шляхами. Шляхи введення включають інтрадергенів, зокрема, у межах центральної нервової сисмальний, черезшкірний (наприклад, композиції теми. За цим винаходом можуть застосовуватись пролонгованої дії), внутрішньом'язовий, внутріштакож інші добре відомі вектори на основі вірусів, ньоочеревинний, інтравенозний, підшкірний, перонаприклад, вектори аденовірусного походження. ральний, епідуральний, місцевий, підоболонковий, З метою стимулювання проходження остеопоректальний та інтраназальний. Може застосовувантину через гематоенцефалічний бар'єр може затись будь-який інший терапевтично ефективний стосовуватись цілеспрямований вектор. Такі векшлях введення, наприклад, абсорбування через тори можуть спрямовуватись, наприклад, на епітеліальну або ендотеліальну тканини або генна рецептори трансферину або інші ендотеліальні терапія, де пацієнту вводиться молекула ДНК, що транспортні механізми. кодує активний агент (наприклад, за допомогою За варіантом втілення цього винаходу, якому вектора), що примушує активний агент експресувіддається перевага, вектор експресії може вводиватись та секретуватись in vivo. На додаток до тись шляхом внутрішньомя'зової ін'єкції. цього, білок (білки) за цим винаходом можуть увоЗа цим винаходом передбачається також задитись разом з іншими компонентами біологічно стосування вектора для індукування та/або стимуактивних агентів, наприклад, фармацевтично прилювання ендогенного продукування остеопонтину йнятними поверхнево-активними речовинами, нау клітині, яка за нормальних умов остеопонтину не повнювачами, носіями, розчинниками та розріджуекспресує або яка експресує кількості остеопонтивачами. ну, що є недостатніми. Згаданий вектор може Для парентерального (наприклад, інтравенозвключати регуляторні послідовності, функціонального, підшкірного, внутрішньом'язового) введення, ність яких проявляється у клітинах, які повинні активний білок (білки) може вводитись до складу експресувати остеопонтин. Такі регуляторні послірозчину, суспензії, емульсії або ліофілізованого довності можуть бути, наприклад, промоторами порошку у поєднанні з фармацевтично прийнятабо енхансерами. Згадана регуляторна послідовним парентеральним носієм (наприклад, водою, ність може у подальшому вводитись до відповідфізіологічним розчином, розчином декстрози) та ного локусу геному шляхом гомологічної рекомбідомішками, які підтримують ізотонічність (напринації, завдяки чому згадана регуляторна клад, маніт) або хімічну стабільність (наприклад, послідовність стає функціонально зв'язаною з геконсерванти та буфери). Композиція стерилізуєтьном, експресія якого повинна бути індукована або ся за допомогою традиційних способів. стимульована. Цю технологію, звичайно, називаБіодоступність активного білка (білків) за цим ють "ендогенною активацією генів" (EGA) і опис її винаходом також може поліпшуватись шляхом наведено, наприклад, у [WO 91/09955]. застосування процедур спряження, які підвищують Цей винахід додатково має відношення до зачас напівжиття молекули у людському тілі, напристосування клітини, яка була піддана генетичному клад, шляхом зв'язування згаданої молекули з модифікуванню, для продукування остеопонтину поліетиленгліколем, як описується у заявці на [папри виготовленні лікарського засобу для лікування тент РСТ WO 92/13095]. та/або запобігання неврологічних захворювань. Терапевтично ефективні кількості активного (Цей винахід додатково має відношення до кліих) білка (-ів) будуть залежати від багатьох змінтини, яка була піддана генетичному модифікуванних, у тому числі від типу білка, спорідненості білню для продукування остеопонтину для виготовка, будь-якої залишкової цитотоксичної активності, 53 85368 54 що демонструється антагоністами, шляху введенабо неопубліковані американські або зарубіжні ня, клінічного стану пацієнта (у тому числі бажанозаявки на патент, видані американські або зарубісті підтримування нетоксичного рівня активності жні патенти або будь-які інші посилання, включені ендогенного остеопонтину). до цього опису у повному обсязі, із включенням "Терапевтично ефективною кількістю" є така усі х даних, таблиць, фігур та