Застосування перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції
Формула / Реферат
1. Застосування однієї або більше перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції для оновлення або заміни тканин або клітин хворого, який хворіє на неврологічне захворювання, при якому перепрограмовані стовбурові нервові клітини отримані шляхом перепрограмування комітованих клітин-попередників першої клітинної лінії з пацієнта, при якому перепрограмування включає контактування цих комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, упізнавання або індикації антигену на поверхні комітованих клітин.
2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що хворий хворіє на хвороби або розлади, вибрані з групи, яка складається з хвороби мотонейрона, хвороби Паркінсона, аміотрофного латерального склерозу, пошкодження спинного мозку, розсіяного склерозу, травми голови, депресії, погіршення зору.
3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують з цілісної крові, кісткового мозку, нейронної тканини, м'язової тканини, епідермісу або шкіри.
4. Застосування за п. 3, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують з цілісної крові.
5. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують за допомогою аферезису.
6. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що комітовані клітини отримують з мобілізованої або немобілізованої крові.
7. Застосування за п. 4, яке відрізняється тим, що комітовані клітини вибирають з групи, що включає Т-клітини, В-клітини, еозинофіли, базофіли, нейтрофіли, мегакаріоцити, моноцити, еритроцити, гранулоцити, мастоцити, лімфоцити, лейкоцити, тромбоцити і червоні клітини крові.
8. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що перепрограмування включає ретродиференціювання, трансдиференціювання, передиференціювання комітованих клітин або їх комбінацію.
9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що перепрограмування включає ретродиференціювання комітованих клітин, щоб отримати ретродиференційовані клітини.
10. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що рецептором є антиген головного комплексу гістосумісності (МНС) класу І або антиген МНС класу II.
11. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що засобом є моноклональне антитіло до рецептора.
12. Застосування за п. 11, яке відрізняється тим, що антитіло вибирають з групи, яка включає моноклональне антитіло CR3/43 і моноклональне антитіло TAL 1В5.
13. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що медикамент або фармацевтичну композицію вводять шляхом ін'єкції або імплантації.
14. Застосування за п. 13, яке відрізняється тим, що медикамент або фармацевтичну композицію вводять парентеральним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним, підшкірним, внутрішньоочним методом, перорально, трансдермальною ін'єкцією або ін'єкцією в спинну рідину.
15. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що перепрограмування включає трансдиференціювання комітованих клітин, щоб отримати трансдиференційовані клітини.
16. Застосування за п. 15, яке відрізняється тим, що комітовані клітини трансдиференціюють культивуванням комітованих клітин в середовищі культуральної тканини, яке включає один або більше засобів ретродиференціювання і один або більше промоторів диференціювання.
17. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що середовище культуральної тканини вибирають з групи, яка включає середовище IMDM, DMEM, ЕМЕ, α-МЕМ, RPMI 1640, Ham-F-12, Е199, MCDB, Leibovitz L-15 і середовище Williams Е або будь-які комерційно доступні культуральні середовища.
18. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є антикоагулянт, хелатуючий засіб або антибіотик.
19. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є вітамін, мінерал або їх похідна.
20. Застосування за п. 19, яке відрізняється тим, що вітамін, мінерал або їх похідну вибирають з групи, яка включає вітамін А, вітамін В3, вітамін С, вітамін D3, вітамін K, ретиноєву кислоту, нікотинамід, цинк або сполуки цинку і кальцію або сполуки кальцію.
21. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є природний або синтетичний гормон.
22. Застосування за п. 21, яке відрізняється тим, що природним або синтетичним гормоном є гідрокортизон або дексаметазон.
23. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є амінокислота або її похідна.
24. Застосування за п. 23, яке відрізняється тим, що амінокислоту або її похідну вибирають з групи, яка включає L-глутамін (L-glu), ерготіонеїн (EGT), пролін і замінні амінокислоти (NEAA).
25. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є хімічна сполука або її похідна.
26. Застосування за п. 25, яке відрізняється тим, що хімічну сполуку або її похідну вибирають з групи, яка включає β-меркаптоеталь, дибутилмонофосфат циклічного аденозину (db-сАМР), монотіогліцерин (MTG), путресцин, диметилсульфоксид (DMSO), гіпоксантин, аденін, форсколін, силостамід і 3-ізобутил-1-метилксантин.
27. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є нуклеозид або його аналог.
28. Застосування за п, 27, яке відрізняється тим, що нуклеозидом або його аналогом є 5-азацитидин.
29. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є кислоти або їх солі.
30. Застосування за п. 29, яке відрізняється тим, що кислоту або її сіль вибирають з групи, яка включає аскорбінову кислоту, піруват, окадову кислоту, лінолеву кислоту, етилендіамінтетраоцтову кислоту (EDTA), динатрієву сіль EDTA, етиленглікольтетраоцтову кислоту (EGTA), антикоагулянт цитрат декстрози формули А (ACDA), бутират натрію і гліцерофосфат.
31. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є антибіотик або лікарський засіб.
32. Застосування за п. 31, яке відрізняється тим, що антибіотик або лікарський засіб вибирають з групи, яка включає G418, гентаміцин, пентоксифілін (1-(5-оксогексил)-3,7-диметилксантин) та індометацин.
33. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що промотором диференціювання є білок.
34. Застосування за п. 33, яке відрізняється тим, що білком є активатор плазміногену тканини (ТРА).
35. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що культуральне середовище тканини містить аутологічну плазму; тромбоцити; сироватку або сироватки ссавців.
36. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що клітини культивують в мішках з кров'ю, підкладках, мішках для культивування тканини або пластмасових посудинах для культивування тканини.
37. Застосування за п. 36, яке відрізняється тим, що посудини для культивування тканин є прикріпленими або неприкріпленими посудинами для культивування тканини.
38. Застосування за п. 36, яке відрізняється тим, що посудини для культивування тканини є закритими або незакритими.
39. Застосування за п. 38, яке відрізняється тим, що посудини для культивування тканини покривають засобом, вибраним з групи, яка включає желатин, колаген, матригель або позаклітинну матрицю.
40. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що клітини культивують за температури від приблизно 18 до приблизно 40 °С.
41. Застосування за п. 16, яке відрізняється що клітини культивують при рівні діоксиду вуглецю від приблизно 4 до приблизно 10 %.
42. Застосування за п. 16, яке відрізняється тим, що клітини культивують при рівні кисню від приблизно 10 до приблизно 35 %.
43. Фармацевтична композиція, що містить перепрограмовані цільові клітини, визначені в будь-якому з пп. 1-42.
44. Спосіб отримання перепрограмованих стовбурових нейронних клітин для введення хворому, який цього потребує, який включає (і) отримання комітованих клітин першої клітинної лінії; (іі) перепрограмування комітованих клітин, щоб отримати перепрограмовані стовбурові нейронні клітини, причому це перепрограмування включає контактування комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, пізнавання або індикації антигену у поверхні комітованих клітин.
45. Фармацевтична композиція, яка містить перепрограмовані стовбурові нейронні клітини, отримані способом за п. 44, та принаймні один фармацевтично прийнятний ексципієнт.
46. Спосіб отримання медикаменту або фармацевтичної композиції для введення хворому, який цього потребує, який передбачає: (і) отримання комітованих клітин першої клітинної лінії; (іі) перепрограмування комітованих клітин, шляхом контакту з антитілом, яке зв'язує рецептор, який медіює розпізнавання та представлення антигену на поверхні комітованих клітин для одержання перепрограмованих клітин-мішеней, причому ці перепрограмовані клітини-мішені є стовбуровими нейронними клітинами; та (ііі), при потребі, комбінування перепрограмованих стовбурових нейронних клітин з одним або більше фармацевтичним ексципієнтом.
47. Фармацевтична композиція, отримана способом за п. 46.
Текст
Реферат: Винахід належить до застосування однієї або більше перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції для оновлення або заміни тканин або клітин хворого, який хворіє на неврологічне захворювання, при якому перепрограмовані стовбурові нервові клітини отримані шляхом перепрограмування комітованих UA 109265 C2 ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ UA 109265 C2 клітин-попередників першої клітинної лінії з пацієнта, при якому перепрограмування включає контактування цих комітованих клітин з антитілами, які зчіплюють рецептор, який є посередником захоплення, пізнавання або індикації антигену на поверхні комітованих клітин. UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Включення посиланням Всі документи, які цитуються або на які посилаються в документах, що цитуються тут, разом з будь-якими інструкціями до продукту, описами, специфікаціями продукту і технологічними картами до будь-якого продукту, який згадується тут, або в будь-якому документі, включеному шляхом посилання, тим самим включаються до даного опису шляхом посилання, і може бути використаний при реалізації винаходу. Галузь техніки, до якої відноситься винахід Спосіб лікування різних хвороб, порушень або станів у хворого, при якому використовуються перепрограмовані клітини, такі як ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини. Спосіб передбачає, отримання комітованих клітин-попередників хворого (пацієнта), ретродиференціювання комітованих клітин-попередників з отриманням ретродиференційованих клітин-мішеней і введення ретродиференційованих клітин хворому. У певних варіантах здійснення метод передбачає отримання комітованих клітин-попередників хворого, трансдиференціювання комітованих клітин-попередників з отриманням трансдиференційованих клітин-мішеней, і введення трансдиференційованих клітин-мішеней хворому. Ретродиференційовані або трансдиференційовані клітини-мішені відновлюють або оновлюють тканини або клітини хворого. Рівень техніки Стовбурові клітини характеризуються їх здатністю оновлювати себе шляхом мітотичного поділу клітин і диференціюватися в різноманітні лінії спеціалізованих типів клітин. Двома великими типами стовбурових клітин ссавців є ембріональні стовбурові клітини, які виділяють з внутрішньої клітинної маси бластоцисти, і диференційовані стовбурові клітини, які знайдені в зрілих тканинах. У ембріонові, який розвивається, стовбурові клітини можуть диференціюватися у всі спеціалізовані ембріональні тканини. У дорослих організмах стовбурові клітини і клітинипопередники оновлюють спеціалізовані клітини і підтримують нормальне оновлення органів, здатних до відновлення, таких як кров, шкіра або кишкові тканини. Стовбурові клітини широко поширені в ембріонах, які розвиваються, хоча, кількість стовбурових клітин зменшується, у міру того як розвиток прогресує. Навпаки, дорослий організм містить обмежене число стовбурових клітин, які обмежені певними компартаментами організму. Терапевтичне застосування стовбурових клітин має потенціал змінити лікування багатьох хвороб або порушень. Тоді як деякі способи лікування зрілими стовбуровими клітинами, такими як трансплантати кісткового мозку, вже існують, медичні дослідники чекають використання стовбурових клітин, щоб лікувати ширший перелік хвороб, включаючи, серед інших захворювань, рак, хворобу Паркінсона, пошкодження спинного мозку, аміотрофічний бічний склероз, розсіяний склероз і пошкодження м'язів. Такі методи лікування можуть використовувати в своїх інтересах здатність стовбурових клітин до диференціації в типи клітин, які необхідні, щоб лікувати хворобу. Проте існує невизначеність щодо успіху в лікуванні таких хвороб, використовуючи початкові клітини, а також того, що стосується легкості отримання стовбурових клітин. Наприклад, гематопоетичні стовбурові клітини традиційно отримують з кісткового мозку, периферійної крові, яка мобілізує фактор росту або пуповинної крові (плацента). Гематопоетичні стовбурові клітини можуть також бути отримані з ембріональних стовбурових клітин, які вилучають з ембріонів, отриманих з використанням методики запліднення in vitro. Проте отримання з цих джерел є складним та іноді небезпечним, і може бути ускладненим супутніми етичними проблемами. Далі, число стовбурових клітин, які можуть бути отримані з цих джерел є обмеженим. Крім того, стовбурові клітини можуть зазнавати труднощі при диференціації в клітини, необхідні для лікування хвороби. Розкриття винаходу Даний винахід відноситься до використання перепрограмованих клітин для відновлення або оновлення тканини або клітин хворого. Наприклад, даний винахід відноситься до використання ретродиференціації диференційованих або комітованих клітин-попередників для відновлення тканини або оновлення тканин або клітин хворого. Даний винахід також відноситься до використання трансдиференційованих клітин, отриманих трансдиференціюванням диференційованих комітованих клітин-попередників, щоб відновлювати тканини або оновлювати тканини або клітини хворого. Застосування базується, частково, на відкритті заявника, що комітовані клітини-попередники або соматичні клітини, отримані від хворого, можуть бути перепрограмовані з отриманням клітин різних ліній, і ці перепрограмовані клітини можуть бути введені хворому, щоб відновлювати або оновлювати тканини або клітини. Приклади процесу перепрограмування включають ретродиференціацію і трансдиференціювання. 