Застосування поліпептиду одноланцюгового антитіла, який пригнічує активність cd40 або cd40l у приготуванні медикаменту для лікування аутоімунного захворювання

1. Застосування поліпептиду одноланцюгового антитіла, що включає одинарний варіабельний домен мономерного антитіла, у приготуванні медикаменту для лікування або запобігання симптомам аутоімунного захворювання, де зазначений поліпептид пригнічує активність CD40 або CD40L, або їх обох та інгібує зв‟язування з CD40 поліпептиду антитіла, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 26. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначене аутоімунне захворювання є одним із групи, яка складається із системного червоного вовчака, розсіяного склерозу, ревматоїдного артриту, діабету, відторгнення алотрансплантата, відторгнення ксенотрансплантата, а також реакції "трансплантат проти хазяїна". 3. Застосування за будь-яким з пп. 1 або 2, яке відрізняється тим, що поліпептид антитіла є моновалентним щодо зв'язування з CD40L (gp39). 4. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначений поліпептид антитіла інгібує зв'язування CD40L з CD40. 5. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що поліпептид антитіла складається з поліпептиду одинарного варіабельного домену. 6. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначений поліпептид одинарного варіабельного домену є поліпептидом одинарного варіабельного домену антитіла людини. 7. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначений поліпептид одинарного варіабельного домену є VH або VL доменом. UA (21) a200704215 (22) 16.09.2005 (24) 26.04.2011 (86) PCT/GB2005/003562, 16.09.2005 (31) 60/610,819 (32) 17.09.2004 (33) US (31) 11/105,512 (32) 08.04.2005 (33) US (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) ГРАНТ СТІВЕН, GB, ЛЮ ХАЙГУН, CN/GB, МОУЛДЕР КЕВІН, GB (73) ДОМАНТІС ЛІМІТЕД, GB (56) US A 5869049, 09.02.1999. WO A 0168860, 20.09.2001. WO A 9900143, 07.01.1999. WO A 2005035572, 21.04.2005. WO A 0218445, 07.03.2002. WO A 2004058822, 15.07.2004. WO A 2004003019, 08.01.2004. WO A 2004058821, 15.07.2004. WO A 9506481, 09.03.1995. WO A 0206485, 24.01.2002. WO A 0194586, 13.12.2001. BRAMS PETER ET AL: "A humanized anti-human CD154 monoclonal antibody blocks CD154-CD40 mediated human B cell activation" INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY, vol. 1, no. 2, February 2001 (2001-02), pages 277-294, XP002355661 ISSN: 1567-5769. MUYLDERMANS S ET AL: "Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains" TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES, ELSEVIER, HAYWARDS, GB, vol. 26, no. 4, 1 April 2001 (200104-01), pages 230-235, XP004241851 ISSN: 09680004. HOLT L J ET AL: "Domain antibodies: proteins for therapy" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 21, no. 11, 2 (19) 1 3 8. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначений поліпептид антитіла містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з SEQ ID NO: 7-82 і SEQ ID NO: 246-360. 9. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначений поліпептид антитіла має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % гомологічна до SEQ ID NO: 26. 10. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначений поліпептид антитіла має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до SEQ ID NO: 26. 11. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що зв'язування зазначеного поліпептиду антитіла з CD40L значною мірою не стимулює активність CD40 та/або CD40L. 12. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що присутність зазначеного поліпептиду антитіла в стандартній системі для вимірювання агрегації тромбоцитів не приводить до агрегації, вищої більше ніж на 25 % у порівнянні з агрегацією, яка спостерігається в негативному контролі. 13. Поліпептид антитіла, який відрізняється тим, що є моновалентним щодо зв'язування з CD40L (gp39), де зазначений поліпептид пригнічує активність CD40 або CD40L, або обох та інгібує зв‟язування з CD40 поліпептиду антитіла, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 26. 14. Поліпептид антитіла за п. 13, який відрізняється тим, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 85 % ідентичну до послідовності, вибраної із групи, яка складається з SEQ ID NO: 782 і SEQ ID NO: 246-360, що специфічно та моновалентно зв'язує CD40L. 15. Поліпептид за п. 14, який відрізняється тим, що включає одинарний варіабельний домен антитіла, який специфічно та моновалентно зв'язує CD40L, де зазначений поліпептид значною мірою інгібує зв'язування CD40L з CD40. 16. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид антитіла інгібує зв'язування CD40 з CD40L і значною мірою не стимулює передачу сигналів, опосередковану CD40. 17. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що зв'язування зазначеного поліпептиду антитіла з CD40L значною мірою не індукує фосфорилювання JNK у Т-клітинах Jurkat. 18. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що зв'язування зазначеного поліпептиду антитіла з CD40L значною мірою не індукує секрецію IFN-γ Т-клітинами Jurkat, ко-стимульованого анти-С3 антитілом. 19. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що присутність зазначеного поліпептиду антитіла в стандартній системі для вимірювання агрегації тромбоцитівне приводить до агрегації, вищої більше ніж на 25 % у порівнянні з агрегацією, яка спостерігається в негативному контролі. 20. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид антитіла є dAb. 94213 4 21. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що є моновалентним щодо зв'язування з CD40L (gp39), де присутність зазначеного поліпептиду антитіла в стандартній системі для вимірювання агрегації тромбоцитів не приводить до агрегації, вищої більше ніж на 25 % у порівнянні з агрегацією, яка спостерігається в негативному контролі. 22. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид є ПЕГзв'язаним. 23. Поліпептид антитіла за п. 22, який відрізняється тим, що має гідродинамічний розмір, який становить щонайменше 24 кДа. 24. Поліпептид антитіла за п. 22, який відрізняється тим, що вказаний ПЕГ пов'язаний із зазначеним антитілом через залишок цистеїну або лізину. 25. Поліпептид антитіла за п. 22, який відрізняється тим, що загальний розмір ПЕГ становить від 20 до 60 кДа, включно. 26. Поліпептид антитіла за п. 22, який відрізняється тим, що має гідродинамічний розмір, який становить щонайменше 200 кДа. 27. Поліпептид антитіла за п. 22, який відрізняється тим, що має підвищений час напівжиття in vivo у порівнянні з такою ж поліпептидною композицією, яка не містить зв'язаного поліетиленгліколю. 