тексту, наведених у кількість, у разі введення якої остеопонтин демонзгаданих посиланнях. На додаток до цього, вміст струє позитивний ефект щодо неврологічного запосилань у повному обсязі, цитованих у посиланхворювання. Доза, введена особі (разоваабо банях, цитованих у цьому описі, включено до цього гаторазова), буде змінюватись у залежності від опису, як посилання. ряду факторів, у тому числі фармакокінетичних Посилання на відомі стадії способів, традиційвластивостей остеопонтину, шляху введення, стані стадії способів, відомі способи або традиційні ну та характеристик (стать, вік, маса тіла, стан способи у жодному разі не є визнанням того, що здоров'я, розміри) пацієнта, тяжкості симптомів, будь-який аспект, опис або варіант втілення цього одночасного лікування, частоти лікування та бавинаходу розкривається, роз'яснюється або підкажаного ефекту. зується відомим рівнем техніки. Як згадувалось вище, остеопонтин за варіанНаведений далі опис конкретних варіантів втітом, якому віддається перевага, може застосовулення настільки повно розкриє загальну природу ватись у кількості приблизно 0,0001-10мг/кг маси цього винаходу, що інші зможуть, завдяки викоритіла, або приблизно 0,01-5мг/кг маси тіла, або станню знань, що знаходяться у межах цієї галузі приблизно 0,1-3мг/кг маси тіла, або приблизно 1(із включенням вмісту посилань, що цитуються у 2мг/кг маси тіла. Додатковими кількостями остеоцьому описі), легко модифікувати та/або адаптувапонтину, яким віддається перевага, є кількості ти для різних варіантів застосування такі конкретні приблизно 0,1-1000мкг/кг маси тіла, або приблизно варіанти втілення, без зайвого експериментуван1-100мкг/кг маси тіла, або приблизно 10-50мкг/кг ня, без відхилення від загальної концепції цього маси тіла. винаходу. Таким чином, такі адаптації та модифіШляхом введення, якому віддається перевага кації знаходяться у діапазоні еквівалентів розкриза цим винаходом, є введення підшкірним шляхом. тих варіантів втілення, виходячи з роз'яснень та Додаткова перевага за цим винаходом віддається настанов, представлених у цьому описі. Слід ровнутрішньом'язовому введенню. зуміти, що фразеологія або термінологія цього За додатковими варіантами втілення, яким опису призначена для опису, а не для обмеження, віддається перевага, остеопонтин вводиться щозавдяки чому згадана термінологія або фразеолоденно або через день. гія цього опису повинна інтерпретуватись досвідДобові дози, як правило, вводяться роздільченим фахівцем у світлі роз'яснень та настанов, ними дозами або у вигляді лікарської форми пропредставлених у цьому описі, у поєднанні зі знанлонгованої дії, ефективної щодо одержання бажанями пересічного фахівця у цій галузі. них результатів. Друге або подальші введення Винахід, що його було описано вище, може можуть здійснюватись у дозі, яка є такою саме, бути легше зрозумілим завдяки посиланню на меншою або більшою за початкову або попередні представлені далі приклади, які наводяться для дози, введені особі. Друге або подальше введення ілюстрації і не призначені для обмеження цього можуть здійснюватись під час або перед початком винаходу. захворювання. Приклади За цим винаходом остеопонтин може вводиПриклад 1: Остеопонтин диференційовано тись особі профілактично або терапевтично перед, експресується у in vi vo та in vitro моделях демієліодночасно або послідовно із застосуванням інших нізаііійних захворювань схем лікування або лікарських засобів (наприклад, Методи схема багаторазового приймання лікарського заIn vitro модельні системи собу) у терапевтично ефективній кількості, зокреЛінію клітин Oli-neu одержали шляхом імортама, з інтерфероном. Активні агенти, що вводяться лізації олігодендрогліальних попередників репліодночасно з іншими терапевтичними агентами, каційно-дефективним ретровірусом, що кодує tможуть вводитись у тих саме або інших композиціneu онкоген, конститутивно активну тирозинкіназу; ях. було показано, що диференціація цієї лінії клітин Цей винахід додатково має відношення до індукується у присутності 1мМ дибутирил-цАМФ у способу лікування неврологічного захворювання, культуральному середовищі (Янг (Jung) та