1 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отже, заявники виявили, що комітовані клітини-попередники можуть піддаватися перепрограмуванню з отриманням різних клітинних ліній. Наприклад, комітовані клітинипопередники можуть піддаватися ретродиференціації з отриманням ретродиференційованих клітин, наприклад, клітин, менш диференційованих, таких як плюріпотенційні (плюріпотентні) стовбурові клітини, і що ці ретродиференційовані клітини можуть бути введені хворому, щоб відновлювати або оновлювати тканини або клітини. Інший приклад, комітовані клітинипопередники, отримані від хворого, можуть піддаватися трансдиференціюванню з отриманням трансдиференційованих клітин, наприклад, клітин інших клітинних ліній, відмінних від комітованих клітин-попередників, і що ці трансдиференційовані клітини можуть бути введені хворому, щоб відновлювати або оновлювати тканини або клітини. Винахід охоплює метод відновлення або оновлення тканини або клітин клітинних ліній хворого введенням хворому перепрограмованих клітин. Зокрема, винахід охоплює метод відновлення або оновлення тканини або клітин клітинних ліній хворому, що передбачає (i) отримання комітованих клітин-попередників, (ii) ретродиференціацію комітованих клітинпопередників з отриманням ретродиференційованих клітин-мішеней і (iii) введення ретродиференційованих клітин-мішеней хворому, в якому ретродиференційовані клітини-мішені повторно передиференціюються в клітини клітинних ліній. Ці передиференційовані клітини можуть належати до тієї ж самої клітинної лінії або відмінної клітинної лінії, такої як комітовані клітини-попередники. Винахід також охоплює метод відновлення або оновлення тканини або клітин клітинної лінії хворого, який передбачає (i) отримання комітованих клітин-попередників, (ii) трансдиференціювання комітованих клітин-попередників, щоб отримати трансдиференційовані клітини-мішені, і (iii) введення трансдиференційованих клітин-мішеней хворому. У деяких варіантах реалізації хворий може страждати від хвороби, порушення або стану, включаючи, але не обмежуючись ними, розлад кісткового мозку, гематологічні стани, апластичну анемію, бета-таласемію, діабет, хворобу мотонейрону, хворобу Паркінсона, пошкодження спинного мозку, м'язову дистрофію, ниркову хворобу, розсіяний склероз, застійну серцеву недостатність, вірус гепатиту C, вірус імунодефіциту людини, травму голови, пошкодження спинного мозку, хворобу легень, депресію, необструктивну азооспермію, андропаузу, менопаузу і безпліддя, омолоджування, виразку склеродерми, псоріаз, зморшки, цироз печінки, аутоімунну хворобу, облисіння, пігментозний ретиніт, кристалічну дистрофію/сліпоту, діабет і безпліддя. Отже, в деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини можуть бути клітинами кісткового мозку, які лікують апластичну анемію, лейкемію, лімфому або вірус імунодефіциту людини хворого. У деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані клітини, трансдиференційовані клітини-мішені або передиференційовані клітини, можуть включати, але не обмежуються ними, плюрипотенційні стовбурові клітини, плюрипотенційні зародкові клітини, гематопоетичні стовбурові клітини, нейронні стовбурові клітини, епітеліальні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини, стовбурові клітини ендодерми і нейроектодерми, зародкові клітини, екстраембріональні, ембріональні стовбурові клітини, ниркові клітини, клітини альвеолярного епітелію, клітини ендодерми, нейрони, ектодермні клітини, острівцеві клітини, ацинарні клітини, овоцити, сперму, гематопоетичні клітини, гепатоцити, шкіру/кератиноцити, меланоцити, кістку/ остеоцити, волосся/клітини сосочків дерми, хрящ/хондроцити, жирові клітини/адипоцити, скелетні м'язові клітини, клітини ендотелію, серцевий м'яз/кардіоміоцити і тропобласти. У певних варіантах здійснення комітовані клітини-попередники отримують з крові або близьких тканин, включаючи кістковий мозок. Комітовані клітини-попередники можуть бути отримані з цілісної крові, і/або можуть бути отримані через аферезис. Кров може бути мобілізованою або немобілізованою кров'ю. Такі комітовані клітини-попередники включають, але не обмежуються ними, T-клітини, B-клітини, ацидофільні гранулоцити, базофіли, нейтрофіли, мегакаріоцити, моноцити, еритроцити, гранулоцити, мастоцити, лімфоцити, лейкоцити, тромбоцити і червоні клітини крові. Альтернативно, комітовані клітини-попередники можуть бути отримані з нейронної тканини центральної нервової системи або периферійної нервової системи, м'язової тканини або епідермісу і/або дерми шкіри. У певних варіантах здійснення комітовані клітини-попередники отримують з крові або тканини хворого. У деяких варіантах здійснення хворий, від якого отримують комітовані клітинипопередники, і якому вводять перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані клітини-мішені або трансдиференційовані клітини-мішені, є тим же самим хворим. У деяких варіантах здійснення комітовані клітини-попередники ретродиференціюють контактом комітованих клітин-попередників із засобом. Наприклад, комітовані клітини 2 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 попередники можуть бути культивовані із засобом (із агентом). У певних варіантах здійснення засіб зчіплюється з рецептором, який є посередником захоплення, упізнавання або представлення антигену на поверхні комітованих клітин. Рецептор може бути антигеном MHC класу I або антигеном MHC класу II. У деяких варіантах здійснення, антигеном класу I є рецептор HLA-A, рецептор HLA-B, рецептор HLA-C, рецептор HLA-E, рецептор HLA-F або рецептор HLA-G, а вказаним антигеном класу II є рецептор HLA-DM, рецептор HLA-DP, рецептор HLA-DQ або рецептор HLA-DR. У певних варіантах здійснення засіб може бути антитілом до рецептора, таким як моноклональне антитіло до рецептора. У деяких варіантах здійснення антитілом є моноклональне антитіло CR3/43 або моноклональне антитіло TAL 1B5. У подальших варіантах + здійснення засіб модулює експресію гена MHC, таку як експресія MHC класу I і/або MHC класу + II . У деяких варіантах здійснення ретродиференційовані клітини можуть піддаватися передиференціюванню в окремій стадії. Наприклад, ретродиференційовані клітини можуть бути передиференційованими контактом ретродиференційованих клітин з факторами росту, які включають, але не обмежуються ними, основний фактор росту фібробласта, епідермальний фактор росту, колонієстимулюючий фактор макрофага гранулоцита, фактор стовбурових клітин, інтерлейкіни-1-3, -6 і -7, основний фактор росту фібробласта, епідермальний фактор росту, колонієстимулюючий фактор макрофага гранулоцита, колонієстимулюючий фактор гранулоцита, еритропоетин, фактор стовбурових клітин, і морфогенетичні білки кісток. Утворені передиференційовані клітини-мішені потім можуть бути введені хворому. У варіантах здійснення винаходу комітовані клітини-попередники можуть бути трансдиференційованими культивуванням комітованих клітин-попередників за специфічних умов культивування. Наприклад, комітовані клітини можуть бути культивовані у специфічних типах культуральних середовищ у поєднанні із засобами ретродиференціювання. Приклади цих культуральних середовищ можуть включати середовище Іґла, модифіковане Дульбеко (DMEM), або середовище IMDM та інші. Культуральні середовища тканин можуть також включати засіб, який промотивує диференціювання, такий як вітаміни і/або мінеральні добавки, гідрокортизон, дексаметазон, бета-меркаптоетанол і так далі. Крім того, додаткові умови культивування включають хелатуючі агенти або антибіотики, культивування за певних температур або рівнях діоксиду вуглецю або кисню, і культивування в спеціальних посудинах. Умови культивування можуть визначати тип трансдиференційованих клітин-мішеней, які при цьому виникають. Одним аспектом винаходу є, таким чином, спосіб отримання клітин-мішеней. Спосіб може включати, отримання комітованих клітин-попередників і потім перепрограмування комітованих клітин. Ці способи описанів цій заявці. У деяких варіантах здійснення спосіб може включати ретродиференціацію комітованих клітин. У інших варіантах здійснення спосіб може включати трансдиференціювання комітованих клітин. У інших варіантах здійснення спосіб може включати ретродиференціацію комітованих клітин, і потім передиференціювання ретродиференційованих клітин. Іншим аспектом винаходу є використання одних або більше перепрограмованих клітинмішеней для отримання лікарського засобу для відновлення або оновлення тканин або клітин клітинних ліній хворого, або для лікування хвороби або пошкодження тканини. Ще, іншим аспектом винаходу є спосіб лікування хвороби або пошкодження тканини хворого, який цього потребує. У певних варіантах здійснення спосіб передбачає отримання комітованих клітин-попередників, перепрограмування комітованих клітин, щоб отримати перепрограмовані клітини-мішені, і введення перепрограмованих клітин-мішеней хворому. У деяких варіантах здійснення клітини-мішені можуть бути перепрограмовані шляхом ретродиференціювання, трансдиференціювання і/або передиференціювання. У певних варіантах здійснення клітинами-мішенями є ретродиференційовані клітини-мішені, трансдиференційовані клітини-мішені і/або передиференційовані клітини-мішені. Способи отримання комітованих клітин-попередників і перепрограмування комітованих клітин є такими, як описані в цій заявці. У деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані клітини-мішені, трансдиференційовані клітини-мішені або передиференційовані клітини-мішені можуть бути введені шляхом ін'єкції, імплантації або інфузії. Ці клітини можуть бути введені парентеральною, внутрішньом'язовою, внутрішньовенною, підшкірною, внутрішньоочною, пероральною, трансдермальною ін'єкцією, або ін'єкцією в спинну рідину. У певних варіантах здійснення ретродиференційовані клітинимішені або трансдиференційовані клітини-мішені вводять у фармацевтичну композицію. Фармацевтична композиція може включати ретродиференційовані клітини-мішені або 3 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансдиференційовані клітини-мішені і, щонайменше, один фармацевтично прийнятний ексципієнт. Одним аспектом винаходу є фармацевтична композиція для введення перепрограмованих клітин-мішеней, таких як ретродиференційовані клітини-мішені або трансдиференційовані клітини-мішені. Фармацевтична композиція може включати один або більше типів клітинмішеней і, щонайменше, один фармацевтично прийнятний носій. Необов'язково, фармацевтична композиція може включати допоміжні засоби і/або інші ексципієнти, придатні для введення хворому. Іншим варіантом винаходу є спосіб отримання фармацевтичної композиції або лікарського засобу, який передбачає (i) отримання комітованих клітин-попередників, (ii) перепрограмування комітованих клітин, щоб отримувати перепрограмовані клітини-мішені, і (iii) необов'язково, комбінування перепрограмованих клітин-мішеней з одним або більше фармацевтичним ексципієнтом. У деяких варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені комбінують з одним або більше фармацевтичними ексципієнтами. У інших варіантах здійснення перепрограмовані клітини-мішені не комбінують з одним або більше фармацевтичними ексципієнтами. Способи отримання комітованих клітин-попередників і перепрограмування комітованих клітин описані в цій заявці. Необхідно мати на увазі, що в цьому описі і, особливо, у формулі винаходу терміни, такі як "містить", "який містить" тощо, можуть мати значення, яке визначене для них в американському Патентному праві; наприклад, вони можуть мати на увазі, "включає", "який включає" тощо; і що терміни, такі як "який, власне складається з" і "складається, власне з" мають значення, яке визначене для них в американському Патентному праві, наприклад, що вони враховують елементи, не описані явно, але виключають елементи, які знайдені в попередньому рівні техніки, або які впливають на основну або нову характеристику винаходу. Ці та інші варіанти здійснення розкриті або є очевидними і охоплені наступним докладним описом. Короткий опис креслень Наступний докладний опис приведений як приклад, але не покликаний обмежувати винахід виключно конкретними описаними варіантами здійснення, і може бути краще всього зрозумілим у поєднанні з наведеними кресленнями, на яких: Фіг. 1 показує імунофенотипування аферезованих одноядерних клітин до і після (нижня панель) початку перепрограмування. Клітини маркірували моноклональними антитілами, зв'язаними з R-фікоеритрином (RPE) Cy-5 або фікоеритринами (PE) (вертикальні позначення) для ізотипного контролю імуноглобуліну G1 (IgGl) і CD34 або CD19, відповідно. Клітини були також пофарбовані для ізотипових контролів CD45, CD38, CD61 і IgGl моноклональних антитіл, зв'язаних з ізотіоціанатом флуоресцеїну (FITC) (горизонтальні позначення). Нижня панель показує збільшення гематопоетичних стовбурових клітин, як показано збільшенням відносного числа CD34 і CD34CD38-клітин, яке супроводжується зменшенням зрілих маркерів лейкоцитів, таких як CD45 і CD19; Фіг. 2A показує послідовне імунофенотипування зразків периферійної крові хворого з серйозною апластичною анемією, за яким слідує інфузія аутологічних HRSC (після 1 дня, 2 дня, 3 дня, 6 дня і 14 дня). Клітини маркували моноклональними антитілами проти CD34 і CD45 (2-а горизонтальна панель), і CD34 і CD38 (3-я горизонтальна панель). Верхня горизонтальна панель показує, що переднє і бічне розсіювання є цитометрією потоку, мазком кісткового мозку, і перетином tehphin аутологічних HRSC. 1 день - 14 день демонструють збільшення клітин, які мають велике переднє і бічне розсіювання, яке указує на гранулоцити, і 1 день - 3 день демонструють збільшення відносного числа циркулюючих CD34 гематопоетичних стовбурових клітин. Фіг. 2b показує послідовне імунофенотипування зразків периферійної крові хворого на важку форму апластичної анемії, за яким слідує інфузія аутологічних перепрограмованих стовбурових клітин людини (HRSC) (після день 1, день 2, день 3, день 6 і день 14). Клітини маркірували моноклональними антитілами проти CD34 і CD61 (1-а горизонтальна панель), CD19 і CD3 (2-а панель), і CD33&13 і CD7 (3-я горизонтальна панель). Графік FACScan показує збільшення числа мієлоїдних клітин, як показано поступовим збільшенням клітин, які експресують