28. Поліпептид антитіла за п. 27, який відрізняється тим, що tα-час напівжиття поліпептидної композиції продовжений на 10 % або більше. 29. Поліпептид антитіла за п. 27, який відрізняється тим, що tα-час напівжиття поліпептидної композиції лежить у діапазоні від 0,25 хвилин до 12 годин. 30. Поліпептид антитіла за п. 27, який відрізняється тим, що tα-час напівжиття поліпептидної композиції продовжений на 10 % або більше. 31. Поліпептид антитіла за п. 27, який відрізняється тим, що tα-час напівжиття лежить у діапазоні від 12 до 48 годин. 32. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з SEQ ID NO: 7-82 і 246-360. 33. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що не містить Fc домену. 34. Поліпептид антитіла за п. 33, який відрізняється тим, що присутність зазначеного поліпептиду антитіла в стандартній системі для вимірювання агрегації тромбоцитів не приводить до агрегації, вищої більше ніж на 25 % у порівнянні з агрегацією, що спостерігається в негативному контролі. 35. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що інгібує зв'язування CD40L з CD40 з IC50 у діапазоні від 20 пМ до 1,5 мкМ, включно. 36. Поліпептид за будь-яким з пп. 13 або 15, який відрізняється тим, що є антиген-зв‟язуючим поліпептидом, який інгібує зв'язування CD40 з CD40L з IC50 у діапазоні від 20 пМ до 1,5 мкМ, включно. 5 37. Поліпептид за будь-яким з пп. з 13 по 15, який відрізняється тим, що поліпептид антитіла містить у собі одну або більше каркасних ділянок, які включають амінокислотну послідовність, що є такою ж, як амінокислотна послідовність відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена зародкової лінії антитіл людини, або амінокислотна послідовність однієї або більше із зазначених каркасних ділянок разом містять у собі до 5 амінокислотних розходжень у порівнянні з амінокислотною послідовністю зазначеної відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена зародкової лінії антитіл людини. 38. Поліпептид за будь-яким з пп. з 13 по 15, який відрізняється тим, що амінокислотні послідовності FW1, FW2, FW3 і FW4 поліпептиди антитіла є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментом гена зародкової лінії антитіл людини, або амінокислотні послідовності FW1, FW2, FW3 і FW4 разом містять до 10 амінокислотних розходжень у порівнянні з амінокислотними послідовностями відповідних каркасних ділянок, які кодуються зазначеним сегментом гена зародкової лінії антитіл людини. 39. Поліпептид за п. 38, який відрізняється тим, що амінокислотні послідовності зазначених FW1, FW2 і FW3 поліпептиди антитіла є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментами гена зародкової лінії антитіл людини. 40. Поліпептид за п. 38, який відрізняється тим, що зазначений сегмент гена зародкової лінії антитіл людини вибраний із групи, яка складається з DP47, DP45, DP48 і DPK9. 41. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що зазначений поліпептид включає одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який специфічно та моновалентно зв'язує CD40L, і містить амінокислотну послідовність, вибрану із групи, яка складається з SEQ ID NO: 7-82 і SEQ ID NO: 246-360. 42. Поліпептид антитіла за п. 41, який відрізняється тим, що пригнічує зв'язування CD40L. 43. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, містить послідовність SEQ ID NO: 26. 44. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями, і має послідовність, яка щонайменше на 80 % гомологічна до послідовності SEQ ID NO: 26. 45. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями і має послідовність 94213 6 CDR1, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR1 SEQ ID NO: 26. 46. Поліпептид антитіла по кожному з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями і має послідовність CDR2, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR2 SEQ ID NO: 26. 47. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями і має послідовність CDR3, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR3 SEQ ID NO: 26. 48. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями і має послідовність CDR1, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR1 SEQ ID NO: 26, і має послідовність CDR2, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR2 SEQ ID NO: 26. 49. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями, і має послідовність CDR2, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR2 SEQ ID NO: 26, і має послідовність CDR3, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR3 SEQ ID NO: 26. 50. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 амінокислотними позиціями і має послідовність CDR1, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR1 SEQ ID NO: 26, і має послідовність CDR3, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR3 SEQ ID NO: 26. 51. Поліпептид антитіла за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що поліпептид одинарного варіабельного домену, який зв'язується з CD40L, має амінокислотну послідовність, яка є ідентичною до амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26, або відрізняється від амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 26 не більше ніж за 25 7 94213 8 амінокислотними позиціями і має послідовність CDR1, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR1 SEQ ID NO: 26, і має послідовність CDR2, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR2 SEQ ID NO: 26, і має послідовність CDR3, яка щонайменше на 50 % гомологічна до послідовності CDR3 SEQ ID NO: 26. 52. Поліпептид за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що включає послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 SEQ ID NО:26. 53. Поліпептид за будь-яким з пп. 13 або 14, який відрізняється тим, що включає послідовності CDR1, CDR2 і CDR3 поліпептиди одинарного варіабельного домену антитіла, який включає послідовність, вибрану із групи, яка складається з SEQ ID NО: 7-82 і 246-360. 54. Застосування поліпептиду антитіла за будьяким з пп. 13-53 у приготуванні медикаменту для лікування або запобігання симптомам аутоімунного захворювання в індивідуума. 55. Композиція, яка включає поліпептид антитіла за пп. 13 або 14 і другий поліпептид антитіла, який зв'язує ліганд, відмінний від CD40L, яка відрізня ється тим, що зазначений поліпептид антитіла, що зв'язує ліганд, відмінний від CD40L, зв'язує ліганд, вибраний із групи, яка складається з HSA, TNFа, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-γ, CD2, CD4, CD8, LFA1, LFA3, VLA4, CD80, В7-1, CD28, CD86, В7-2, CTLA-4 CD28, індукованої костимуляторної молекули (ICOS), CD27, CD30, ОХ40, CD45, CD69, CD3, CD70, ліганду індукованої ко-стимуляторної молекули (ICOSL), OX40L, медіатора проникнення герпесвірусу HVEM, LIGHT. 