інші, який включає введення пацієнту, який цього по1995). Це забезпечило можливість дослідження требує, ефективної кількості остеопонтину або олігодендроцитів у вигляді ізольованих клітин. агоніста активності остеопонтину, факультативно Морфологія та антигенні характеристики лінії разом із фармацевтично прийнятним носієм. клітин мишачих олігодендроцитів Oli-neu, яку одеСпосіб лікування неврологічного захворюванржали з попередників мишачих олігодендроцитів ня, який включає введення пацієнту, який цього А2В5, у стані без обробки та після 6 днів перепотребує, ефективної кількості остеопонтину або ддиференціаційної обробки 1-5мМ дибутирилагоніста активності остеопонтину та інтерферону, цАМФ значно різняться. У той час як клітини лінії факультативно разом із фармацевтично прийнятOli-neu, які не піддавались обробці, мають круглу ним носієм, також входить до обсягу цього винаформу і є переважно біполярними, подібно до кліходу. тин-попередників олігодендроцитів, у клітин, які Усі посилання, наведені у цьому описі, у тому піддавались обробці цАМФ, з'явились численні числі журнальні статті або реферати, опубліковані вирости, вони демонстрували плаский фенотип і 55 85368 56 навіть утворювали пласкі, довгасті "оболонкоподіОднією з найбільш відомих та широко викорибні" структури. стовуваних моделей ремієлінізації є купризонова На додаток до цього, аналіз мієлінізації in vitro модель ремієлінізації у мишей. Ця модель вклюіз застосуванням змішаних кортикальних культур чає оральне введення органічної сполуки, куприможе використовуватись для забезпечення візуазону, хелатора міді, яка, як було показано, є вибірлізації функціонального мієліну in vitro. Ця система ково токсичною для олігодендроцитів (Морелл забезпечує можливість дослідження того, яким (МоrеІІ) та інші, 1998). чином олігодендроцити контактують та мієлінізуДемієлінізація та ремієлінізація відбувається у ють аксони у присутності клітин центральної нермозолистому тілі мишей, що піддаються обробці вової системи інших типів (Любецкі (Lubetzki) та купризоном. Ці патологічні умови можуть візуаліінші, 1993). У цій системі можуть перевірятись біозуватись шляхом забарвлювання антитілом проти логічні фактори, які можуть впливати на проліфециклічної нуклеотидфосфодіестерази (CNPase) рацію попередників олігодендроцитів або діяти на або антитілом проти МБР (основного мієлінового диференціацію та виживаність олігодендроцитів, білка). Мієлін забарвлюють барвником Luxol Fast наприклад, шляхом впливання на утворення реаBlue-перйодною кислотою-шифовою основою льних мієлінових сегментів. Необхідність вивчення (LFB-PAS). Попередники олігодендроцитів, які підпроцесу мієлінізації in vitro призвела до розробки даються ремієлінізації, можуть візуалізуватись за цілого ряду аналізів, у тому числі аналізу агрегудопомогою антитіл для рецептора PDGFa (тромвання культур клітин головного мозку (Метью боцитарний фактор росту) або NG2. (Matthieu) та інші, 1992), аналізу культур зрізів моНаслідком введення купризону мишам впрозочка (Ноттерпек (Notterpek) та інші, 1993) та сисдовж 3-5 тижнів є екстенсивна демієлінізація мотем спільного культивування (Шоу (Shaw) та інші, золистого тіла. Одночасно з демієлінізацією, через 1996; Баррес (Barres) та інші, 1993). Перевага цих 3 тижні після введення купризону, активізується моделей полягає у тому, що вони надають можлисинтез транскриптів мієлін-специфічних генів (Мовість дослідження поведінки олігодендроцитів у релл (МогеІІ) та інші, 1998). поєднанні із клітинами інших типів і того, яким чиПісля припинення введення купризону ствоном ці клітини стимулюються до продукування рюється середовище, яке сприяє відновленню, мієліну. Шляхом специфічних пошкоджень у цих завдяки чому через 6 тижнів після припинення системах може також провокуватись демієлінізазгодовування купризону миші демонстрували ексція, і може вивчатись також відповідний процес тенсивну ремієлінізацію у мозолистому тілі. Таким ремієлінізації. чином, купризонова модель забезпечує повну in In vi vo модельні системи vi vo парадигму, у межах якої можливим є досліІснує широкий діапазон експериментальних in