CD33&, включаючи клітини-попередники, яке показане поступовим збільшенням відносного числа клітин, які спів-експресують CD33&13 з CD7. Крім того, було поступове збільшення відносного числа лімфоцитів, як показано збільшенням відносного числа лімфоцитів CD19 і CD3; Фіг. 3 показує аналіз кісткового мозку хворого на важку апластичну анемію до і після інфузії аутологічних HRSC. Мазок кісткового мозку до і після терапії (а і b) показує збільшення червоних кров'яних клітин; перетин terphine до і після терапії (с і d) показує збільшення насиченості 4 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинами кісткового мозку; клоновий аналіз кісткового мозку, за яким слідує інфузія HRSC, показує збільшення росту колонієутворюючої одиниці мегакаріоциту (e); колонієутворюючих моноцитів (f); колонієутворюючих гранулоцитів-макрофагів (g); і колонієутворюючих мієлоцитіверитроїдів (h); і вибухоутворюючих еритроїдів (i); Фіг. 4 показує каріотипування і G-діапазон зразка периферійної крові хворого на важку апластичну анемію, за якими слідує 4 роки інфузії аутологічних HRSC, що демонструють відсутність генетичних аномалій; Фіг. 5 показує збільшення абсолютних середніх рівнів фетального гемоглобіну у хворих на таласемію з подальшим лікуванням аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 6 показує збільшення середнього показника гематокриту, який є середнім розміром червоних кров'яних клітин (еритроцитів), представленим у фемтолітрах, у хворих на таласемію з подальшим лікуванням аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 7 показує збільшення середньоклітинного гемоглобіну, який є вагою гемоглобіну на клітину, представленою в пікограмах, у хворих на таласемію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 8 показує зменшення рівня сироваткового феритину, представленого в нанограмах на мілілітр, у хворих на таласемію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 9 показує збільшення рівнів C-пептиду натщесерце і після засвоєння змішаної борошняної їжі у хворих на діабет після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 10 показує зменшення рівнів глікозильованого гемоглобіну (HbAlC) у хворих на діабет після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 11 показує зменшення рівнів креатинфосфокінази (CPK) і лактатдегідрогенази (LDH) у хворих на м'язову дистрофію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 12 показує зменшення рівнів ферментів печінки, аланінамінотрансферази (ALT) і аспартатамінотрансферази (AST), у хворих на м'язову дистрофію після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 13 показує зменшення рівнів мікроальбумін-сечовини у 12 хворих з хворобою нирок після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 14 показує зменшення рівнів глікозильованого гемоглобіну (HbAlC) у 12 хворих з хворобою нирок внаслідок діабету після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами; Фіг. 15а показує сканограми зображень магнітного резонансу (MRI) мозку хворого на розсіяний склероз до (ліва сканограма) і через три місяці після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами і демонструє зменшення посилення стану пошкодження після терапії стовбуровими клітинами; Фіг. 15b показує сканограми MRI різних ділянок мозку хворого до (ліва сканограма) і через три місяці після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. На сканограмах, які зображають стан до обробки, стрілки указують пошкодження в мозку, тоді як в сканограмах, зроблених після обробки, стрілки демонструють зменшення пошкоджень; Фіг. 16a показує сканограму зображень магнітного резонансу (MRI) мозку хворого на розсіяний склероз до (верхні сканограми) і через шість місяців після (нижні сканограми) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. Фіг. 16b показує додаткові сканограми MRI мозку хворого до (верхні сканограми) і через шість місяців після (нижні сканограми) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. У сканограмах, які демонструють стан до лікування, стрілки указують пошкодження в мозку, тоді як в сканограмах, які демонструють стан після лікування, стрілки указують на зменшення пошкодження із зниженням атрофії мозку, як показано зменшенням шлуночку і розширенням звивини; Фіг. 17а показує сканограми зображень сагітального магнітного резонансу хворого на розсіяний склероз до (ліва сканограма) і через шість місяців після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. Фіг. 17b показує поперечні MRI сканограми спинного мозку хворого до (ліва сканограма) і через шість місяців після (права сканограма) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. У сканограмах, які демонструють стан до лікування, стрілки указують пошкодження спинного мозку, тоді як в сканограмах, які демонструють стан після лікування, стрілки указують зменшення пошкодження; Фіг. 18а показує зменшення рівнів ферменту печінки аланінамінотрансферази (ALT), а Фіг. 18b показує зменшення рівнів аспартаттрансферази (AST) у хворих, заражених гепатитом C з подальшим лікуванням аутологічними перепрограмованими клітинами; 5 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 19а показує сканограми зображень магнітного резонансу (MRI) мозку хворого з травмою голови унаслідок автомобільної аварії. До лікування (верхні сканограми), шлуночки демонструють розширення і зсув з широкою, гострою гематомою. Після лікування аутологічними перепрограмованими клітинами (нижні сканограми) шлуночки демонструють зменшення параметрів атрофії мозку, таке як зменшення шлуночку і розширення звивини зі зменшенням гематоми. Фіг. 19b показує додаткові сканограми MRI мозку хворого до і після (нижні сканограми) лікування; Фіг. 20 показує рентгенівський знімок хворого на хворобу легенів до і після (правий знімок) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. Після лікування хворого показано поліпшення об'єму легень і зменшення розміру пошкодження, як показує зменшення областей гіпо-щільності; Фіг. 21 показує рівні статевого гормону - фолікулостимулюючого гормону (fsh), лютеїнізуючого гормону (lh), прогестерону (pro) і тестостерону (test) у хворих із закупорюючою азооспермією, підданих лікуванню аутологічними перепрограмованими клітинами. Рівні демонструють значне збільшення вільного тестостерону паралельно із збільшенням розміру яєчка (дані не показані), визначені ультразвуком; Фіг. 22 показує чутливість сітківки і втрату зору у хворого, який страждає від ослабленого зору до і після (нижня панель) лікування аутологічними перепрограмованими клітинами. З даних про чутливість сітківки витікає, що оранжева область указує на знижену чутливість сітківки. Із даних про погіршення зору витікає, що білі області указують на нормальний зір, а рожева, оранжева і чорна області указують на підвищену втрату зору. Після лікування хворий відчув поліпшення свого поля зору, оскільки оранжеві області за результатами щодо чутливості сітківки до лікування ставали зеленими і білими після лікування, а чорні області при втраті зору до лікування ставали білими після лікування. Здійснення винаходу Визначення Термін "комітовані клітини-попередники", як він використовується тут, позначає клітини, які демонструють диференційований характер. Ці клітини часто вважають зрілими і спеціалізованими. Приклади включають білі клітини крові, червоні клітини крові, клітини епітелію, нейрони і хондроцити. Термін "некомітовані клітини", як він використовувався тут позначає клітини, які не демонструють зрілого диференційований характер. Ці клітини часто вважають незрілими і неспеціалізованими. Прикладом некомітованої клітини-попередниці є стовбурова клітина, яка є незрілою клітиною, яка здатна до самовідновлення (ділення без обмежень) і диференціації (спеціалізації). Термін "перепрограмування", як він використовується тут, відноситься до процесу, в якому комітована клітина першої лінії диференціювання перетворюється на клітину іншого клітинного типу. Цей інший тип клітини може мати іншу лінію клітинного диференціювання. Перепрограмування може відбуватися через такі процеси як ретродиференціювання, трансдиференціювання, передиференціювання. Термін "перепрограмована клітина", як він використовується тут, позначає клітину, яка є комітованою клітиною, яка зазнала перепрограмування. Перепрограмовані клітини можуть включати ретродиференційовані клітини, трансдиференційовані клітини і/або передиференційовані клітини. Термін "ретродиференціювання", як він використовується тут, позначає процес, внаслідок якого, комітована, тобто, зріла, спеціалізована клітина, реверсує назад, до стану примітивнішої стадії клітин. "Ретродиференційована клітина" є клітиною, яка утворюється внаслідок ретродиференціювання комітованої клітини. Термін "трансдиференціювання", як він використовується тут, позначає процес, внаслідок якого, комітована клітина першої лінії диференціювання перетворюється на іншу клітину, іншого клітинного типу. У деяких варіантах здійснення трансдиференціювання може бути комбінацією ретродиференціювання і передиференціювання. "Трансдиференційована клітина" є клітиною, яка утворюється з трансдиференційованої комітованої клітини. Наприклад, комітована клітина, така як клітина цілісної крові може бути трансдиференційованою в нейрон. Термін "передиференціювання", як він використовується тут, відноситься до процесу, при якому некомітована клітина або ретродиференційована клітина диференціюється в більш зрілу, спеціалізовану клітину. Термін "передиференційована клітина" відноситься до клітини, отриманої з передиференційованої некомітованої клітини або ретродиференційованої клітини. Якщо передиференційовану клітину отримують в результаті передиференціювання ретродиференційованої клітини, передиференційована клітина може мати ту ж саму або іншу 6 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лінію диференціювання, що і комітована клітина, яка зазнала ретродиференціювання. Наприклад, комітована клітина, така як біла клітина крові, може бути ретродиференційованою з отриманням ретродиференційованої клітини, такої як плюрипотенційна стовбурова клітина, а потім ретродиференційована клітина може бути передиференційованою з отриманням лімфоцита тієї ж самої клітинної лінії, що і біла клітина крові (комітована клітина), або передиференційованою з отриманням нейрона, який має іншу лінію диференціювання, ніж біла клітина крові (комітована клітина). Термін "клітина-мішень", як він використовується тут, позначає клітину, яку отримують для введення хворому, з метою відновлення або оновлення тканини або клітин. Наприклад, клітинамішень може бути перепрограмованою клітиною-мішенню, такою як ретродиференційована клітина-мішень або трансдиференційованою клітиною-мішенню, таким чином, ретродиференційовані або трансдиференційовані клітини-мішені вводять хворому. Комітовані клітини Як описано вище, комітовані клітини запропоновані даним винаходом є клітинами, які демонструють диференційований характер. Комітована клітина може включати будь-які компоненти, які стосуються індикації антигену, захоплення або розпізнавання. Наприклад, + + комітована клітина може бути клітиною MHC класу I і/або MHC класу II . Комітована клітина може також бути будь-якою клітиною, отриманою або яку отримують, з недиференційованої клітини. Таким чином, в одному варіанті здійснення, некомітована клітина є також недиференційованою клітиною. Як приклад, комітована клітина може бути лімфоїдною стовбуровою клітиною або мієлоїдною стовбуровою клітиною, яку диференціюють відносно плюрипотенційної стовбурової клітини. Комітовані клітини можуть бути отримані з біологічного матеріалу, такого як кров або близькі тканини, включаючи кістковий мозок або пуповинну кров, нейронну тканину з центральної нервової системи або периферійної нервової системи, м'язову тканину, або епідерміс і/або тканину шкіри (тобто, наприклад, зіскрібок з ротової порожнини). Біологічний матеріал може мати післяродове походження. Біологічний матеріал може бути отриманий, використовуючи способи, відомі в технології, які відповідають типу тканини. Приклади включають, але не обмежуються такими, як вирізання, вилучення голкою, мазок і аферезис. У певних варіантах здійснення комітовані клітини отримують з цілісної крові або перероблених продуктів крові, таких як плазма або світлий шар кров'яного згустку, оскільки їх видалення з суб'єктів може бути виконане під мінімальним медичним контролі. Зразки крові зазвичай обробляють антикоагулянтами, такими як гепарин або цитрат. Клітини біологічного зразка можуть бути оброблені, щоб збагатити певні типи клітин, видалити певні типи клітин або відокремити клітини від маси тканини. Придатними способами очищення і відділення клітин є центрифугування (таке як центрифугування з градієнтом щільності), цитометрія потоку і афінна хроматографія (така як використання магнітних гранул, які включають моноклональні антитіла до маркерів поверхні клітин або пенінг) (див. Vettese-Dadey, The Scientist 1999, 13: 21). Наприклад, розділення в градієнті фікол-гіпак є придатним для видалення еритроцитів і гранулоцитів, щоб залишити одноядерні клітини, такі як лімфоцити і моноцити. Приклади комітованих клітин, які можуть бути отримані з крові, включають, але не обмежуються такими, як клітини CFC-T, клітини CFC-B, клітини CFC-еозин, клітини CFC-Bas, клітини CFC-Bas, клітини CFC-GM, CFC-M, клітини CFC-MEG, клітини BFC-E, клітини CFC-E, Tклітини, B-клітини, еозинофіли, гранулоцити, базофіли, нейтрофіли, моноцити, мегакаріоцити і еритроцити. Отримані комітовані клітини крові можуть бути ідентифіковані за експресією певних + + + + антигенів. Наприклад, B-клітинами є клітини CD19 , CD21 , CD22 і DR . T-клітинами є клітини + + + + + + CD2 , CD3 , і або CD4 , або CD8 . Незрілими лімфоцитами є клітини CD4 і CD8 . Активованими + + + Т-клітинами є клітини DR . Природними клітинами-кілерами (NK) є клітини CD56 і CD16 . Т+ + + лімфоцитами є клітини CD7 . Лейкоцитами є клітини CD45 . Гранулоцитами є клітини CD13 і + + + CD33 . Клітинами макрофага моноцита є клітини CD14 і DR . У певних варіантах здійснення комітована клітина може бути В-лімфоцитом (активованим або неактивованим), Т-лімфоцитом (активованим або неактивованим), клітиною з клітинної лінії моноцита макрофага, ядровмісною клітиною, яка здатна експресувати антигени класу I або класу II, клітиною, яка може стимулювати експресію антигенів класу I або класу II або енуклейованою клітиною (тобто, клітиною, яка не містить ядра, такою як червона кров'яна клітина). У альтернативних варіантах здійснення комітована клітина може бути вибрана із будь-якої групи клітин, яка включає великі гранулярні лімфоцити, нуль-лімфоцити і природні клітиникілери, кожна з яких здатна експресувати поверхневі рецептори клітин CD56 і/або CD16. 