56. Фармацевтична композиція тривалого вивільнення, яка включає поліпептид моновалентного анти-CD40L антитіла за пп. 13 або 14, яка відрізняється тим, що поліпептид антитіла містить або складається з поліпептиду одинарного варіабельного домену антитіла. 57. Фармацевтична композиція тривалого вивільнення за п. 56, де зазначений поліпептид антитіла є dAb. 58. Композиція за п. 56, яка відрізняється тим, що зазначений поліпептид моновалентного антиCD40L антитіла містить одинарний варіабельний домен антитіла, який зв'язує CD40L. Рівень техніки CD40 є молекулою поверхневого глікопротеїну з молекулярною масою 50 кДа, яка експресується на поверхні зрілих та незрілих Вклітин, макрофагів, фолікулярних дендритних клітин, клітин епітелію тимуса, нормального базального епітелію та деяких клітинних ліній пухлинного походження. Молекула CD40 є членом родини рецепторів фактора некрозу пухлин (TNF) і виконує важливі сигнальні функції, які приводять до великої кількості нижче перерахованих клітинних ефектів для різноманітних типів клітин. У ранніх дослідженнях було показано, що зв'язування CD40 на поверхні В-клітин з антитілами призводить до активації та проліферації В-клітин. Зв'язування CD40 з антитілами в присутності IL-4 індукує проліферацію та зміну класу in vitro, агрегацію Вклітин через LFA-1 (Gordon et al., 1988, J. Immunol. 140: 1425), і фосфорилювання за залишками серину/треоніну та тірозину великої кількості внутрішньоклітинних субстратів (Gordon et al., 1988, дивися вище; Uckun et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17478). Моноклональні антитіла проти CD40 також стимулюють В-клітини до проліферації у відповідь на такі агенти, як PMA (Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 1535) і антитіла проти CD20 (Clark & Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 4494). Рецепторна гомологія CD40 і вивчення зв'язування антитіл демонструють центральну роль CD40 в активації В-клітин, що стимулює пошук його природного ліганда. Було виявлено, що мутант лінії Т-клітин Jurkat конститутивно стимулює В-клітини людини до секреції імуноглобуліну (Yellin et al., 1991, J. Immunol. 147: 3389-3395). Було отримане моноклональне антитіло, назване 5с8, яке специфічно взаємодіє з мутантною лінією, але не з вихідною лінією клітин Jurkat. Було виявлено, що антитіло 5с8 імунопреципітує з поліпептидом клітинної поверхні з молекулярною масою 30 кДа (більш точно 29,3 кДа, 261 амінокислота) і специфічно інгібує хелперну функцію В-клітин у мутантній лінії клітин (Lederman et al., 1992, J. Exp. Med., 175: 1091-1101; Lederman et al., 1992, J. Immunol. 149: 3817-3826; Lederman et al., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5: 439-444). Поліпептидний ліганд із молекулярною масою 30 кДа антитіл 5с8 був названий Т-ВАМ (тобто молекула, яка активує Т-Вклітини (T-B-cell Activating Molecule). Інший напрямок досліджень використовував техніку молекулярного клонування для ідентифікації поліпептидів, які специфічно зв'язують молекулу CD40. Клони кДНК для специфічного ліганда CD40 були ідентифіковані в аналізі зв'язування з CD40 і одержали альтернативні назви CD40 ліганд (CD40 Ligand, CD40L), gp39, CD154, або TRAP (Graf et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 31913194; Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82; і Aruffo et al., 1993, Cell 72: 291-300). Згодом було встановлено, що клон CD40L має ту ж структуру, що й Т-ВАМ (Covey et al., 1994, Mol. Immunol. 31: 471-484). Білок CD40L людини демонструє 82,8% і 77,4% ідентичності на рівні нуклеїнової кислоти та амінокислотного складу, відповідно, з аналогічним білком, виділеним із клітин EL4 доброякісної пухлини тимуса (тімоми) миші. Обидва даних білка є лігандами для антигену клітинної поверхні CD40, експресованого в Вклітинах спокою. CD40L був також описаний як IMD3 - білок, задіяний у синдромі гіпер-IgM імунодефіциту. Ген людини, який кодує CD40L, картований у хромосомі Xq26.3-q27. Ген містить п'ять екзонів. В обмеженому кластері ділянки позаклітинного 9 домена CD40L були виявлені делеції, точкові мутації та мутації зміщення рамки на основі аналізу рідкісного зчепленого з Х-хромосомою синдрому імунодефіциту (Hyper-IgM immunodeficiency syndrome, HIGM1), який характеризується бактеріальними інфекціями, що повторюються та дуже низьким рівнем або відсутністю IgG, IgA і IgE, і нормальним або підвищеним рівнем IgM і IgD у сироватці крові. Було виявлено, що причинно-зв‟язані мутації є результатом кластеризованних делецій, які виникають у результаті сплайс-донорних мутацій із пропуском екзона, сплайс-акцепторних мутацій з використанням криптичного сайту сплайсинга, і випадків делецій/вставок з виникненням нового сайту сплайсинга. CD40L експресується в активованих, але не в CD4+ Т-клітинах спокою, і відіграє важливу роль у гуморальній імунній відповіді, будучи пов'язаним із проліферацією В-клітин, продукцією антитіл і цитокінів і життєздатністю клітин. In vivo, делеція або мутація CD40L як у мишей, так і в людини, призводить до важкого імунодефіциту, який характеризується гіпогамаглобулінемією і дефіцитом Т-клітин в опосередковуваному клітинами імунітеті (Chess, C., 2001, in Therapeutic Immunology, 2nd edition, Austen, K.F., Burakoff, S., Rosen, F. and Strom, T., eds., Blackwell Sciences, pp. 441-456). Т-клітини CD4+ людини, інфіковані вірусом імунодефіциту HIV1, який викликає важку дисфункцію клітинного імунітету, але парадоксальним чином призводить до інтенсивної поліклональної активації В-клітин, не експресують CD40L. Було показано, що ген і поверхнева експресія CD40L активованими Тклітинами подавлені в підгрупі пацієнтів зі звичайним варіабельним імунодефіцитом (CVI). Таким чином, порушення сигнального шляху через CD40 може бути відповідальним, принаймні, частково, за порушення диференціації В-клітин у цих пацієнтів. Функціональні наслідки зв'язування CD40L з CD40 включають, наприклад: а) уникнення Вклітинами апоптоза, індукованого Fas або зв'язуванням IgM, б) індукцію ко-стимуляторних молекул CD80 (B7-1) і CD86 (B7-2), які взаємодіють із CD28 і CD152 (CTLA-4) на поверхні активованих Т-клітин, в) підвищену експресію інших активаторних молекул клітинної поверхні, включаючи CD23, CD54, CD95 і лімфотоксин-а та г) індукцію зміни класу імуноглобуліну (дивися Chess, дивися вище, і посилання 25, 44, і 47-60, цитовані в даній роботі). Зв'язування CD40L з CD40 також підсилює антиген-презентуючу функцію дендритних клітин, індукуючи