дження аспектів демієлінізації та ремієлінізації. До vi vo та in vitro моделей для вивчення розсіяного переваг цієї системи належить відсутність інфільтсклерозу. У більшості in vivo моделей використорації Т-клітин до тканин центральної нервової сисвується класична тваринна модель розсіяного теми, що надає можливість більш виключного досклерозу, експериментальний алергічний енцефаслідження процесів мієлінізації, а також ломієліт (ЕАЕ). Існує багато варіантів цієї моделі, відтворюваності результатів (Хіремат (Hiremath) та які були адаптовані для застосування на широкому інші, 1998). діапазоні видів ссавців, у тому числі на мишах, Для обробки купризоном у цьому дослідженні пацюках та приматах (огляд дивись у Петрі (Petry) були використані миші-самиці лінії C57BL/6 (віком та інші, 2000). На додаток до цього, були сформу8 тижнів, 20±3г), яких підрозділяли на 6 груп, кожльовані методики для "імітації" запропонованої на з яких складалась з 6 тварин. вірусної складової розсіяного склерозу на тваринГрупа 1: контрольна група, якій згодовували них моделях, наприклад, модель розсіяного скленормальний порошкоподібний корм; розу на основі енцефалітогенного вірусу мишей Група 2: впродовж 3 тижнів згодовували поТейлера (Theiler) (Даль Канто (Dal Canto) та інші, рошкоподібний раціон, що містив 0,2% купризону 1995). (Куп3т); Тваринні моделі для виключного дослідження Група 3: впродовж 5 тижнів згодовували помієлінізації у центральній та периферичній нерворошкоподібний раціон, що містив 0,2% купризону вих системах використовуються не так часто. Була (Куп5т); доведена корисність спостереження за процесом Група 4: впродовж 5 тижнів згодовували поеволюційної мієлінізації для одержання даних щорошкоподібний раціон, що містив 0,2% купризону, до механізмів, які лежать у основі диференціації, з подальшим 1-тижневим періодом відновлення, міграції та проліферації олігодендрогліальних або впродовж якого тваринам згодовували нормальшванівських клітин, відповідно до "гіпотези рекапіний порошкоподібний раціон (1тР); туляції" (Франклін (Franklin) та Хінкс (Hinks), 1999). Група 5: впродовж 5 тижнів згодовували поОднак для порівняння еволюційної мієлінізації, яка рошкоподібний раціон, що містив 0,2% купризону, відбувається у той час, коли центральна нервова з подальшим 3-тижневим періодом відновлення, система або периферична нервова система ще впродовж якого тваринам згодовували нормальзнаходяться у стадії формування, та ремієлінізації, ний порошкоподібний раціон (3тР); яка відбувається у дорослій парадигмі, необхідно Група 6: впродовж 5 тижнів згодовували побуло сформулювати моделі, які безпосередньо рошкоподібний раціон, що містив 0,2% купризону, адресувались би до процесу ремієлінізації. з подальшим 6-тижневим періодом відновлення, Купризонова модель впродовж якого тваринам згодовували нормальний порошкоподібний раціон (6тР). 57 85368 58 Після завершення кожної обробки у певні пе60хв у 80% розчині етанолу ріоди часу у тварин кожної групи збирали головний 90хв у 80% розчині етанолу мозок. Мишей спочатку анестезували, і здійснюва30хв у 96% розчині етанолу ли перфузію через лівий шлуночок. Головні мозки 90хв у 96% розчині етанолу збирали, і робили серійні зрізи на рівні мозолисто120хв у 96% розчині етанолу го тіла-хвостатого ядра (смугасте тіло) та гіпокам30хв у 100% розчині ксилолу па. Зрізи тканини головного мозку заливали пара60хв у 100% розчині ксилолу фіном для імуногістохімічних досліджень та Чотири 60хв інкубування у парафіні (Histosec, гібридизації in situ. Merck 11609); остання стадія для заливки. Одержання гістологічних препаратів Усі розчини витримували при температурі Формалін одержували шляхом розведення 1 40°С із парафіном при температурі 65°С. Після об'єму формальдегіду (Fluka, 36%, аналітичної одержання гістологічних зрізів, зрізи головного та чистоти) та 1 об'єму забуференого фосфатом фіспинного мозку вмішували з необхідною орієнтацізіологічного розчину 8 об'ємами стерильної води. єю до пластикових камер для заливання парафіДо силіконової пробірки, пристосованої до перином. Камери заливали рідким парафіном і витристальтичного насоса та