7 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Оскільки комітовані клітини є власне первинними культурами, може бути необхідним доповнити популяції клітин відповідними поживними речовинами, щоб підтримати життєздатність. Відповідні умови культивування відомі фахівцеві з технології. Проте, обробку популяції клітин бажано ініціюють якнайскоріше після видалення біологічних зразків від хворих, зазвичай протягом 12 годин, бажано протягом 2-4 годин. Життєздатність клітини може бути перевірена, використовуючи відомі методики, такі як виключення трипанового синього або пропідійодид. Ретродиференційовані клітини Ретродиференціювання є типом способу перепрограмування, за допомогою якого структури і функції клітин прогресивно змінюються, щоб дати початок менш спеціалізованим клітинам. Ретродиференціювання може відбуватися природно, причому клітини можуть піддаватися обмеженому зворотному диференціюванню in vivo у відповідь на пошкодження тканини. Альтернативно, ретродиференціювання може бути викликане, використовуючи способи, описані в заявці US 08/594,164, зараз патент US 6 090 625; заявка US 09/742,520, зараз патент US 7 112 440; заявка US 10/140,978, зараз патент US 7 220 412; заявка US 10/150,789, зараз патент US 7 410 773; і заявка US No. 09/853,188, які всі включені тут як посилання. Ретродиференційовані клітини відповідно до винаходу можуть включати, але не обмежуватися ними, плюрипотенційні стовбурові клітини, лімфоїдні стовбурові клітини, мієлоїдні стовбурові клітини, невральні стовбурові клітини, клітини сателітів скелетного м'яза, епітеліальні стовбурові клітини, ендодермальні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини і ембріональні стовбурові клітини. У певних варіантах здійснення комітовані клітини отримують з крові і ретродиференціюють з отриманням ретродиференційованих клітин гематопоетичної клітинної лінії. Приклади цих ретродиференційованих клітин включають, але не обмежуються такими, як плюрипотенційні стовбурові клітини, лімфоїдні стовбурові клітини і мієлоїдні стовбурові клітини. Комітовані клітини можуть бути ретродиференційованими контактом клітин із засобом, який реально стикається з клітинами. Клітини потім культивують, щоб дозволити цим клітинам, які реально стикалися із засобом, розвиватися через процес ретродиференціації і, кінець кінцем, ставати недиференційованими. Стадія контактування може включити засіб зчеплення з поверхневими антигенами на комітованих клітинах. Засіб може діяти в прямому зчепленні або в непрямому зчепленні з комітованої клітиною. Прикладом прямого зчеплення є те, що комітована клітина має, щонайменше, один поверхневий рецептор клітини на її поверхні, такий як β-ланцюг, який має гомологічні області (області, які зазвичай мають ту ж саму або подібну послідовність), таку як послідовності, які можуть бути знайдені на В-клітинах, і в якому засіб прямо зачіпає поверхневий рецептор клітини. Іншим прикладом є те, що комітована клітина має поверхневий рецептор клітини на її клітинній поверхні, такий як α-ланцюг, який має гомологічні області, такі як області, які можуть бути знайдені на Т-клітинах, і в якому засіб прямо зачіпає поверхневий рецептор клітини. Прикладом непрямого зчеплення є те, що комітована клітина має, щонайменше, два поверхневих рецептори клітини на її клітинній поверхні і зчеплення засобу з одним з рецепторів впливає на інший рецептор, який потім викликає ретродиференціювання комітованої клітини. Засіб для ретродиференціювання комітованої клітини може бути хімічною сполукою або композицією. Наприклад, засіб може бути здатний до зчеплення поверхневого рецептора клітини на поверхні комітованої клітини. У певних варіантах здійснення засіб реально зачіпає рецептор, присутній на поверхні комітованої клітини --- цей рецептор може бути експресований комітованою клітиною. Наприклад, засоби можуть включати, але не обмежуватися такими, як будь-який один або більше циклічний аденозинмонофосфат (cAMP), молекулу CD4, молекулу CD8, частину або весь рецептор T-клітини, ліганд (закріплений або вільний), пептид, рецептор T-клітини (TCR), антитіло, перехресно-реагуюче антитіло, моноклональне антитіло або поліклональне антитіло. Можуть також використовуватися Фактори росту такі як гематопоетичні фактори росту, наприклад, еритропоетин і гранулоцит-моноцит колонієстимулюючий фактор (GM-CSF). Якщо засіб є антитілом, перехресно-реагуючим антитілом, моноклональним антитілом або поліклональним антитілом, то засіб може бути одним або більше з поміж засобів, таких як антитіло, перехресно-реагуюче антитіло, моноклональне антитіло або поліклональне антитіло з поміж будь-яких одного або більше: бета-ланцюга антигену MHC класу II, бета-ланцюга антигену MHC HLA-DR, α-ланцюга антигену MHC класу I або класу II, α-ланцюга антигену HLADR, α - і β-ланцюга антигену MHC класу II або антигену MHC класу I. Прикладом антитіла є CR3/43 (поставляється Деко (Dako)). 8 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "антитіло" може включати різні фрагменти (чи отримані вони протеолітичним розщепленням або за допомогою рекомбінантної технології) і похідні, які зберігають активність щодо зв'язування, такі як антитіла Fab, F(ab')2 і scFv, а також їх міметики або біоізостери. Антитіла також включають генно-інженерні варіанти, в яких деякі з послідовностей амінокислот були змінені, наприклад, заміною амінокислотних залишків, щоб підсилити зчеплення, або, в яких антитіла були отримані в різних видів бажаних для організму клітин, щоб лікувати відповідно до методів запропонованих винаходом, щоб зменшити ймовірність несприятливих імунних реакцій (прикладом цього є гуманізовані мишачі моноклональні антитіла). Засоби, які використовуються, щоб викликати перетворення комітованої клітини на ретродиференційовану клітину бажано можуть діяти позаклітинно відносно комітованої клітини. Наприклад, комітована клітина може включати рецептор, який реально зчіпляється із засобом, і засіб реально зчіпляється із рецептором. Наприклад, рецептор може бути поверхневим рецептором клітини. Конкретні приклади поверхневих рецепторів клітини включають, але не обмежуються такими як, рецептори MHC класу I і MHC класу II. Рецептор може включати α-компонент і/або β-компонент, як має місце для рецепторів MHC класу I і MHC класу II. Рецептор може включати β-ланцюг, який має гомологічні області, наприклад, щонайменше, області гомологічні до β-ланцюга HLA-DR. Альтернативно, або крім того, рецептор може включати α-ланцюг, який має гомологічні області, наприклад, щонайменше, гомологічні області до α-ланцюга HLA-DR. Рецептор може бути антигеном класу I або класу II головного комплексу тканинної сумісності (MHC). У певних варіантах здійснення поверхневий рецептор клітини може включати, але не обмежуватися ними, рецептор HLA-DR, рецептор DM, рецептор DP, рецептор DQ, рецептор HLA-A, рецептор HLA-B, рецептор HLA-C, рецептор HLA-E, рецептор HLA-F, або рецептор HLA-G. У деяких варіантах здійснення поверхневий рецептор клітини може бути рецептором HLA-DR. Засіб може бути антитілом до рецептора, таким як моноклональне антитіло до рецептора. Прикладом засобу може бути засіб, який модулює експресію гена MHC, таку як експресія MHC класу I+ і/або MHC класу II+. У певних варіантах здійснення засіб може використовуватися у поєднанні з модифікатором біологічної реакції. Приклади модифікаторів біологічної реакції включають, але не обмежуються такими як, алкілюючий засіб, імуномодулятор, фактор росту, цитокін, поверхневий рецептор клітини, гормон, нуклеїнову кислоту, послідовність нуклеотидів, антиген або пептид. Наприклад, алкілюючий засіб може бути або може включати циклофосфоамід. Інші модифікатори біологічної реакції можуть включати сполуки, здатні до стимулюючої регуляції експресії антигена MHC класу I і/або класу II, яка, в деяких варіантах здійснення, може дозволити засобу, який зв'язується з рецептором MHC, працювати ефективніше. Оскільки будь-який тип клітини може бути отриманий, щоб експресувати антигени MHC класу I і/або класу II, то це може забезпечити метод ретродиференціювання різних типів клітин, які або експресують в основному, антигени MHC класу I і/або класу II або ні. Комітовані клітини зазвичай культивують із засобом протягом, щонайменше, двох годин, звичайно від 2 до 24 годин, бажано від 2 до 12 годин. Культивування зазвичай виконують за температури від приблизно кімнатної або, наприклад, приблизно 22 °C, до приблизно 37 °C, включаючи 33 °C. Перебіг процедури ретродиференціювання може бути перевірений періодично видаленням малої аліквоти зразка і дослідженням клітин, використовуючи мікроскопію і/або цитометрію потоку. Альтернативно, пристрій може включити засоби стеження он-лайн моніторингу перебігу процедури ретродиференціювання. На додачу до використання ретродиференціюючих засобів комітовані клітини можуть бути культивовані в аутологічній плазмі або сироватці, або в ембріональній сироватці крові або сироватці коня. Необов'язково, комітовані клітини можуть бути культивовані з антикоагулянтами, хелатуючими засобами або антибіотиками. Діапазон температур для культивування клітин може бути розширений до 18-40 °C, і може також включати 4-10 % СО2 і/або 10-35 % О2. Крім того, культивування може відбуватися в мішках для крові, мішках розведення тканини, або пластмасових посудинах, як покритих, так і непокритих. Певні типи ретродиференційованих клітин можуть бути отримані ретродиференціюванням, застосовуючи певні умови культивування. Наприклад, комітовані клітини можуть бути ретродиференційованими в плюрипотенційні клітини культивуванням комітованих клітин в середовищі Іґла, модифікованому Дульбекко (DMEM), неістотних амінокислот (NEAA), Lглютаміну (L-glu) і β-меркаптоетанолу (2 β-MЕ), у поєднанні з ретродиференціюючими засобами. Комітовані клітини можуть також бути спочатку піддані дії хелатуючих засобів. Як інший приклад, щоб отримати мезенхімні клітини, комітовані клітини можуть бути 9 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культивовані - у поєднанні з ретродиференціюючим засобом (засобами) - використовуючи DMEM (низька глюкоза) і L-glu, або DMEM (низька глюкоза), L-glu, 2 β-MЕ і NEAA. Далі, антибіотик гентаміцин може також використовуватися при культивуванні клітин. Трансдиференційовані клітини Трансдиференційовані клітини отримують культивуванням комітованих клітин з середовищем культивування тканини у поєднанні з ретродиференціюючими засобами. Комітовані клітини, таким чином, піддаються трансдиференціюванню, при якому комітовані клітини перетворюються на клітини іншого клітинного типу; у деяких варіантах здійснення комітовані клітини перетворяться на клітини іншої лінії диференціювання. Тип клітини-мішені, отриманий трансдиференціюванням, залежить від умов культивування. Ці умови змінюються відповідно до типу культурального середовища тканини, присутності/відсутності різних засобів, промотивуючих диференціювання, присутності/відсутності різних сироваток, температури культивування, присутності/ відсутності кисню або діоксиду вуглецю, і типу ємкості або посудини, які використовуються для культивування. Приклади культурального середовища тканини, яке використовується для трансдиференціювання, включають, але не обмежуються такими як, середовище IMDM, середовище DMEM, мінімальне необхідне середовище Іґла (EME), α-MEM, RPMI, де середовище було розроблене), 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, Leibovitz L-15, середовище E Вільямса, або будь-яке комерційно складене культуральне середовище тканини. Засоби, які промотивують диференціювання, включають антикоагулянти, хелатуючі засоби і антибіотики. Прикладами таких засобів можуть бути один або більше з поміж наступних: вітаміни і мінерали або їх похідні, такі як А, B3, C (аскорбат), аскорбат-2-фосфат, D2, D3, K, ретиноєва кислота, нікотинамід, цинк або сполуки цинку, і кальцій або сполуки кальцію; природні або синтетичні гормони, такі як гідрокортизон і дексаметазон; амінокислоти або їх похідні, такі як L-глутамін (L-glu), етиленглікольтетраоцтова кислота (EGTA), пролін і неістотні амінокислоти (NEAA); сполуки або їх похідні, такі як β-меркаптоеталь, дибутил циклічний аденозинмонофосфат (db-cAMP), монотіогліцерин (MTG), путресцин, диметилсульфоксид (DMSO), гіпоксантин, аденін, форсколін, силостамід і 3-ізобутил-1-метилксантин; нуклеозиди та їх аналоги, такі як 5-азацитидин; кислоти або їх солі, такі як аскорбінова кислота, піруват, щавлева кислота, лінолева кислота, етилендиамінтетраоцетова кислота (EDTA), антикоагулянт цитратдекстроза формули А, динатрій EDTA, бутират натрію, і гліцерофосфат; антибіотики або лікарські засоби, такі як G418, гентаміцин, Пентоксифілін (1-(5-оксогексил)-3,7-диметилксантин) та індометацин і білки, такі як активатор плазміногену тканини (TPA). Ці засоби, які промотивують диференціювання, можуть використовуватися, щоб отримати певні типи клітин-мішеней. Наприклад, вітамін B3 може використовуватися, щоб отримати ацинарні клітини, такі як острівцеві клітини, або гідрокортизон; дексаметазон може використовуватися, щоб отримати клітини мезенхімної природи або епітеліальної природи (наприклад, ниркові епітеліальні клітини, шкіру і близькі структури, такі як клітини шкірного сосочка); і β-меркаптоеталь може використовуватися, щоб привести до ектодермальних клітин, таких як нейронні клітини, включаючи антиген-представляючі клітини ЦНС. Культуральне середовище може містити аутологічну плазму; тромбоцити; сироватку, таку як збір крові плоду; або сироватки, отриманої від ссавців, такої як сироватка коня. Крім того, конверсійний процес може відбуватися усередині мішка з кров'ю, основи, мішка з культурою тканин або пластмасової посудини з культурою тканин. Посудини з культурою тканин можуть бути прикріпленими або неприкріпленими посудинами з культурою тканини, або можуть бути покриті або непокриті засобами, такими як желатин, колаген, матригелі або позаклітинні матриці, які підтримують прикріплення або плавучість залежно від заданого типу тканини або певних клітин, які треба отримати. Додаткові умови культивування включають температуру, яка може бути від приблизно 10 до приблизно 60 °C, або від приблизно 18 до приблизно 40 °C; рівень діоксиду вуглецю (CO2), який може бути від приблизно 0 до приблизно 20 %, або від приблизно 4 до приблизно 10 %; і кисень (О2), який може бути від приблизно 0 до приблизно 50 %, або від приблизно 10 до приблизно 35 %. Приклади способів отримання клітин-мішеней, які використовуються у поєднанні з ретродиференціюючими засобами обговорюються в таблиці 1. 