підтримку високих рівнів MHC антигенів класу II, підвищену експресію допоміжних молекул, включаючи CD58 (LFA-3). CD40L індукує продукцію цитокінів і протипухлинну активність моноцитів у периферийній крові. CD40L також ко-стимулює проліферацію активованих Т-клітин, і ця ко-стимуляція супроводжується продукцією IFN-, TNF- та IL2. Експресія CD40L у Т-хелперих клітинах миші та Т-клітинах CD4+ інгібується IFN-, і в Т-хелперих 94213 10 клітинах типу 2 інгібується TGF-. CD40L підвищує експресію CD54 у культивованих клітинах Ходжкіна та Ріда-Штернберга (Hodgkin and Reed-Sternberg cells). Збільшена поверхнева експресія CD54 супроводжується підвищеною втратою поверхнево-зв‟язаного CD54. Вважається також, що CD40L може відігравати важливу роль в індукції толерантності - CD80 і CD86, експресія яких збільшується CD40L, і які взаємодіють із CD28 для забезпечення істотної ко-стимуляції Т-клітин у комбінації з активацією рецепторів Т-клітин, що призводить до повної активації Т-клітин. При відсутності активації CD28, яка запускається CD80 і CD86, анергія (нечутливість до введених антигенів) або толерантність є результатом тригерної дії антигену (Linsley & Ledbetter, 1993, Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212; Jenkins et al., 1993, Curr Opin. Immunol. 5: 361-367; і Boussiotis et al., 1996, Immunol. Rev. 153: 5-26). Сигнальний шлях CD40L/CD40 залучений у праймінг in vivo CD8+ цитотоксичних Тлімфоцитів (CTSs) CD4+ Т-клітинами. Як ми вже відзначали, CD40L, експресований на поверхні активованих CD4+ Т-клітин, взаємодіє з CD40, експресованим на дендритних клітинах, індукуючи дендритні клітини до підвищеної експресії МНС, і сигнальний шлях через CD40 може заміняти залучення CD4+ T-хелперних клітин у запускання (праймінг) CD8+ CTL відповідей. Блокування CD40L інгібує запускання (праймінг) CTL, підкреслюючи життєво важливу роль взаємодій CD40L/CD40 у запусканні (праймензі) CTL хелперними Т-клітинами (Ridge et al., 1998, Nature 393: 474-478; Schoenberger et al., 1998, Nature 393: 480-483; Bennett et al., 1998, Nature 393: 478-480). CD40L може також бути посередником функціональної взаємодії CD4+ T-клітин з іншими клітинами, які експресують CD40, такими як фібробласти, синовіальні клітини та клітини ендотелію (Yellin et al., 1995, J. Leuko. Biol. 58: 209-216; Yellin et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 18571864). CD40L індукує експресію CD54 (ICAM-1) і CD106 (VCAM-1) фібробластами, збільшуючи також вміст у фібробластах IL-6, колагенази та продукцію колагену та індукуючи проліферацію фібробластів. Таким чином, взаємодії CD40L/CD40 можуть бути залучені в індукцію фіброзу, пов'язаного з аутоімунною реакцією та імунними відповідями. Взаємодія CD40L з CD40 індукує в ендотеліальних клітинах експресію CD62E (Еселектину), ICAM-1 і VCAM-1. Підвищена експресія цих молекул, які беруть участь в адгезії, може бути залучена до зв'язування запальних клітин з ендотелієм судин і з наступною міграцією запальних клітин до ділянок запалення. Блокування CD40L гальмує міграцію лейкоцитів крізь ендотеліальні клітинні бар'єри. У тваринних моделях аутоімунних захворювань антитіла проти CD40L заважають накопиченню запальних клітин у вогнищах запалення. Взаємодії CD40/CD40L можуть бути задіяні 11 при розвитку хвороб, які мають імунне або аутоімунне походження. Тваринні моделі хвороб, пов'язаних з імунною системою, у яких сигнальний шлях CD40L/CD40, як було показано, відіграє важливу роль у патогенезі, включають, наприклад, моделі системного червоного вовчака мишей (Lupus or SLE; дивися, наприклад, Kalled et al., 1998, J. Immunol. 160: 2158-2165), артриту (колаген-індукований артрит, дивися, наприклад, Durie et al., 1993, Science 261: 1328-1330), розсіяного склерозу (експериментальний аутоімунний енцефаломієліт (EAE; дивися, наприклад, Howard et al., 1999, J. Clin. Invest. 103: 281-290), аутоімунного тіреоідіту (EAT; дивися, наприклад, Caryanniotis et al., 1997, Immunology 90: 421-426), коліту (колаген-індукований коліт, дивися, наприклад, Stuber et al., 1996, J. Exp. Med. 183: 693-698), атеросклерозу та ішемічної хвороби серця (coronary artery disease, дивися, наприклад, Mach et al., 1998, Nature 394: 200203), і відторгнення трансплантатів (дивися, наприклад, Parker et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9560-9564; Kirk et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8789-8794; Larsen et al., 1996, Nature 381: 434-438 і Blazar et al., 1997, J. Immunol. 158: 29-39). Спроби використовувати антитіла проти CD40L для лікування пов'язаних з імунною системою хвороб людини включають дослідження на пацієнтах хворих на вовчак (дивися, наприклад, Huang et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 1554-1562). Перша фаза випробувань показала, що гуманізоване моноклональне антитіло проти CD40L (IDEC-131) є безпечними та добре переноситься пацієнтами хворими на вовчак (Davis et al., 2001, J. Rheumatol. 28: 95-101). Друга фаза випробувань із антитілом IDEC-131 продемонструвала поліпшення клінічних симптомів, але ефективність ліків у порівнянні з контролем плацебо показана не була (Kalunian et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3251-3258). У другій фазі випробувань із антитілом проти CD40L BG9588 була продемонстрована клінічна ефективність, але випробування були припинені у зв'язку з виникненням тромбоемболічних проявів (Boumpas et al., 2003, Arthritis Rheum. 48: 719-727). У патентах U.S. Patent Nos. 5,474,771 (Lederman et al.) і 5,876,950 (Siadak et al.) розкриваються моноклональні мишачі антитіла, специфічні до різних епітопів білка gp39 людини. WO95/06666 (Noelle & Foy) розкриває мишачі антитіла проти gp39. U.S. Patent No. 6,328,964 (Noelle & Claassen) розкриває способи лікування розсіяного склерозу з використанням специфічних антитіл проти gp39. U.S. Patent No. 5,747,037 (Noelle et al.), і EP0721469B1 (Ledbetter et al.) і його U.S. аналог U.S. 5,869,049 розкривають мишачі антитіла, специфічні проти gp39 людини. U.S. Patent No. 5,876,718 (Noelle et al.) розкриває способи індукції імунологічної толерантності Т-клітин до трансплантованих тканин і лікування хвороби «трансплантат проти хазяїна» з використанням моноклональних мишачих антитіл проти gp39. EP0742721B1 (Noelle et al.) розкриває способи 94213 12 інгібування гуморальної імунної відповіді на тимус-залежний антиген, які використовують моноклональні мишачі антитіла проти gp39. U.S. Patent No. 6,375,950 описує способи індукції імунологічної толерантності Т-клітин до тканин або органів донора в реципієнта трансплантата з використанням моноклональних (мишачих) антитіл проти gp39. EP1005372B1 (De Boer et al.) описує способи вибіркового знищення автореактивних CD40L+ Tклітин з використанням моноклональних (мишачих) антитіл проти CD40L, злитих з білкомтоксином. U.S. Patent No. 6,340,459 (Yellin et al.) описує застосування мишачого моноклонального антитіла 5с8 проти gp39 для лікування або запобігання ушкодженням при реперфузії. EP0831906B1 (Claassen et al.) описує способи лікування спричиненого Т-клітинами руйнування тканин при аутоімунних захворюваннях, таких як розсіяний склероз, з використанням моноклональних (мишачих) антитіл проти gp39. Використані в попередніх терапевтичних застосуваннях антитіла були дивалентними антитілами мишачого походження. Велика кількість більш дрібних антигензв‟язуючих фрагментів природних антитіл було ідентифіковано після їхнього розщеплення протеазами. Такі фрагменти включають, наприклад, «Fab-Фрагмент» (VL-CL-CH1-VH), Fab із шарнірною ділянкою важкого ланцюга, і «F(ab)2фрагмент» (димер Fab-Фрагментів, з'єднаних шарнірною ділянкою важкого ланцюга). Рекомбінантні методи були використані для одержання навіть дрібніших антигензв‟язуючих фрагментів, названих «одноланцюговий Fv» (варіабельний фрагмент) або «scFv», який складається з VL і VH, з'єднаних синтетичним пептидним лінкером. Хоча антигензв‟язуюча одиниця природних антитіл (наприклад, людини та більшості інших ссавців),як відомо, включає пари V-ділянок (VL/VH), види ряду мозоленогих (верблюдів) експресують більшу частку повністю функціональних, високо специфічних антитіл, які позбавлені послідовностей легких ланцюгів. Було виявлено, що важкі ланцюги антитіл мозоленогих є гомодимерами важких ланцюгів, димеризовані через їхні константні ділянки. Варіабельні домени цих важких ланцюгів антитіл верблюдів, які називають VHH-доменами, зберігають свою здатність, будучи ізольовані у вигляді фрагментів VHланцюга, зв'язувати антиген з високою специфічністю (Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). Зв'язуючі антиген одинарні VHдомени були ідентифіковані також, наприклад, у бібліотеці мишачих VH генів, ампліфікованих з геномної ДНК селезінки імунізованих мишей і експресованих в E.coli (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546). Ward et al. назвали ізольовані одинарні VH-домени «dAbs» від «domain antibodies» (доменні антитіла). Термін «dAb» позначає, таким чином, поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла (VH або VL), який 13 специфічно зв‟язує антиген. Домен «dAb» зв'язує антиген незалежно від інших V-доменів, однак у тому значенні, у якому термін тут використовується, «dAb» може бути гомо- або гетеромультимером з іншими VH або VL доменами, де інші домени не є необхідними для зв'язування антигену dAb, тобто, де dAb зв'язує антиген незалежно від додаткових VH або VL доменів. Одинарні варіабельні домени антитіла, наприклад, VHH, є найменшою відомою зв'язуючу одиницю антитіла. Для застосування в терапії кращими є людські антитіла, у першу чергу, тому що вони не будуть викликати імунної відповіді при введенні пацієнтові. Як відзначалося вище, ізольовані VH-домени представників видів, які не відносяться до мозоленогих, мають тенденцію бути погано розчинними та часто погано експресуються. Порівняння доменів VHH мозоленогих з доменами VH антитіл людини виявляє кілька ключових розбіжностей у каркасних ділянках VHH домена мозоленогих, що відповідає області взаємодії VH/VL доменів VH людини. Були зроблені мутації цих залишків в VH3 домені людини для того, щоб він більше нагадував послідовність VHH (зокрема, Gly 44Glu, Leu 45Arg та Trp 47Gly), для одержання «верблюдизованих» людських VH-доменів, які зберігають антигензв'язуючу активність (Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290) і які мають поліпшену здатність до експресії та розчинність. (Використана тут нумерація амінокислот у варіабельному домені відповідає конвенції з нумерації, запропонованій Кабатом (Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)). WO 03/035694 (Muyldermans) повідомляє, що мутація Trp 103Arg поліпшує розчинність доменів VH представників видів, які не є верблюдами. Davies & Riechmann (1995, Biotechnology N.Y. 13: 475479) також повідомляють про продукцію репертуару «верблюдизованих» доменів VH людини в системі фагового дисплея та про вибір клонів, які зв'язують гаптен зі спорідненістю в області 100400 нМ, але клони, обрані для зв'язування білкового антигену, мали більш низьку спорідненість. Хоча багато антитіл та їхніх похідних є корисними для діагностики та терапії, ідеальної фармакокінетики антитіл не вдається досягти у зв'язку з конкретними застосуваннями. Для поліпшення фармакокінетики молекул антитіл, даний винахід надає одинарні поліпептиди домена варіабельної ділянки, які пов'язані з полімерами, що забезпечують їхню підвищену стабільність і час напівжиття. Приєднання полімерних молекул (наприклад, поліетиленгліколю, ПЕГ) до білків добре відоме й, як було показано, модулює фармакокінетичні властивості модифікованих білків. Наприклад, показано, що модифікація білків ПЕГ змінює in vivo час напівжиття при циркуляції в крові, антигенні властивості, розчинність і стійкість білка до протеолізу (Abuchowski et al., J. Biol. 94213 14 Chem. 1977, 252:3578; Nucci et al., Adv. Drug Delivery Reviews 1991, 6:133; Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R. T. ed.); і Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Plenum, NY). Як сайт-специфічне, так і випадкове приєднання ПЕГ до молекул білка відоме фахівцям у даній галузі техніки (дивися, наприклад, Zalipsky and Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications 1992, pp 347-370, Plenum, NY; Goodson and Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield et al., 1991, PNAS 88:7185). Конкретніше, в літературі описане випадкове приєднання ПЕГ до молекул антитіл за залишками лізину та тіольованим похідним (Ling and Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et al., 1987, Immunol. Letters, 15:17; Kitamura et al., 1991, Cancer Res. 51:4310; Delgado et al., 1996 Br. J. Cancer, 73: 175; Pedley et al., 1994, Br. J. Cancer, 70:1126). Розкриття винаходу Даний винахід стосується поліпептидів антитіл, які моновалентно зв'язують CD40L. Оскільки важливість CD40L у продукції антитіл є абсолютно зрозумілою, взаємодія CD40/CD40L і сигнальні шляхи, які запускаються цією взаємодією, є важливими мішенями для розробки терапевтичних підходів для лікування захворювань і порушень, які включають неадекватну або надлишкову імунну відповідь, таких як аутоімунні захворювання. Поліпептиди антитіл, які є моновалентними для