спорядженої голкою 20G, мували зі швидким охолодженням до температури 1-1/5, вносили 10мл забуференого фосфа том фі0°С на охолоджувальній плиті. Парафінові блоки зіологічного розчину. Після цього пробірку постійно розрізували за допомогою мікротома (зрізи товщизаповнювали 40мл формаліну. Це слід робити з ною 5-10мкм). Після цього зрізи вміщували на обобережністю для запобігання утворення повітряроблені силаном предметні скельця (SuperFrostних бульбашок. PlusÔ , номер за каталогом Menzel 041300). Після Тварин анестезували пентобарбіталом натрію встановлення зрізи зберігали у вільному від пилу середовищі. (SanofitÒ ), розбавленому 1:1 стерильним забуференим фосфатом фізіологічним розчином до конКультура клітин центрації 3мг/100мл, перед проведенням внуїрішOli-neu: Клітини лінії клітин мишачих олігоденньосерцевої перфузії фіксатором для дроцитів (Oli-neu) збагачували центрифугуванням і забезпечення можливості подальшого гістологічресуспендували у живильному середовищі Сато ного аналізу органів та тканин. Кожній миші здійс(Троттер (Trotter) та інші, 1989). Клітини культивунили внутрішньоочеревинну ін'єкцію 0,05мл вали при контрольованих умовах у 75мл колбах (0,75мг/кг). Коли тварини стали сонними, їхні кінціпри температурі 37°С та 5% СО2. Диференціацію вки зафіксували булавками (голки 25G 5/8) через здійснювали шляхом безпосереднього додання до шкіру до пінополістиролової плити. Живіт кожної клітинного культурального середовища 1мМ тварини дезинфікували етанолом, і по зовнішній dbцАМФ. РНК екстрагували за методом Trizol (дистороні у шкірі стерильними ножицями зробили вись нижче). розріз. Після цього живіт був додатково розрізаний Виділення РНК до правого та лівого боку. Зовнішній клапоть шкіри Загальну РНК виділяли із клітин Oli-neu, зрізів підіймали пінцетом, діагональним розрізом відкриголовного мозку мишей, які одержували купризон, вали діафрагму, і робили двосторонній розріз перта з цільного постнатального головного мозку мипендикулярно до ребер для розкриття порожнини шей на різних стадіях розвитку за протоколом ексгрудної клітки з серцем, що пульсувало у середній трагування Tri-ZOLÒ (Life Technologies AG, Basel, частині. Серце утримували пінцетом, і праве пеSwitzerland). Полі(А)+ РНК одержували зі зразків редсердя негайно розрізали з венозною кровотезагальної РНК із застосуванням колонок Qiagen чею. Для перфузії використовували 10мл забуфеOLIGOTEXÔ (QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, реного фосфатом фізіологічного розчину з Valencia, CA91355, USA). подальшим вливанням 40мл формаліну кожній Аналіз диференційної експресії генів (DGE) із миші. Головний та спинний мозок кожної тварини застосуванням мікропослідовностей кДНК обережно вирізали і вмішували до 50мл пробірки Експерименти з мікропослідовностями були FalconÒ із 10мл формалінового розчину на 2год. здійснені фірмою Incyte Genomics (Incyte Genomics Після цього формаліновий розчин замінювали Inc., 3160 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, 10мл стерильного забуференого фосфатом фізіоUSA). DGE аналіз здійснювали із застосуванням логічного розчину, і матеріал витримували при мікропослідовності експресії мишачого гена Mouse температурі +4°С впродовж ночі. Після цього заGEMÔ 1 фірми Incyte буферений фосфатом фізіологічний розчин знову (http://www.incyte.com/reagents/gem/products.shtml). замінювали, і матеріал витримували при темпераНа чіпи фірми Incyte, які використовували під турі +4°С впродовж декількох годин. Напівкулі гочас проведення цих аналізів, наносили молекули ловного мозку і спинний мозок розрізали на зрізи кДНК, що відповідали 8734 генам, як відомим та і товщиною приблизно 0,5см і вмішували до пласневідомим (послідовності EST). Технологія фірми тикових піддонів, сумісних з машиною для залиIncyte забезпечувала можливість піддання мікровання. Заливання головного та спинного мозку зразків кожного з цих генів спот-тесту на одну попарафіном здійснювали за допомогою автоматичслідовність. Кожна молекула кДНК, що відповідала ної установки Tissue Tek Vacuum Infiltration відомому гену або EST, мала довжину у 500Processor E150/E300 (Miles Inc. Diagnostics) за про5000п.