10 UA 109265 C2 Таблиця 1 Способи отримання різних типів клітин-мішеней в комбінації з ретродиференціюючими засобами Тип клітин-мішеней Плюрипотенційні стовбурові клітини або гетерогенна популяція плюрипотенційних клітин-попередників Мезенхімні стовбурові клітини *Плюрипотенційні зародкові клітини *Овоцити *Сперматозоїди Нирка Умови культивування які використовуються в комбінації з ретродиференціюючими засобами Додаткові умови культивування *Попередня дія на комітовані клітини хелатуючих засобів і антикоагулянтів. *Для клітин-попередників видалення ретродиференціюючих засобів розбавленням тільки культуральним середовищем * DMEM, NEAA, L-glu 2β-ME * DMEM (низька глюкоза) L-glu; або * DMEM (низька глюкоза) * Гентаміцин L-glu, 2β-ME, NEAA GAIC *культивування може бути при *RPMI 1640, необов'язково з NEAA, приблизно 30-32 °C для L-glu, 2β-ME сперматозоїдів і приблизно 38для овоцитів, або 39 °C для овоцитів. * середовище EME, ретинол, L-glu * клітини можуть бути піддані дії піруват натрію хелатуючих засобів лактат натрію, NEAA таких як EDTA і EGT для овоцитів; або перед ретродиференціюванням і * DMEM, Hams F12 передиференціюванням. вітамін С, вітамін Е * Для сперматозоїдів ретиноєва кислота, ретинол можна включити піруват, необов'язково з додавання окадової Пентоксифіліном для кислоти, DMSO і цинку сперматозоїдів; або або сполуки цинку; *Умови культивування Гамета 100 може бути для плюрипотенційних використана як базальне стовбурових клітин середовища замість перерахованих вище, і з * Для овоцитів, можна додатковою умовою включати додавання культивування приведеній в dp-cAMP, динатрій EDTA, наступній колонці для форсколіну, силостаміду і сперматозоїдів гіпоксантину або овоцитів. *Для овоцитів, середовище 199 може бути використане як базальне середовище замість * DMEM, Hams F12, і гідрокортизон необов'язково з вітаміном К; або *Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перерахованих вище, з гідрокортизоном 11 UA 109265 C2 Продовження таблиці 1 Способи отримання різних типів клітин-мішеней в комбінації з ретродиференціюючими засобами Умови культивування які використовуються в комбінації з Додаткові умови культивування ретродиференціюючими засобами * DMEM, NEAA, L-glu необов'язково з 2β-ME нікотинамід, або *Умови культивування для плюрипотенційних * З антибіотиком G418 і * Альвеолярний епітелій стовбурових клітин судини культивування * Ендодерма перераховані вище, з тканини покриті матригелем. нікотинамідом необов'язково з дексаметазоном, ретиноєвою кислотою, db-cAMP; або * IMDM, L-glu, аскорбінова кислота, MTG * DMEM з Hams F12, NEAA 2β-ME, необов'язково з путресцином, ретиноєвою кислотою, L-glu гідрокортизоном аскорбатом; або * Нейрон *Умови культивування * Ектодерма для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище необов'язково з путресцином, ретиноєвою кислотою гідрокортизоном, аскорбатом *DMEM, Hams F12 вітамін В3; або * RPMI 1640 з вітаміном В3; або *Умови культивування Острівкові клітини для плюрипотенційних Ацинарні клітини стовбурових клітин перераховані вище, з вітаміном В3 (нікотинамід), необов'язково з дексаметазоном Тип клітин-мішеней 12 UA 109265 C2 Продовження таблиці 1 Способи отримання різних типів клітин-мішеней в комбінації з ретродиференціюючими засобами Тип клітин-мішеней Умови культивування які використовуються в комбінації з ретродиференціюючими засобами *IMDM, необов'язково з гідрокортизоном; або *IMDM, L-глутамін і MTG; або *Умови культивування Гематопоетичні клітини для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з 2β-ME, заміненим на MTG, необов'язково з вітамінами Гепатоцити печінки *DMEM або IMDM або α-мінімальне необхідне середовище, L-glu, необов'язково з дексаметазоном L-аскорбінова кислота-2-фосфатом і нікотирнамідом; або * Середовище Е Вільямса, піруват натрію, дексаметазон; або *Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з дексаметазоном 13 Додаткові умови культивування * Культивування може виконуватися при 33 °C * Культивування може виконуватися за кімнатної температури для збільшення мегакаріоцитів в культурі * диференційовані клітини можуть бути піддані дії хелатуючих засобів перед конверсією, щоб збільшити кількість попередників еритроїдів в культурі * RPMI 1640 може бути використана як базальне середовище для збагачення попередниками лімфоїдів *бутират натрію і/або 5-азацитидин може бути доданий в культуру, щоб сприяти примітивній диференціації еритроїдів UA 109265 C2 Продовження таблиці 1 Способи отримання різних типів клітин-мішеней в комбінації з ретродиференціюючими засобами Тип клітин-мішеней Шкіра/ кератиноцити Меланоцити Остеоцити/кістка Клітини сосочків дерми волосся Умови культивування які використовуються в комбінації з ретродиференціюючими засобами * Hams F12, DMEM (співвідношення середовищ 3: 1), гідрокортизон, L-glu необов'язково з аденіном; або * Е199 або DMEM з L-glu, необов'язково з гідрокортизоном і аденіном; або * Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з гідрокортизоном необов'язково з кальцієм або сполуками кальцію або аскорбатом *MCDB і Leibovitz L-15, TPA, необов'язково з 3-ізобутил-1метилксантином; або * Середовище 199 і гідрокортизон * DMEM, в-гліцерофосфат, дексаметазон, аскорбат і L-glu, необов'язково з вітаміном D3; або *Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з гліцерофосфатом дексаметазоном і аскорбатом, необов'язково з вітаміном D3. * Середовище Е Вільямса, L-glu, гідрокортизон і/або вітамін D2, аденін і лінолева кислота; або * DMEM, Hams F12 як базальне середовище, L-glu гідрокортизон і/або вітамін D2, аденін і лінолева кислота; або *Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище гідрокортизон, вітамін D2 аденін і лінолева кислота 14 Додаткові умови культивування *може бути з гентаміцином як антибіотиком *може культивуватися при 36,4 °C UA 109265 C2 Продовження таблиці 1 Способи отримання різних типів клітин-мішеней в комбінації з ретродиференціюючими засобами Умови культивування які використовуються в комбінації з ретродиференціюючими засобами * DMEM, піруват, аскорбат 2фосфат, дексаметазон і пролін; або *Умови культивування для плюрипотенційних Хондроцити/хрящ стовбурових клітин перераховані вище аскорбат 2-фосфат дексаметазон і пролін * DMEM, дексаметазон і Адіпоцит/жирова клітина індометацин; або *дексаметазон і індометацин * DMEM, низька глюкоза необов'язково з гідрокортизоном дексаметазоном L-глутаміном і піруватом натрію; або * DMEM, Hams F12 або F10 як Скелетні м'язи базальне середовище або DMEM і середовище 199; або * Умови культивування для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище з глюкозою, гентаміцином і низькою сироваткою Кров'яні судини * DMEM, NEAA і 2β-ME; або (ендотелій) * IMDM і дексаметазон * 4: 1 DMEM і середовище М199 або DMEM (низька глюкоза) L-glu, NEAA; або DMEM (низька глюкоза) з аскорбіновою кислотою і/або ДМСО; або Серцевий м'яз/ * Умови культивування кардіоміоцет для плюрипотенційних стовбурових клітин перераховані вище, з антигравітаційним культивуванням або в вібраційному оточуючому середовищі * DMEM, L-glu, 2β-ME NEAA з безперервним розбавленням тим же культуральним середовищем мінус Тропобласт ретродиференціюючий засіб; або * RPMI 1640, 2β-ME піруват натрію і L-глутамін Тип клітин-мішеней 15 Додаткові умови культивування *може бути з гентаміцином як антибіотиком * може бути з низькою концентрацією сироватки * може бути в культуральних посудинах з желатином * може бути з підвищенням температури до 39 °C *може включати додавання 5-азацитидіну * Культуральні посудини покриті желатином, для повного диференціювання і аутологічна сироватка або плазма збіднена тромбоцитами *Повне диференціювання можна спостерігати на предметному склі *може використовуватися щоб проводити аутологічні фактори росту і гормони необхідні для диференціювання клітин на мезодерму і ектодерму включаючи ембріональні стовбурові клітини і клітинипопередники UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Характерно, що для умов культивування, описаних для кожного типу клітин в таблиці 1, видалення засобу ретродиференціювання послідовним розбавленням середовища культивування відповідним культуральним середовищем призводить до більш сильного трансдиференціювання. Під час культивування культуральне середовище, яке необов'язково містить різні промотори диференціювання, може бути розбавлене додаванням більшої кількості середовища, але без ретродиференціюючого засобу. Без зв'язку з теорією, розбавлення, здається, збільшує диференціювання, оскільки клітини стають менш щільними, а фактори, стимулюючі проліферацію, стають менш концентрованими. Таким чином, додавання середовища може далі підсилити трансдиференціювання і впливатиме на те, який тип клітин в межах клітин клітинної лінії отримують. Наприклад, якщо клітиною-мішенню є нейрон, додавання культурального середовища може призводити до зрушення в розвитку до більш зрілого нейрона, а не клітини-попередника нейрона (обидва належать до тієї ж самої клітинної лінії). Як інший приклад, прямого диференціювання клітини-попередники скелетного м'яза диференціюватимуться тільки послідовним розбавленням культурального середовища, яке досягають, поступово знижуючи концентрацію сироватки. Передиференціювання клітини Ретродиференційовані клітини можуть використовуватися, щоб отримати клітини-мішені перекомітуванням або передиференціюванням ретродиференційованих клітин в тип клітинимішені. Це може бути виконано контактом ретродиференційованих клітин з факторами росту. Наприклад, ретиноєва кислота використовувалася, щоб диференціювати стовбурові клітини в нейронні клітини. Метилцелюлозу з подальшим співкультивуванням із стромальною лінією кісткового мозку, і IL-7 використовували, щоб диференціювати стовбурові клітини в попередники лімфоцитів (Nisitani et al., Int Immuno 1994, 6: 909-916). Le Page (New Scientist Dec. 16, 2000) стверджує, що стовбурові клітини можуть бути диференційовані в епітеліальні клітини легені. Bischoff (Dev Biol 1986, 115: 129-39), описує, як диференціювати м'язові клітини-сателіти в зрілі м'язові волокна. Нервові клітини-попередники можуть розвиватися з основним фактором росту фібробласта і епідермальним фактором росту (Nakafuku and Nakamura, J Neurosci Res 1995, 41: 153-168). Гематопоетичні стовбурові клітини можуть розвиватися, використовуючи ряд факторів росту, включаючи GM-CSF, еритропоетин, фактор стовбурових клітин і інтерлейкіни (IL-1, IL-3, IL-6) - дивися Metcalf (Nature 1989, 339: 27-30) для огляду цих різних факторів. Potocnik et al., (EMBO J 1994, 13: 5274-83), навіть продемонстрував диференціювання стовбурових клітин в гематопоетичні клітини, використовуючи низькокисневі (5 %) умови. Передиференційована клітина може належати до тієї ж самої клітинної лінії, що і комітована клітина, з якої була отримана ретродиференційована клітина. Альтернативно, передиференційована клітина може належати до іншої клітинної лінії, ніж комітована клітина, з якої була отримана ретродиференційована клітина. Наприклад, В лімфоцит може бути + + ретродиференційований в стовбурову клітину CD34 CD38 HLA-DR . Ця стовбурова клітина може бути потім передиференційованою або перекомітованою у напрямку клітинної лінії В клітини (та ж сама клітинна лінія) або лімфоїдної клітинної лінії (інша клітинна лінія). Клітини-мішені Клітини-мішені відповідно до винаходу є перепрограмованими клітинами, які можуть бути отримані ретродиференціюванням, трансдиференціюванням або передиференціюванням, як описано вище. Відповідно до винаходу, клітини-мішені можуть включати, але не обмежуватися вказаними, плюрипотенційні стовбурові клітини, лімфоїдні стовбурові клітини, мієлоїдні стовбурові клітини, нервові стовбурові клітини, клітини-сателіти скелетного м'яза, епітеліальні стовбурові клітини, ендодермальні і нейроектодермальні стовбурові клітини, зародкові клітини, екстраембріональні і ембріональні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини, ниркові клітини, альвеолярні клітини епітелію, клітини ендодерми, нейрони, клітини ектодерми, острівцеві клітини, ацинарні клітини, овоцити, сперматозоїди, гематопоетичні клітини, гепатоцити, шкіра/кератиноцити, меланоцити, кістка/остеоцити, волосся/ клітини сосочків шкіри, хрящ/хондроцити, жирові клітини/адипоцити, скелетні м'язові клітини, клітини ендотелію, серцевий м'яз/кардіоміоцити і тропобласти. Як описано вище, комітовані клітини і/або ретродиференційовані клітини культивують за певних умов, щоб викликати ретродиференціювання і/або трансдиференціювання і/або передиференціювання і отримати клітини-мішені. Тривалість, протягом якої комітовані клітини і/або ретродиференційовані клітини культивують, не обмежується певним відрізком часу, а швидше констатацією, що клітини-мішені були продуковані. Визначення продукування або зміни числа ретродиференційованих, трансдиференційованих або передиференційованих клітин-мішеней може бути виконане, контролюючи зміни у відносній кількості комітованих клітин, які знижуючи регулювали експресію 16 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 маркерів, що асоціюються з клітинною лінією, або факторів транскрипції, і/або зміни відносного числа клітин, які мають маркери клітинної поверхні, які є характеристикою клітин-мішеней. Альтернативно, або, крім