зв'язування CD40L, можуть інгібувати активність CD40L, включаючи зв'язування та активацію CD40 на поверхні Вклітин і наступні за цим клітинні ефекти, у той же час уникаючи потенційних небажаних ефектів, які можуть виникати при застосуванні антитіл, здатних до дивалентного або мультивалентного зв'язування CD40L. Моновалентні поліпептиди антитіл проти CD40L можуть також застосовуватися для різних цілей, для яких застосовуються стандартні дивалентні антитіла, наприклад, для одержання зображень і діагностики in vivo. В одному аспекті поліпептид антитіла складається з, або включає одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який специфічно зв'язує CD40L і пригнічує його активність, бажано, без значного стимулювання активності CD40 та/або CD40L. В іншому аспекті, оскільки людські антитіла не будуть викликати імунну відповідь на антитіла, коли вони вводяться людині для лікування або попередження захворювання, поліпептид антитіла є поліпептидом антитіла людини, який моновалентно зв'язує CD40L, бажано, без значного стимулювання активності CD40 та/або CD40L. Власне кажучи, в одному втіленні даний винахід надає поліпептид антитіла, бажано поліпептид антитіла людини, який може моновалентно зв'язуватися з CD40L (gp39). В одному втіленні поліпептид антитіла людини дисоціює від CD40L людини з Кд у діапазоні від 50 нМ до 20 пМ включно, при вимірюванні методом поверхневого плазмового резонансу. 15 Наприклад, значення Кд для CD40L людини може становити від 25 нМ до 20 пМ, від 10 нМ до 20 пМ, від 5 нМ до 20 пМ, від 1 нМ до 20 пМ, від 0,5 нМ до 20 пМ, від 0,1 нМ до 20 пМ, від 0,1 нМ до 50 нМ, від 75 пМ до 20 пМ або навіть від 50 пМ до 20 пМ. Якщо не зазначено інакше, всі вказані тут діапазони включають специфічні крайні значення. В іншому втіленні поліпептид антитіла інгібує зв'язування CD40L з CD40. В іншому втіленні зв'язування поліпептиду антитіла з CD40L значно не стимулює активності CD40 та/або CD40L. В іншому втіленні поліпептид антитіла людини інгібує зв'язування CD40 з CD40L і значно не стимулює сигнальний шлях, опосередкований CD40. В іншому втіленні зв'язування поліпептиду антитіла з CD40L значно не індукує фосфорилювання JNK у Т-клітинах Jurkat. В іншому втіленні зв'язування поліпептиду антитіла з CD40L значно не індукує секрецію IFN Т-клітинами Jurkat, ко-стимульованого антитілом проти CD3. В іншому втіленні присутність поліпептиду антитіла в стандартній системі для визначення агрегації тромбоцитів не збільшує їхньої агрегації більше ніж на 25% у порівнянні з агрегацією в системі негативного контролю, при вимірюванні без додавання антитіла. В іншому втіленні поліпептид антитіла людини включає одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який зв'язує CD40L. У кращому втіленні одинарний варіабельний домен імуноглобуліну є доменом VH або VL. В іншому втіленні поліпептид антитіла обирається із групи, яка складається з dAb, FAb, scFv, Fv, або зв'язаного дисульфідним зв'язком Fv. В іншому втіленні поліпептид антитіла людини є пов'язаним з ПЕГ. В одному втіленні ПЕГ ковалентно зв'язаний з поліпептидом антитіла людини. В одному кращому втіленні, ПЕГзв‟язаний поліпептид антитіла людини має гідродинамічний розмір, щонайменше, 24 кДа. В іншому кращому втіленні, ПЕГ пов'язаний з поліпептидом антитіла за залишком цистеїну або лізину. В іншому кращому втіленні, загальний розмір ПЕГ становить від 20 до 60 кДа включно. В іншому кращому втіленні, ПЕГ-зв‟язаний поліпептид антитіла людини має гідродинамічний розмір, щонайменше, 200 кДа. В одному втіленні поліпептид антитіла має збільшений час напівжиття in vivo у порівнянні з поліпептидом антитіла такого ж складу, але без поліетиленгліколю. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений на 50% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений в 2 рази або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений в 5 разів або 94213 16 більше, наприклад в 10, 15, 20, 25, 30, 40 разів або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений в 50 разів або більше. В іншому втіленні ПЕГ-зв‟язаний поліпептид антитіла має t-час напівжиття від 0,25 до 6 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття знаходиться в діапазоні від 30 хв до 12 годин включно. В іншому втіленні значення tчасу напівжиття композиції поліпептиду антитіла знаходиться в діапазоні від 1 до 6 годин. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений на 50% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений в 2 рази або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений в 5 разів або більше, наприклад в 10, 15, 20, 25, 30, 40 разів або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду антитіла збільшений в 50 разів або більше. В іншому втіленні час t-напівжиття композиції поліпептиду антитіла становить від 1 до 170 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття знаходиться в діапазоні від 12 до 48 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття перебуває в діапазоні від 12 до 26 годин включно. Крім того, або альтернативно відносно зазначених вище критеріїв, даний винахід надає dAbвмісну композицію, яка включає ліганд, відповідно до даного винаходу, який має значення AUC (площа під кривою «концентрація-час») у діапазоні від 1 мг.хв./мл або більше. В одному втіленні нижнє значення діапазону становить 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 або 300 мг. хв./мл. Крім того, або альтернативно, ліганд або композиція згідно із даним винаходом мають значення AUC у діапазоні до 600 мг.хв./мл. В одному втіленні верхнє значення діапазону становить 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 або 50 мг.хв./мл. Переважно, ліганд, відповідно до даного винаходу, буде мати значення AUC, яке знаходиться в діапазоні, обраному із групи, яка складається з наступних: від 15 до 150 мг.хв./мл, від 15 до 100 мг.хв./мл, від 15 до 75 мг.хв./мл, та від 15 до 50 мг.