н. Специфікації фірми Incyte забезпечували грамою, наведеною нижче: динамічний діапазон виявлення у межах від 2пг до 30хв у 50% розчині етанолу 2000пг для окремої мРНК у зразку. Кількість РНК, 60хв у 70% розчині етанолу необхідна для кожного експерименту з послідов60хв у 70% розчині етанолу ностями, становила 600нг полі(А)+ РНК. Встанов 59 85368 60 лені рівні диференційної експресії, що піддавались тоді співвідношення=Е 2/Е1 у іншому разі співвідвиявленню, встановлювались у вигляді співвідноношення=-Е1/Е2. шень, більших за 1,75. Оскільки гібридизація зразків здійснюється одНормалізація сигналу та визначення рівнів ночасно за конкурентних умов, те хнологія чіпів експресії фірми Icyte є більш точною щодо визначення відСпіввідношення, обчислені за двома інтенсивносних змін експресії і стає менш надійною для ностями флуоресценції, забезпечували кількісний визначення абсолютних рівнів експресії. Однак ці критерій відносного рівня експресії генів 2значення рівнів експресії можна використовувати лункових зразків, що піддавались аналізу. Співвіддля порівняння пар популяцій РНК зразків, які фаношення, які надавались кожному гену, обчислюктично фізично на чіпі не порівнювались. Такі поріють, ви ходячи з нормалізованих рівнів експресії. вняння in silico є менш надійними, однак вони моКоефіцієнт нормалізації обчислюють шляхом подіжуть надати додаткову інформацію щодо лу загальної експресії другого зразка (Р2) на загамеханізмів, які можуть застосовуватись до систем, льну експресію першого зразка (Р1). Потім цей що піддаються аналізу. коефіцієнт застосовують до рівня експресії кожноРезультати го гена у Р2. Після здійснення цієї стадії нормаліМоделі, шо використовувались для аналізу зації, співвідношення генів вираховують за наведиферешіійної експресії остeопонтину деним далі правилом: У Таблиці IV показані моделі, що використовуНехай Е1 буде рівнем експресії даного гена у вались для екстрагування мРНК та чіпової гібризразку 1 і нехай Е2 буде нормалізованим рівнем дизації (DGE аналіз), як описувалось вище. експресії того саме гена у зразку 2: якщо Ε2>Ε1, Таблиця IV Моделі, застосовані при DGE аналізі Моделі Обробки Клітини лінії oli-neu+дибутирил-цАМФ 1. Модель диференціації (6год) олігодендроцитів in vitro Клітини лінії oli-neu+дибутирил-цАМФ (6 днів) Передній мозок дорослої особи+купризон (3 тижні) 2. Купризонова модель Передній мозок дорослої осодемієлінізаби+купризон (5 тижнів) ції/ремієлінізації in vivo Передній мозок дорослої особи+купризон (3 тижні) 3. Еволюційна мієлініза- Постнатальний (день 10-Р10) мишачий ція мозочок Позитивний контроль для DGE: Регуляція мієлін-специфічних генів. Вперше, як позитивний контроль, було перевірено, чи може бути показане диференційне регулювання мієлін-специфічних генів за допомогою DGE. У Таблиці V показана регуляція, що спостерігалась для мієлін-специфічних генів, присутніх у мікропослідовностях фірми Incyte. Значення диференційної експресії для кожного гена повідом Контролі Клітини лінії oli-neu (обробці не піддавались) Клітини лінії oli-neu (обробці не піддавались) Передній мозок дорослої особи, що не піддавався обробці Передній мозок дорослої особи, що не піддавався обробці Передній мозок дорослої особи+купризон (5 тижнів) Постнатальний (день 2-Р2) мишачий мозочок ляються з 3-тижневої та 5-тижневої часових точок обробки купризоном. Ці дані є позитивним контролем для перевірки надійності чіпів. Оскільки регуляція структурних генів мієліну за наших експериментальних умов є добре визначеною, експресія цих генів, що спостерігалась і визначалась на чіпах, може використовуватись для вказання а) точності технології та b) відтворюваності наших моделей. Таблиця V Регуляція in vivo мієлін-специфічних генів у аналізах мікропослідовностей на моделях мієлінізації in vivo Назва гена Основний мієліновий білок Мієліновий везикулярний білок/мієліновий та лімфоцитарний білок (MVP/MAL) Циклічна нуклеотидфосфодіестераза 1 (CNPase) *Постнатальний мозочок день 2/10 Номер депонування АА059540 Куп. 3т. 113,6 Куп. 5т. 11,3 Ρ 2/10* +7,9 АА519027 33,5 11,7 0 W63987 22,9 11,1 +2,9