того, може бути контрольоване зменшення числа клітин, які мають маркери клітинної поверхні, типові для комітованих клітин, а не клітин-мішеней. Наприклад, клітина-мішень може бути ембріональною стовбуровою клітиною, яка характеризується багатостадійно-специфічними маркерами, такими як POU5F1 (OCT-4), TERT, KLF4, UTF1, SOX2, Nanog, або стадієспецифічними ембріональними маркерами 3 і 4 (SSEA-3 і SSEA-4), високомолекулярними глікопротеїнами TRA-1-60 і TRA-1-81 і лужною фосфатазою (Andrews et al., Hydridoma 1984, 3: 347-361; Kannagi et al., EMBO J 1983, 2: 2355-2361; Fox et al., Dev Biol 1984, 103: 263-266; Ozawa et al., Cell Differ 1985, 16: 169-173). Вони також не експресують SSEA1, присутність якого є індикатором диференціювання. Інші маркери відомі для інших типів стовбурових клітин, таких як нестеїн (Nestein) для нейроепітеліальних стовбурових клітин (J Neurosci 985, 5: 3310). Мезенхімні стовбурові клітини є позитивними для SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a і CD124, наприклад, і негативними для CD34, CD45 і CD14. + + Плюріпотентними стовбуровими клітинами є клітини CD34 DR TdT (іншими корисними + + + + маркерами є CD38 і CD36 ). Лімфоїдними стовбуровими клітинами є клітини DR , CD34 і TdT + + + + + + (також CD38 ). Мієлоїдними стовбуровими клітинами є клітини CD34 , DR , CD13 , CD33 , CD7 + і TdT . Додаткові клітинні маркери для клітин-мішеней можуть бути виявлені мікроматричним аналізом. Аналіз може включати виділення РНК з клітин-мішеней, які були ретродиференційованими, і/або трансдиференційовани і/або передиференційованими, маркуючи ізольовану РНК фарбою, і гібридизуючи ізольовану РНК з мікроматрицею. Мікроматриця може включати гени або олігонуклеотиди, які представляють цілий геном, або може включати гени або олігонуклеотиди, пов'язані з певним органом системи, системою тканин, хворобою, патологією тощо. Клітинні маркери можуть бути ідентифіковані тим, що гени/олігонуклеотиди демонструють високу сигнальну інтенсивність, і, тим самим, стимулююче регулюються або регулюються на пониження в клітинах-мішенях. Тоді ця інформація може бути застосованою для визначення клітин-мішеней, на основі присутності маркерів, або навіть груп або характерних ділянок маркерів, які були ідентифіковані мікроматричним аналізом. Підтвердження клітин-мішеней може також бути виконане, використовуючи ряд in vitro аналізів, таких як аналізи CFC (див. також, приклади). Дуже примітивні гематопоетичні стовбурові клітини часто вимірюють, використовуючи аналіз ініціації клітин довготривалим розведенням (LTC-IC) (Eaves et al., J Tiss Cult Meth 1991, 13: 55-62). LTC-IC підтримує гемопоез протягом 5-12 тижнів. Для інших клітинних типів, таких як клітини центральної нервової системи, підшлункової залози, печінки, нирок, шкіри тощо, культивування клітин може продовжуватися до тих пір, допоки не з'являться клітини-мішені, як характеризується імуногістохімією, проточною цитометрією, мікроматричним аналізом, або полімеразною ланцюговою реакцією із зворотною транскрипцією (RT-PCR), які є методиками, відомими в технології. Це може також включати функціональні аналізи, наприклад, здійснюючи щеплення імунодефіцитному реципієнтові або виправляючи або підвищуючи якість основного клінічного стану, як тут описується. Клітини-мішені можуть бути ідентифіковані мікроматричним аналізом або RT-PCR, які демонструють набуття нових факторів транскрипції, специфічних до клітинних ліній, білків і сигналів в клітинах-мішенях. Наприклад, ретродиференційовані стовбурові клітини, перетворені на клітини-мішені ектодермальної клітинної лінії, можуть експресувати гени, такі як Nestin, Criptol, is11, LHX1 і/або EN1, і якщо далі диференціювати в нейрони, будуть експресувати нейрофіламенти (NF). З іншого боку, клітини, перетворені на клітини-мішені ендодермальної клітинної лінії, можуть експресувати гени, такі як sox7, sox17, Nodal, PDX1 і/або FOXA2; але клітини-мішені, далі диференційовані в панкреатичні острівцеві клітини, можуть експресувати гени, такі як інсулін (INS) і neurog3 (NGN3). Окремо, перетворення на бажані клітини-мішені може супроводжуватися знижуючою регуляцією зрілих факторів транскрипції, пов'язаних з первинною початковою популяцією, яка піддалася перетворенню. Крім того, визначення продукування клітин-мішеней може відбуватися шляхом розпізнавання певних структурних і/або морфологічних характеристик клітин-мішеней, наприклад, форми клітин, розміру тощо. Ці характеристики відомі в технології для клітинмішеней відповідно до винаходу. Як тільки відносні кількості бажаного клітинного типу збільшилися до відповідного рівня, який може, наприклад, бути таким же низьким, як 0,1 % або таким же високим як 5 %, результатні змінені популяції клітин можуть використовуватися багатьма способами. Щодо кількостей утворених клітин-мішеней, наприклад, плюрипотенційних стовбурових клітин, і це 17 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важливо, щоб оцінити проліферативну здатність стовбурових клітин. Хоча за деяких обставин, кількість стовбурових клітин або інших утворених ретродиференційованих клітин, може виявитись низькою, вивчення показали, що тільки 50 плюрипотенційних гематопоетичних стовбурових клітин можуть відтворити всю гематопоетичну систему в мишачому донорові. Таким чином, терапевтична корисність не вимагає утворення великої кількості клітин. Перетворення комітованих клітин на ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені може також бути виконане in vivo введенням засобу, змішаного з фармацевтичним носієм або розчинником, хворому. Проте, бажано у багатьох випадках, щоб ретродиференціювання, трансдиференціювання або передиференціювання виконували in vitro/ex vivo (у пробірці, поза організмом). Оброблені популяції клітин, отриманих in vitro можуть використовуватися згодом з мінімальною обробкою. Наприклад, вони можуть бути просто комбіновані з фармацевтично прийнятним носієм або розчинником і введені хворому, який потребує стовбурових клітин. Проте може бути бажаним збагатити популяцію клітин для ретродиференціювання, трансдиференціювання або передиференціювання клітин-мішеней або очистити клітини від популяції клітин. Зазвичай це може бути виконано, використовуючи ряд методів (див. VatteseDadey--The Scientist 1999, 13). Наприклад, клітини можуть бути очищені на основі маркерів поверхні клітини, використовуючи хроматографію і/або проточну цитометрію. Проте, часто буває ні необхідним, ні бажаним екстенсивно очищати ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені від популяції клітин, оскільки інші клітини, присутні в популяції (наприклад, клітини строми) можуть підтримати життєздатність і функцію стовбурових клітин. Проточна цитометрія потоку є відомою, достовірною і ефективною методикою для характеристики клітин в межах змішаних популяцій, а також для сортування клітин. Таким чином, засоби очищення або виділення можуть включати проточну цитометрію. Проточна цитометрія функціонує на основі фізичних властивостей частинок в рідкій суспензії, які можна розрізнити при дослідженні пучком світла. Звичайно, такі частинки можуть бути клітинами. Фізичні властивості включають розмір і структуру клітин або, як стало дуже популярним останніми роками, маркери клітинної поверхні клітини, пов'язані моноклональними антитілами, зв'язаними з флуоресцентними молекулами. Kreisseg et al., (J Hematother 1994, 3: 263-89) стверджує, що "внаслідок доступності моноклональних антитіл anti-CD34, багатопараметрична проточна цитометрія стала інструментом вибору для визначення гематопоетичних стовбурових клітин і клітинпопередників.» Kreisseg далі описує загальні методики для розбиття на підгрупи і дослідження проточною цитометрією клітин, які експресують CD34. Далі, Korbling et al., (Bone Marrow + Transplant 1994, 13: 649-54), описує очищення клітин CD34 імуноадсорбцією, за якою слідує + проточна цитометрія на основі експресії HLA-DR. Як обговорено вище, CD34 є корисним маркером у поєднанні із стовбуровими клітинами/клітинами-попередниками. Методики проточної цитометрії для сортування стовбурових клітин на основі інших фізичних властивостей, також доступні. Наприклад, Visser et al., (Blood Cells 1980, 6:391-407) стверджують, що стовбурові клітини можуть бути ізольовані на основі їх розміру і ступеня структурованості. Grogan et al., (Blood Cells 1980, 6: 625-44), також стверджують, що "життєздатні стовбурові клітини можуть бути відсортовані від простих гематопоетичних тканин з високою чистотою, яка піддається перевірці". Так само як вибір для клітин на основі присутності маркера клітинної поверхні або іншої фізичної властивості (позитивний вибір), популяції клітин можуть бути збагачені, очищені, використовуючи негативні критерії. Наприклад, клітини, які мають маркери специфічних клітинних ліній, таких як CD4, CD8, CD42 і CD3, можуть бути видалені з клітинної популяції проточною цитометрією або афінною хроматографією. Дуже корисна методика для очищення клітин включає використання антитіл або інших афінних лігандів, пов'язаних з магнітними гранулами. Гранули культивують з популяцією клітин і клітини, які мають маркер клітинної поверхні, такий як CD34, з яким зв'язується афінний ліганд, захоплюються. Пробірку із зразком, який містить клітини, поміщають в магнітний концентратор зразка, де гранули притягуються до периферії пробірки. Після однієї або більше стадій промивки, цільові клітини частково або в основному повністю очищають від інших клітин. Коли використовують негативний формат вибору, замість промитих клітин, пов'язаних з гранулами усуненням рідкої фази, зберігають рідку фазу, і, отже, клітини, пов'язані з гранулами, ефективно видаляються з клітинної популяції. Ці методи очищення, засновані на афінних лігандах можуть використовуватися з будь-яким типом клітини, для якого відповідні маркери були охарактеризовані або можуть бути охарактеризовані. Urbankova et al., (J Chromatogr B Biomed Appl 1996, 687: 449-52) описують 18 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мікроотримання гематопоетичних стовбурових клітин з суспензії кісткового мозку миші проточним фракціонуванням в полі тяжіння. Urbankova та інші далі коментують, що метод використовувався для дослідження стовбурових клітин кісткового мозку миші, тому що ці клітини більші, ніж інші клітини кісткового мозку і, отже, можливо відокремити їх від суміші. Таким чином, фізичні параметри, відмінні від маркера клітинної поверхні, можуть використовуватися, щоб очистити/збагатити стовбурові клітини. Популяції клітин, які включають перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені, і/або очищені перепрограмовані клітини-мішені, такі як ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені, отримані способами запропонованими даним винаходом, можуть бути збережені in vitro, використовуючи відомі методики. Як правило, зазвичай застосовують мінімальні ростові середовища, такі як Hanks, RPMI 1640, DMEM або IMDM, доповнені сироваткою отриманою із ссавця, такою як FBS, і необов'язково аутологічною плазмою, щоб забезпечити придатне ростове середовище для клітин. Стовбурові клітини можуть бути культивовані на фідерних поживних шарах, таких як шари клітин строми (див. Deryugina et al., Crit Rev Immunology 1993, 13: 115-150). Клітини строми, як вважають, секретують фактори, які підтримують клітини-попередники в недиференційованому стані. Довготривалі культуральні системи для стовбурових клітин описані Dexter et al., (J Cell Physiol 1977, 91: 335) і Dexter et al., (Acta Haematol 1979, 62: 299). Наприклад, Lebkowski et al., (Transplantation 1992, 53: 1011-9), стверджують, що людські + гематопоетичні клітини CD34 можуть бути очищені, використовуючи технологію, засновану на використанні моноклональних антитіл, які ковалентно іммобілізують на поверхні полістиролу, і + що клітини CD34 , очищені цим способом, можуть бути підтримані з життєздатністю більшою, ніж 85 %. Lebkowski et al., (J Hematother 1993, 2: 339-42) також описують, як ізолювати і + культивувати клітини людини CD34 . Див. також Haylock et al., (Iinmunomethods 1994, 5: 217-25) для огляду різних способів. Популяції клітин, які включають стовбурові клітини і очищені препарати, які включають стовбурові клітини, можуть бути заморожені/законсервовані заморожуванням для майбутнього використання. Відповідні методики заморожування клітин та їх подальшого розморожування відомі в технології. У одному варіанті здійснення, ретродиференціювання, трансдиференціювання або передиференціювання відбувається з клітинами із або в зразках лейкоцитної плівки. Термін "лейкоцитна плівка" позначає шар білих клітин, який формується між шаром червоних клітин і плазмою, коли кров, яка не згорнулася, центрифугують або відстоюють. Методи лікування Перепрограмовані клітини-мішені запропоновані даним винаходом, такі як ретродиференційовані клітини-мішені, трансдиференційовані клітини-мішені і передиференційовані клітини-мішені можуть бути комбіновані з різними компонентами, щоб проводити композиції запропоновані винаходом. Композиції можуть бути комбіновані з одним або більше фармацевтично прийнятними носіями або розбавниками, щоб виробляти фармацевтичну композицію (яка може використовуватися для людини або у ветеринарії). Придатні носії і розбавники включають, але не обмежуються ними, ізотонічні сольові розчини, наприклад, забуференні фосфатом сольові розчини. Композиція запропонована винаходом може бути введена прямою ін'єкцією. Композиція може бути виготовлена для парентерального, внутрішньом'язового, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньоочного, перорального і трансдермального введення, або ін'єкцією в цереброспінальну рідину. Композиції, які включають клітини-мішені, можуть бути введені ін'єкцією або імплантацією. Клітини можуть бути подані в суспензії або закладені в матриці носія, такій як природні і/або синтетичні матриці здатні до біологічного розкладу. Природні матриці включають, але не обмежуються ними, колагенові матриці. Синтетичні матриці здатні до біологічного розкладу включають, але не обмежуються ними, поліангідриди і полімолочну кислоту. Ці матриці можуть бути носієм для ніжних клітин в природних умовах. Композиції можуть також включати ретродиференційовані, трансдиференційовані або передиференційовані клітини-мішені запропоновані даним винаходом і, щонайменше, один фармацевтично прийнятний інертний ексципієнт, носій або наповнювач. Доставка може також бути регульованою, тобто такою, що доставляється протягом часу, який може тривати від декількох хвилин до декількох годин або днів. Доставка може бути системною (наприклад, внутрішньовенною ін'єкцією) або спрямованою до певного цільового місця. Клітини можуть бути введені в природних умовах, використовуючи ліпосомне перенесення. 19 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Клітини-мішені можуть бути введені в дозах від 1 × 105 до 1 × 107 клітин на кг. Наприклад, + 70-кілограмововому хворому може бути введено 14 × 106 клітин CD34 для відновлення тканин. Дозування можуть бути будь-якою комбінацією клітин- мішеней, перерахованих в цій заявці. Методи запропоновані даним винаходом можуть використовуватися, щоб лікувати багато хвороб, станів або порушень. Такі стани включають, але не обмежуються такими як, розлад кісткового мозку, гематологічні стани, апластична анемія, бета-таласемія, діабет, хвороба мотонейрона, хвороба Паркінсона, пошкодження спинного мозку, м'язова дистрофія, ниркова хвороба, хвороба печінки, розсіяний склероз, застійна серцева недостатність, вірус гепатиту C, вірус імунодефіциту людини, травма голови, хвороба легенів, депресія, необструктивна азооспермія, андропауза, менопауза і безпліддя, омолоджування, виразка склеродерми, псоріаз, зморшки, цироз печінки, аутоімунна хвороба, облисіння, ретиніт і кристалічна дистрофія/сліпота або будь-яке порушення, пов'язане з дегенерацією тканини. Апластична анемія є рідкісним, але фатальним порушенням кісткового мозку, відміченим панцитопенією і недостатністю клітин кісткового мозку (Young et al., Blood 2006, 108: 2509-2519). Порушення може бути викликане імунопатологічним захворюванням з активованими цитотоксичними T клітинами типу I, які експресуть цитокін Thl, особливо γ-інтерферон, націлений на гематопоетичний компартмент стовбурових клітин, що приводить до розладу кісткового мозку і, отже, ангематопозу (Bacigalupo et al., Hematology 2007, 23-28). Більшість хворих на апластичну анемію можна лікувати трансплантацією стовбурових клітин, отриманих з потомства одних батьків, які співпадають за HLA (Locasciulli et al., Haematologica. 2007; 92:11-18.), хоча, розширення цього підходу на старіших хворих або хворих, у яких сімейні донори відсутні, залишається під великим питанням. Не дивлячись на прийнятний відсоток виживання після трансплантації алогенних стовбурових клітин, які співпадають за HLA, процедура має деякі потенційні ризики, обумовлені імунодепресивним режимом, який використовується, щоб запобігти хворобі трансплантат проти господаря (GVDH). Наприклад, велика доза циклофосфаміду з антитимоцитглобуліном (ATG) або без нього призводить до тривалого періоду імунодепресії і робить хворого сприйнятливим до умовно-патогенної інфекцій. Іншим потенційним ризиком є відмова трансплантата, яка може послідувати через тижні або місяці після трансплантації стовбурових клітин (Gottdiener et al., Arch Intern Med 1981, 141: 758-763; Sanders et al., Semin Hematol 1991, 28: 244-249). Крім того, ризик відмови трансплантата збільшується з числом переливань крові, отриманих до трансплантації стовбурових клітин. Таласемія є спадковою аутосомною рецесивною хворобою крові, відміченою зниженою швидкістю синтезу одного з ланцюгів глобіну, які складають гемоглобін. Таким чином, є недовироблення нормальних білків глобіну, яке часто викликане мутаціями в регуляторних генах, які призводять до утворення аномальних молекул гемоглобіну, викликаючи анемію. Різні типи таласемій включають альфа-таласемію, бета-таласемію і дельта-таласемію, які впливають на продукування альфа-глобіну, бета-глобіну і дельта-глобіну, відповідно. Лікування передбачає постійне переливання крові, хелатування заліза, видалення селезінки і алогенну гематопоетичну трансплантацію. Проте, постійне переливання крові недоступне для більшості хворих через відсутність донорів кісткового мозку, які співпадають за HLA, тоді як алогенна гематопоетична трансплантація пов'язана з багатьма можливими ускладненнями, такими як інфекції і хвороба трансплантат-проти-хозяїна. Діабет є синдром, який призводить до ненормально високих рівнів цукру в крові (гіперглікемія). Діабет відноситься до групи хвороб, які призводять до високого рівня глюкози в крові, викликаного дефектами або в секреції інсуліну, або у дії інсуліну в організмі. Діабет зазвичай розділяють на два типи: діабет 1 типу, відмічений зменшеним продукуванням інсуліну, або діабет 2 типу, відмічений стійкістю до дії інсуліну. Обидва типи призводять до гіперглікемії, яка значною мірою викликає ознаки, зазвичай пов'язані з діабетом, наприклад, надмірне продукування сечі, подальша компенсуюча спрага і підвищене поглинання рідини, затьмарений зір, нез'ясовна втрата ваги, летаргія і зміни в енергетичному метаболізмі. Діабет, як вважають, є хронічною хворобою, яка не лікується. Варіанти лікування обмежуються ін'єкціями інсуліну, вправами, відповідною дієтою, або, для хворих діабетом 2 типу, деякими ліками, наприклад, лікарськими засобами, які підтримують секрецію інсуліну підшлунковою залозою, зменшують рівень глюкози, продукованої печінкою, збільшують чутливість клітин до інсуліну тощо. Хвороби мотонейрона відносяться до групи неврологічних порушень, які впливають на мотонейрони. Такі хвороби включають аміотрофічний бічний склероз (ALS), головний бічний склероз (PLS) і прогресуючу м'язову атрофію (PMA). Для ALS характерна дегенерація як верхніх, так і нижніх мотонейронів, яка припиняє передачу сигналу м'язам і приводить до їх ослаблення і можливої атрофії. PLS є рідкісною хворобою мотонейронів, яка впливає тільки на верхні мотонейрони, яка викликає труднощі з рівновагою, слабкість і ускладнену рухомість ніг, 20 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спастичність і мовні проблеми. PMA є підтипом ALS, яка впливає тільки на нижні мотонейрони, які можуть викликати м'язову атрофію, фасцикуляцію і слабкість. Лікування хвороб мотонейрона невідоме. Рілузол (rilusole), який, як вважають, знижує пошкодження мотонейронів, був схвалений як лікування для ALS, хоча він уповільнює розвиток ALS, а не лікує її. Для PLS, лікування направлене тільки на синдроми, наприклад, баклофен (baclofen) може зменшити спастичність або хінін, який може зменшити судоми. Хвороба Паркінсона (PD) є нейродегенеративним порушенням, яке характеризується втратою нігростріатного шляху, що виникає внаслідок дегенерації допамінергічних нейронів в межах чорної речовини. Причина PD не відома, але пов'язана з прогресуючою смертю допамінергічних (тирозингідроксилаза (TH) позитивна) мезенцефалічних нейронів, викликаючи моторні пошкодження. Отже, PD характеризується нерухомістю м'язів, тремтінням, брадикінезією і потенційною акінезією. Таким чином, на даний час не існує ніякого задовільного лікування хвороби Паркінсона або лікувань для профілактики або лікування хвороби Паркінсона або її симптомів. Симптоматичне лікування моторних пошкоджень, пов'язаних з хворобою, включає пероральне введення дигідроксифенілаланіну (L-DOPA), яке може привести до реального поліпшення моторної функції, але його ефект знижується у міру того, як дегенерація допамінергічних нейронів прогресує. Альтернативні стратегії включають трансплантацію нервової тканини, яка заснована на ідеї, що допамін, який поставляється з клітин, інтегрованих в смугасте тіло, може замістити втрачені нігростріатні клітини, і генну терапію, яка може використовуватися, щоб замінити допамін в смугастому тілі, на яке впливають, введенням ферментів, які відповідають за L-DOPA або синтезом допаміну, таким як введення потенційно нейропротекторних молекул, які можуть або перешкоджати вимиранню TH-позитивних нейронів, або стимулювати регенерацію і функціональне відновлення в пошкодженій нігростріатній системі. Травма спинного мозку характеризується пошкодженням спинного мозку і, зокрема, нервового волокна, що призводить до пошкодження частини або всіх м'язів або нервів нижче від місця пошкодження. Таке пошкодження може відбуватися внаслідок травми хребта, яка призводить до тріщини, зміщує, подрібнює або стискає один або більше хребців, або внаслідок нетравматичного пошкодження, яке викликане артритом, раком, запаленням або дегенерацією диска. Тоді як лікування після пошкодження спинного мозку можуть включати ліки, такі як метилпреднізолон, який є кортикостероїдом, який знижує пошкодження нервових клітин і зменшує запалення в травмованій області, або ліки, які регулюють біль і м'язову спастичність, так само як іммобілізацію хребта або хірургію, щоб видалити грижу міжхребцевого диска або будь-які об'єкти, які можуть ушкоджувати хребет, немає ніяких відомих засобів повністю відновити пошкодження спинного мозку. М'язова дистрофія (MD) відноситься до ряду спадкових м'язових захворювань, які ослабляють скелетні м'язи. MD може характеризуватися прогресуючою слабкістю м'язів, дефектами в м'язових білках, апоптозом м'язових клітин і атрофією тканини. Є більш ніж 100 хвороб, які демонструють характеристики MD, хоча дев'ять хвороб, зокрема: хворобу Дюшена (Duchenne), хворобу Бекера (Becker), хворобу тазового поясу, плече-лопатково-лицьову міопатію, міотонічну дистрофію, окулофарингеальну дистрофію, периферійну дистрофію і хворобу Емері-Дрейфуса, класифікують як MD. Немає ніяких відомих способів лікування для MD, і при цьому немає ніяких спеціальних способів лікування. Фізична терапія може підтримувати м'язовий тонус, а хірургія може використовуватися, щоб поліпшити якість життя. Далі, симптоми, такі як міотонія можуть лікуватися ліками, але немає ніяких довготривалих методів лікування. Хвороба нирок відноситься до станів, при яких відбувається ушкодження нирок і зменшуються їх здатність функціонувати, включаючи видалення метаболітів і надмірної води з крові, стабілізацію електролітів, кров'яного тиску, кислотно-основного балансу, і зворотне всмоктування глюкози і амінокислот. Двома головними причинами хвороби нирок є діабет і високий тиск крові, хоча інші причини включають гломерулонефрит, вовчак, пороки розвитку і закупорки в нирці. Немає ніякого лікування для ниркової хвороби, і, таким чином, терапія зосереджена на тому, щоб уповільнювати прогресування хвороби і лікувати причини хвороби, такі як регулювання рівня глюкози в крові і високого тиску крові і дотримання дієти; лікувати ускладнення хвороби, наприклад, адресне затримання рідини, анемії, хвороби кістки; і заміна втраченої ниркової функції, наприклад, через діаліз або трансплантацію. Розсіяний склероз (MS) є аутоімунним станом, при якому імунна система впливає на центральну нервову систему, приводячи до демієлінізації. MS впливає на здатність нервових клітин в мозку і спинному мозку зв′язуватися одні з одними, оскільки власна імунна система тіла впливає і пошкоджує мієлін, який вистилає аксони нейрона. Коли мієлін втрачений, аксони 21 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більше не можуть ефективно проводити сигнали. Це може призводити до різних неврологічних симптомів, які зазвичай розвиваються у фізичну і пізнавальну нездатність. Немає ніякого відомого лікування MS; при лікуванні намагаються повернути функцію після нападу (раптовий початок або погіршення ознак MS), запобігти новому нападу, і непрацездатності. Наприклад, лікування кортикостероїдами можуть допомогти закінчити напад, тоді як лікування інтерфероном під час початкового роз'їдання, як було показано, зменшує ймовірність, що клінічний MS розвиватиметься. Вірус імунодефіциту людини (HIV, ВІЛ) є лентивірусом, який може призвести до синдрому надбаного імунодефіциту (AIDS, СНІД), стану, в якому, імунна система починає слабшати. HIV перш за все уражає життєвоважливі клітини в імунній системі людини, такі як хелперні Т+ клітини, макрофаги і дендритні клітини. HIV інфекція призводить до низьких рівнів Т-клітин CD4 прямим вірусним знищенням заражених клітин, підвищеною швидкістю апоптозу в заражених + клітинах, або знищенням заражених Т-клітин CD4 цитотоксичними лімфоцитами CD8, які розпізнають заражені клітини. В даний час, немає ніякої вакцини або лікування HIV (ВВІЧ) або AIDS (СНІД). Лікування HIV (ВІЛ) інфекції полягає в дуже активній антиретровірусній терапії або HAART (highly active antiretrovirus therapy). Сучасні варіанти HAART є комбінаціями (або "коктейлями"), які складаються з, щонайменше, трьох лікарських засобів з, щонайменше, двох типів антиретровірусних засобів. Як правило, ці класи є двома нуклеозидними аналогами інгібітору зворотної транскриптази (NARTI або NRTI, nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitor) плюс або інгібітор протеази, або ненуклеозидний інгібітор зворотної транскриптази (NNRTI). Застійна серцева недостатність відноситься до стану, в якому серце не може накачувати достатньо крові в інші органи організму. Цей стан може бути зумовленим хворобою коронарної артерії, рубцевою тканиною на серці, яка утворилась в результаті інфаркту міокарду, високого тиску крові, хворобою серцевого клапана, серцевими дефектами і інфекцією серцевого клапана. Програми лікування зазвичай складаються із спокою, відповідної дієти, зміною щоденної активності і лікарських засобів, таких як інгібітори ангіотензин-перетворюючого ферменту (ACE), бета-блокатори, дигіталіс, діуретики, вазоділататори. Проте, програма лікування повністю не усуватиме пошкодження або стан серця. Гепатит C це інфекційна хвороба печінки, спричинена вірусом гепатиту C. Гепатит C може розвиватися в рубцювання (фіброз) і розширене рубцювання (цироз). Цироз печінки може приводити до печінкової недостатності та інших ускладнень, таких як рак печінки. Сучасне лікування включає використання комбінації пегільованого альфа-інтерферону і противірусного лікарського засобу рибавірин. Коефіцієнти успіху можуть змінюватися від 50 до 80 % залежно від вірусного генотипу. Травма голови відноситься до пошкоджень голови, які, можливо, не спричиняють ушкодження мозку. Частими причинами травм голови є дорожні події, домашні і професійні інциденти, падіння і напади. Різні типи проблем можуть бути викликані травмами голови, включаючи тріщини черепа, рвані рани черепа, субдуральну гематому (кровотеча нижче твердої мозкової оболонки), епідуральну гематому (кровотеча між твердою мозковою оболонкою і черепом), контузію мозку (удар мозку), струс (тимчасова втрата функції унаслідок травми), кому або навіть смерть. Лікування травми голови змінюватиметься залежно від типу пошкодження. Якщо мозок пошкоджений, немає ніякого швидкого засобу відновити його, і часто пошкодження може бути незворотним для доступних засобів лікування. Хвороба легень є широким терміном який охоплює хвороби дихальної системи, яка включає легені, плевральну порожнину, бронхіоли, трахею, верхні дихальні шляхи, нерви ідихальні м'язи. Приклади хвороб легень включають обструктивну хворобу легень, при якій бронхіоли стають звуженими; стримуючі або фіброзні хвороби легень, при яких легені втрачають податливість, що призводить до неповного розширення легень і до збільшеної жорсткості легені; інфекції дихальних шляхів, які можуть бути викликані простудою або пневмонією; дихальні пухлини, зокрема спричинені раком; хвороби плевральної порожнини; легеневі судинні хвороби, які впливають на легеневий кровообіг. Лікування хвороб легень змінюється залежно від типу хвороби, але може включати лікування, таке як кортикостероїди і антибіотики, кисень, механічна вентиляція, радіотерапія і хірургія. Депресія є розладом психіки, який характеризується поганим настроєм, що супроводжується зниженим почуттям власної гідності і втратою інтересу або задоволення від зазвичай приємних дій. Біологічно, депресія супроводжується зміною активності в багатьох частинах мозку, включаючи зрощення ядер, які є групою малих ядер у верхньому стовбурі мозку, який є джерелом серотоніну; супракаезматичне ядро, яке керує біологічними ритмами, такими як цикл сну і активності; гіпоталамічно-гіпофізарно-надниркову вісь, яка є ланцюгом структур, які 22 UA 109265 C2 5 10 15 20 25 активуються під час реакції тіла на різні стресори; вентральну тегментальну область, яка, як вважають, відповідає за електричну схему "підкріплення умовного рефлексу" мозку; прилегле ядро, яке, як думають, відіграє роль в заохоченні, сміху, задоволенні, прихильності, і страху; і антеріальний поясний кортекс, який активується негативними подіями. Лікування депресії передбачає застосування антидепресантів, які збільшують кількість позаклітинного серотоніну в мозку, вправи і психотерапію. Проте, ефективність цього лікування продовжує викликати сумніви. Необструктивна азооспермія є захворюванням чоловіків, при якому в їх еякуляті немає якого-небудь значущого рівня сперми, обумовленого сперматогенезом. Це захворювання часто викликається гормональною нестійкістю і може лікуватися, використовуючи ліки, які відновлюють колишній стан. Андропауза є станом, подібним до менопаузи, який переживають чоловіки середніх років, і який полягає у зниженні продукування гормонів тестостерону і дегідроепіандростерону. Лікування включає гормональну терапію заміни і вправи. Склеродерма є хронічним аутоімунним захворюванням, яке впливає на сполучну тканину. Затвердіння шкіри є одним з видимих проявів хвороби, хоча вона може впливати на сполучну тканину по всьому організму. Не існує ніякого відомого прямого лікування склеродерми. Псоріаз є хронічним аутоімунним захворюванням, яке викликає появу червоних, вкритих лусочками ділянок на шкірі. Причина псоріазу пов'язана з надмірним ростом клітин шкіри. Одна гіпотеза припускає, що причина пов'язана з T-клітинами, які мігрують до шкіри і викликають виділення цитокінів, які викликають швидке продукування клітин шкіри. Лікування псоріазу передбачає застосування лікарських засобів, які діють на T-клітини. Ретиніт є типом прогресуючої дистрофії ретиналі, при якій фоторецептори або ретинальний пігмент епітелію є аномальним і призводить до втрати зору. Методи лікування ретиніту обмежені. Стани, описані тут, можна лікувати певним типом, або комбінацією типів клітин-мішеней. У кращих варіантах здійснення стан, описаний тут, можна лікувати інфузією типів клітин, виділених в таблиці 2. Таблиця 2 Режими лікування різних станів з використанням перепрограмованих, тобто, ретродиференційованих або трансдиференційованих або передиференційованих, клітин-мішеней Стан Апластична анемія Бета-таласемія Діабет Хвороба мотонейрона Хвороба Паркінсона Пошкодження спинного мозку М'язова дистрофія Ниркова хвороба Розсіяний склероз Застійна серцева недостатність Вірус гепатиту С Вірус імунодефіциту людини Травма голови Тип лікування клітинами (одного типу або комбінацією) Гематопоетичні клітини Гематопоетичні клітини Мезенхімні стовбурові клітини, плюрипотенційні стовбурові клітини і/або острівцеві клітини Плюрипотенційні стовбурові клітини, альвеолярні клітини епітелію, клітини ектодерми і/або нейрони Плюрипотенційні стовбурові клітини і/або нейрони Плюрипотенційні стовбурові клітини і/або нейрони Плюрипотенційні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини і/або клітини скелетних м'язів Клітини нирки, мезенхімні стовбурові клітини і/або плюрипотенційні стовбурові клітини плюрипотенційні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини і/або нейрони Кардіоміоцити, мезенхімні стовбурові клітини, плюрипотенційні стовбурові клітини і/або клітини ендотелію Гематопоетичні клітини, плюрипотенційні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини і/або гепатоцити печінки Гематопоетичні клітини Плюрипотенційні стовбурові клітини і/або нейрони 30 23 UA 109265 C2 Продовження таблиці 2 Режими лікування різних станів з використанням перепрограмованих, тобто, ретродиференційованих або трансдиференційованих або передиференційованих, клітин-мішеней Стан Хвороба легенів Депресія Необструктивна азооспермія або андропауза Менопауза і безпліддя Омолоджування Виразки склеродерми Псоріаз Зморшки Цироз печінки Аутоімунна хвороба Облисіння Ретиніт або кристалічна дистрофія/сліпота 5 10 15 20 25 Тип лікування клітинами (одного типу або комбінацією) Плюрипотенційні стовбурові клітини, мезенхімні стовбурові клітини, альвеолярні клітини епітелію і/або клітини ендотелію Плюрипотенційні стовбурові клітини і/або нейрони Плюрипотенційні стовбурові клітини, плюрипотенційні зародкові клітини і/або сперматозоїди Плюрипотенційні стовбурові клітини, овоцити, плюрипотенційні зародкові клітини Плюрипотенційні зародкові клітини, плюрипотенційні стовбурові клітини, клітини сосочків шкіри, нейрони, сперматозоїди, остеоцити, хондроцити, кардіоміоцити, клітини скелетних м'язів, нейрони, клітини ендотелію і/або меланоцити Плюрипотенційні стовбурові клітини, клітини ендотелію, кератиноцити і/або мезенхімні стовбурові клітини Мезенхімні стовбурові клітини і/або плюрипотенційні стовбурові клітини Мезенхімні стовбурові клітини, кератиноцити і/або плюрипотенційні стовбурові клітини Гепатоцити печінки, мезенхімні стовбурові клітини, клітини ендодерми і/або плюрипотенційні стовбурові клітини Мезенхімні стовбурові клітини і/або плюрипотенційні стовбурові клітини Клітини сосочків шкіри і/або меланоцити Нейрони і/або плюрипотенційні стовбурові клітини Наприклад, хворого можна лікувати від стану, описаного вище, застосовуючи наступні стадії: 1) фістулу-канюлю вставляють в руку хворого; 2) урожай білих клітин крові збирають шляхом аферезису, використовуючи автоматизовану систему, таку як спектральний пристрій COBE® (Gambro PCT); 3) аутологічні ретродиференційовані стовбурові клітини отримують з білих клітин крові хворого; 4) аутологічні ретродиференційовані стовбурові клітини промивають і потім вводять внутрішньовенно хворому; 5) контроль прогресу стану хворого включає узяття аналізів крові і оцінку травмованих областей. Винахід буде далі описаний за допомогою наступних необмежуючих прикладів, які додатково пояснюють винахід і не призначені, і не повинні бути інтерпретовані, як такі, що обмежують обсяг винаходу. Приклади Приклад 1 Матеріали і методи Це клінічне вивчення дозволило оцінити безпеку введення одиничної дози аутологічних перепрограмованих 3 год. клітин з подальшою дією гематопоетичного індуктивного культурального середовища для чотирьох хворих на апластичну анемію. Це клінічне вивчення було схвалене етичним комітетом Меморіальної лікарні короля Едварда (King Edward Memorial (KEM) Hospital) і було виконано в співпраці з Інститутом імуногематології (Instutute of Immunohematology (IIH)). Хворі були зобов'язані виконувати критерії, викладені в таблиці 3. 24 UA 109265 C2 В результаті четверо хворих з важкою (3 чоловіки) і гіпопластичною (1 жінка) анемією прийняли участь в дослідженні. Ці 4 хворих були відібрані і спостерігалися персоналом IIH/KEM. Клінічна і лікувальна історія описані в таблиці 4, тоді як застосовані для них дозування інфузії + клітин CD34 показані в таблиці 5. 5 Таблиця 3 Критерії інфузії 9 1 - Абсолютна кількість нейтрофілів
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюAbuljadayel, Ilham, Mohammed, Saleh, Saeed
Автори російськоюАблджадайел Ильхам Мохамед Салех Саид
МПК / Мітки
МПК: A61P 17/02, A61P 7/00, C12N 5/074, A61P 25/16, A61P 7/06, A61P 11/00, A61K 35/14, A61P 9/04, C12N 5/078, A61P 5/00, C12N 5/02, A61P 25/00, A61P 31/18, A61P 21/00
Мітки: медикаменту, застосування, нервових, стовбурових, клітин, фармацевтично, перепрограмованих, приготуванні, композиції
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/59-109265-zastosuvannya-pereprogramovanikh-stovburovikh-nervovikh-klitin-v-prigotuvanni-medikamentu-abo-farmacevtichno-kompozici.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Застосування перепрограмованих стовбурових нервових клітин в приготуванні медикаменту або фармацевтичної композиції</a>
Застосування композиції, яка містить вірусоподібні частинки hpv16 і hpv18 у приготуванні медикаменту для профілактики інфекції і/або хвороби, спричиненої групою hpv онкогенних типів, способи індукування імунної
Номер патенту: 85377
Опубліковано: 26.01.2009
Автори: Дубін Ґері, Слауі Монсеф Мохаммед, Інніс Брюс, Веттендорфф Мартін Анн Сесіль
МПК: A61K 39/12, A61K 35/00
Мітки: застосування, типів, медикаменту, приготуванні, хвороби, способи, імунної, індукування, спричиненої, яка, вірусоподібні, hpv16, профілактики, композиції, містить, групою, частинки, онкогенних, hpv18, інфекції
Формула / Реферат:
1. Застосування композиції, яка містить вірусоподібні частинки (ВПЧ) HPV16 і ВПЧ HPV18 у приготуванні медикаменту для профілактики інфекції і/або хвороби, спричиненої групою HPV онкогенних типів, вибраних з наступного переліку:а. група типів 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; b. група HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 та HPV58;c. група HPV31, HPV35 і HPV58;d. HPV31;e. HPV45; таf. HPV52.2....
Застосування електропровідної речовини при приготуванні медикаменту для введення пацієнту (варіанти)
Номер патенту: 78672
Опубліковано: 25.04.2007
Автор: Ортон Кевін Р.
МПК: A61N 1/32
Мітки: застосування, введення, речовини, пацієнту, електропровідної, медикаменту, приготуванні, варіанти
Формула / Реферат:
1. Застосування електропровідної речовини при приготуванні медикаменту для введення всередину тіла пацієнта, у якому згадана електропровідна речовина готується за допомогою наступних кроків:поміщення електропровідної речовини в контейнер так, що згадана електропровідна речовина відділена від тіла пацієнта, якому необхідне лікування;подачі змінного електричного струму в діапазоні частот між 10 кГц і 1 МГц і з густиною енергії...
Застосування поліпептиду одноланцюгового антитіла, який пригнічує активність cd40 або cd40l у приготуванні медикаменту для лікування аутоімунного захворювання
Номер патенту: 94213
Опубліковано: 26.04.2011
Автори: Лю Хайгун, Грант Стівен, Моулдер Кевін
МПК: C07K 19/00, C07K 16/28, A61K 39/395, C12N 15/13, A61P 37/00
Мітки: cd40l, антитіла, медикаменту, лікування, застосування, захворювання, пригнічує, поліпептиду, одноланцюгового, приготуванні, аутоімунного, активність
Формула / Реферат:
1. Застосування поліпептиду одноланцюгового антитіла, що включає одинарний варіабельний домен мономерного антитіла, у приготуванні медикаменту для лікування або запобігання симптомам аутоімунного захворювання, де зазначений поліпептид пригнічує активність CD40 або CD40L, або їх обох та інгібує зв’язування з CD40 поліпептиду антитіла, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 26.2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим,...
Спосіб підвищення радіозахисної активності гемопоетичних стовбурових клітин, отриманих з різних джерел
Номер патенту: 45641
Опубліковано: 25.11.2009
Автори: Тарануха Любов Іванівна, Зубов Дмитро Олександрович, Нікольська Валентина Василівна, Нікольський Ігор Сергійович, Галицька Світлана Миколаївна
МПК: C12N 5/08
Мітки: підвищення, гемопоетичних, різних, активності, радіозахисної, отриманих, джерел, стовбурових, клітин, спосіб
Формула / Реферат:
Спосіб підвищення радіозахисної активності гемопоетичних стовбурових клітин, отриманих з різних джерел, що включає культивування клітин при певних умовах, який відрізняється тим, що гемопоетичні стовбурові клітини, які отримані з різних джерел, активують шляхом спільної інкубації та культивування з культурою мезенхімальних стовбурових клітин.
Спосіб вибору кордової крові як джерела стовбурових клітин для алогенної трансплантації
Номер патенту: 65471
Опубліковано: 15.03.2004
Автори: Бруслова Катерина Михайлівна, Білько Надія Михайлівна, Бебешко Володимир Григорович
МПК: A61B 5/145
Мітки: джерела, спосіб, трансплантації, клітин, кордової, алогенної, вибору, крові, стовбурових
Формула / Реферат:
Спосіб вибору кордової крові як джерела стовбурових клітин для алогенної трансплантації, який полягає у визначенні функціональних властивостей стовбурових клітин, який відрізняється тим, що враховують строки утворення перших колоній та ефективність колонієутворення в короткостроковій культурі in vitro.
Попередній патент: Пристрій для доставки лікарських речовин, що приводиться в дію долонею руки
Наступний патент: Фармацевтична композиція, що містить агоніст гпп-1 і метіонін
Випадковий патент: Пристрій для мінералізації питної води