хв./мл. В іншому втіленні описаний тут поліпептид антитіла може бути пов'язаний із сироватковим альбуміном людини (HSA), що також має ефект збільшення часу напівжиття молекули in vivo. Послідовність, яка кодує сироватковий альбумін людини може бути отримана методом ПЦР із використанням праймерів, отриманих з послідовності кДНК, доступної в GenBank Accession No. НМ000477. Така кодуюча послідовність може бути злита з послідовністю, яка кодує моновалентний поліпептид антитіла проти CD40L, як тут описано, і злитий білок може бути експресований методом, відомим фахівцям у даній галузі. В іншому втіленні t-час напівжиття HSA 17 зв‟язаної композиції поліпептиду антитіла людини збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття HSA-зв‟язаної композиції поліпептиду антитіла людини знаходиться в діапазоні від 0,25 до 6 годин. В іншому втіленні t-час напівжиття HSAзв‟язаної композиції поліпептиду антитіла людини збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття HSA-зв‟язаної композиції поліпептиду антитіла людини знаходиться в діапазоні від 12 до 48 годин. В іншому втіленні поліпептид антитіла людини включає амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID NOs 7-82 та 246-360. В іншому втіленні поліпептид антитіла людини інгібує зв'язування CD40L з CD40 зі значенням IC50 у діапазоні від 20 пМ до 1,5 мкМ, включно; IC50 для інгібування зв'язування CD40L з CD40 у будь-якому з описаних тут втілень переважно вимірюється, як описано нижче у Прикладі 6. Значення IC50 може переважно знаходитися в діапазоні від 20 пМ до 1 мкМ, від 20 пМ до 900 нМ, від 20 пМ до 800 нМ, від 20 пМ до 700 нМ, від 20 пМ до 600 нМ, від 20 пМ до 500 нМ, від 20 пМ до 400 нМ, від 20 пМ до 300 нМ, від 20 пМ до 200 нМ, від 20 пМ до 100 нМ, або від 20 пМ до 50 нМ. Інші прийнятні або кращі діапазони концентрацій включають, наприклад, від 50 пМ до 1 мкМ, від 100 пМ до 500 нМ, від 125 пМ до 250 нМ, від 150 пМ до 200 нМ, від 150 пМ до 100 нМ і від 200 пМ до 50 нМ. В іншому втіленні поліпептид антитіла злитий із другим поліпептидом антитіла, який зв'язує ліганд, відмінний від CD40L. У кращому втіленні, поліпептид антитіла, який зв'язує ліганд, відмінний від CD40L, зв'язує ліганд, обраний із групи, яка складається з HSA, TNF, IL-1, IL-2, IL4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3, VLA4, CD80 (B7-1), CD28, CD86 (B7-2) та CTLA-4. В іншому втіленні поліпептид антитіла людини не містить Fc-домена. Межі Fc-домена наведені в роботі Kabat et al. (1991, Sequences of Immunological Interest, 5th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C., включеної в даний винахід у всій своїй повноті як посилання). Альтернативно до цього, Fc-домен складається з ділянок CH2-CH3, не обов'язково включаючи шарнірну ділянку, пов'язану зі СН2. У кращому втіленні поліпептид антитіла людини не опосередковує агрегацію тромбоцитів у стандартних умовах для вимірювання агрегації тромбоцитів. Даний винахід також включає поліпептид антитіла людини, який має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 85% ідентичну до послідовності, обраної із групи, яка включає SEQ ID NOs 7-82 і 246-360, де поліпептид антитіла специфічно та моновалентно зв'язує CD40L. Даний винахід також включає антигензв‟язуючий поліпептид, поліпептид, який включає одинарний варіабельний домен 94213 18 імуноглобуліну, який специфічно та моновалентно зв'язує CD40L. Інакше кажучи, даний винахід також включає поліпептид, який включає ділянку, яка специфічно зв'язує CD40L, де ділянка складається з єдиного варіабельного домена імуноглобуліну. В іншому втіленні поліпептид складається з одинарного варіабельного домена імуноглобуліну людини. В іншому втіленні поліпептид має значення Кд для CD40L, яке знаходиться в діапазоні від 50 нМ до 20 пМ, включно, як визначено методом поверхневого плазмового резонансу. Наприклад, Кд для CD40L людини може бути від 25 нМ до 20 пМ, від 10 нМ до 20 пМ, від 5 нМ до 20 пМ, від 1 нМ до 20 пМ, від 0,5 нМ до 20 пМ, від 0,1 нМ до 20 пМ, від 75 пМ до 20 пМ або навіть від 50 пМ до 20 пМ. В іншому втіленні поліпептид інгібує зв'язування CD40L з CD40. В іншому втіленні поліпептид інгібує зв'язування CD40L з CD40 і має значення IC50 у діапазоні від 20 пМ до 1.5 мкМ, включно. Наприклад, значення IC50 може знаходитися в діапазоні від 20 пМ до 1 мкМ, від 20 пМ до 900 нМ, від 20 пМ до 800 нМ, від 20 пМ до 700 нМ, від 20 пМ до 600 нМ, від 20 пМ до 500 нМ, від 20 пМ до 400 нМ, від 20 пМ до 300 нМ, від 20 пМ до 200 нМ, від 20 пМ до 100 нМ, або від 20 пМ до 50 нМ. Інші прийнятні або кращі діапазони включають, наприклад, від 50 пМ до 1 мкМ, від 100 пМ до 500 нМ, від 125 пМ до 250 нМ, від 150 пМ до 200 нМ, від 150 пМ до 100 нМ і від 200 пМ до 50 нМ. В іншому втіленні зв'язування поліпептиду з CD40L значно не стимулює активність CD40 та/або CD40L. В іншому втіленні зв'язування поліпептиду з CD40L значно не індукує фосфорилювання JNK у Т-клітинах Jurkat. В іншому втіленні зв'язування поліпептиду з CD40L значно не індукує секрецію IFN- у Тклітинах Jurkat, ко-стимульованих антитілом проти CD3. В іншому втіленні присутність поліпептиду антитіла в стандартній системі для визначення агрегації тромбоцитів не призводить до збільшення їхньої агрегації більше ніж на 25% у порівнянні з агрегацією, яка спостерігається в присутності негативного контролю, при вимірюванні без поліпептиду антитіла. В іншому втіленні одинарний варіабельний домен імуноглобуліну є одинарним варіабельним доменом імуноглобуліну людини. В іншому втіленні одинарний варіабельний домен імуноглобуліну є доменом VH або VL. В одному втіленні поліпептид є ПЕГзв‟язаним. В одному втіленні ПЕГ зв‟язаний ковалентно. В одному кращому втіленні ПЕГзв‟язаний антиген-поліпептид має гідродинамічний розмір, щонайменше, 24 кДа. В іншому кращому втіленні, ПЕГ пов'язаний з антигензв‟язуючим поліпептидом за залишком цистеїну або лізину. В іншому кращому втіленні, загальний розмір ПЕГ становить від 20 до 60 кДа включно. В іншому кращому втіленні ПЕГ 19 зв‟язаний антигензв‟язуючий поліпептид людини має гідродинамічний розмір, щонайменше, 200 кДа. В одному втіленні ПЕГ-зв‟язаний поліпептид має збільшений час напівжиття in vivo у порівнянні з поліпептидною композицією такого ж складу, але позбавленою поліетиленгліколю. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений на 50% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений в 2 рази або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений в 5 разів або більше, наприклад в 10, 15, 20, 25, 30, 40 разів або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений в 50 разів або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття ПЕГзв‟язаного поліпептиду антитіла становить від 0,25 до 6 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття знаходиться в діапазоні від 30 хв до 12 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття композиції поліпептиду антитіла знаходиться в діапазоні від 1 до 6 годин. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений на 50% або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений в 2 рази або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений в 5 разів або більше, наприклад в 10, 15, 20, 25, 30, 40 разів або більше. В іншому втіленні t-час напівжиття композиції поліпептиду збільшений в 50 разів або більше. В іншому втіленні час t-напівжиття композиції поліпептиду антитіла становить від 1 до 170 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття знаходиться в діапазоні від 12 до 48 годин включно. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття знаходиться в діапазоні від 12 до 26 годин включно. В іншому втіленні композиція має значення AUC (area under the curve, площа під кривою) у діапазоні від 1 мг.хв./мл або більше. В одному втіленні нижнє значення діапазону становить 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 або 300 мг.хв./мл. Крім того, або альтернативно, ліганд або композиція відповідно до даного винаходу мають значення AUC у діапазоні до 600 мг.хв./мл. В одному втіленні верхнє значення діапазону становить 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 або 50 мг.хв./мл. Бажано, ліганд відповідно до даного винаходу мусить мати значення AUC, яке перебуває в діапазоні, обраному із групи, яка складається з наступних: від 15 до 150 мг.хв./мл, від 15 до 100 мг.хв./мл, від 15 до 75 мг.хв./мл, і від 15 до 50 мг.хв./мл. В іншому втіленні поліпептид антитіла є пов'язаним із сироватковим альбуміном людини 94213 20 (HSA). В іншому втіленні поліпептид антитіла має збільшений час напівжиття in vivo у порівнянні з поліпептидом такого ж складу, але не пов'язаним з HSA. В іншому втіленні поліпептид антитіла має t-час напівжиття, збільшений на 10% або більше у порівнянні з молекулою, не пов'язаною з HSA. В іншому втіленні значення tα-часу вжиття поліпептидної композиції знаходиться в діапазоні від 0,25 до 6 годин. В іншому втіленні t-час напівжиття поліпептидної композиції збільшений на 10% або більше. В іншому втіленні значення t-часу напівжиття знаходиться в діапазоні від 12 до 48 годин. В іншому втіленні антигензв‟язуючий поліпептид включає амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з SEQ ID NOs 782 і 246-360. В іншому втіленні антигензв‟язуючий поліпептид не містить Fc-домена. В іншому аспекті даний винахід включає поліпептид варіабельного домена імуноглобуліну, який має амінокислотну послідовність, щонайменше, на 85% ідентичну до послідовності, обраної із групи, яка складається з SEQ ID NOs 782 і 246-360, де поліпептид специфічно та моновалентно зв'язує CD40L. В одному втіленні поліпептид варіабельного домена імуноглобуліну порушує зв'язування CD40L з CD40. В іншому втіленні поліпептид варіабельного домена імуноглобуліну інгібує зв'язування CD40L з CD40 зі значенням IC50 у діапазоні від 20 пМ до 1,5 мкМ, включно. Наприклад, IC50 може перебувати в діапазоні від 20 пМ до 1 мкМ, від 20 пМ до 900 нМ, від 20 пМ до 800 нМ, від 20 пМ до 700 нМ, від 20 пМ до 600 нМ, від 20 пМ до 500 нМ, від 20 пМ до 400 нМ, від 20 пМ до 300 нМ, від 20 пМ до 200 нМ, від 20 пМ до 100 нМ, або від 20 пМ до 50 нМ. Інші прийнятні або кращі діапазони концентрацій включають, наприклад, від 50 пМ до 1 мкМ, від 100 пМ до 500 нМ, від 125 пМ до 250 нМ, від 150 пМ до 200 нМ, від 150 пМ до 100 нМ і від 200 пМ до 50 нМ. В іншому втіленні поліпептид варіабельного домена імуноглобуліну інгібує зв'язування CD40L з CD40, але значно не стимулює внутрішньоклітинного сигнального шляху, опосередкованого CD40. У кращому втіленні зв'язування поліпептиду з CD40L значно не індукує фосфорилювання JNK у Т-клітинах Jurkat. В іншому кращому втіленні зв'язування поліпептиду з CD40L значно не індукує секрецію IFN- Т-клітинами Jurkat, ко-стимульованими антитілом проти CD3. В іншому кращому втіленні, зв'язування поліпептиду з CD40L значно не індукує агрегацію тромбоцитів у системі визначення агрегації тромбоцитів. В іншому втіленні антигензв‟язуючий поліпептид додатково включає другий поліпептид антитіла, який зв'язує ліганд, відмінний від CD40L. У кращому втіленні, другий поліпептид антитіла зв'язує ліганд, обраний із групи, що складається з HSA, TNF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL8, IL-12, IL-18, IFN-, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3 та VLA4. 21 В одному втіленні даний винахід стосується поліпептиду антитіла, який включає варіабельний домен імуноглобуліну, який специфічно та моновалентно зв'язує CD40L (наприклад, dAb, FAb, scFv, Fv, або зв'язані через дисульфідний місток Fv проти CD40L), і який включає один або більше каркасних ділянок, які включають амінокислотну послідовність, таку саму, як амінокислотна послідовність відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена антитіла зародкової лінії людини, або амінокислотну послідовність однієї або більше з названих каркасних ділянок, які спільно включають до 5 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотною послідовністю названої відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена антитіла зародкової лінії людини. В одному втіленні амінокислотні послідовності FW1, FW2, FW3 і FW4 варіабельного домена проти CD40L або dAb є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментом гена антитіла зародкової лінії людини, або амінокислотними послідовностями FW1, FW2, FW3 і FW4, що разом містять до 10 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотними послідовностями названих відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментом гена антитіла зародкової лінії людини. В іншому втіленні амінокислотні послідовності FW1, FW2 і FW3 варіабельного домена або dAb проти CD40L є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментами гена антитіла зародкової лінії людини. В іншому втіленні вищезгаданий сегмент гена антитіла зародкової лінії людини може бути обраний із групи, яка складається з DP47, DP45, DP48 і DPK9. Даний винахід також пропонує спосіб порушення зв'язування CD40 з CD40L в індивідуума, спосіб, який включає введення індивідууму моновалентного поліпептиду антитіла проти CD40L, як тут описано, де поліпептид порушує зв'язування CD40 з CD40L в індивідуума. Даний винахід також пропонує спосіб порушення активності CD40 або CD40L в індивідуума, спосіб, який включає введення індивідууму моновалентного поліпептиду антитіла проти CD40L, як тут описано, де поліпептид порушує активність CD40 або CD40L або обох білків. Даний винахід також надає композицію, яка включає склад з уповільненим вивільненням, який включає поліпептид антитіла проти CD40L, переважно, але не обов'язково, поліпептид, який включає одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який зв'язує CD40L. В одному втіленні одинарний варіабельний домен імуноглобуліну є одинарним варіабельним доменом імуноглобуліну не людини. В іншому втіленні одинарний варіабельний домен імуноглобуліну є одинарний варіабельний домен імуноглобуліну людини. Даний винахід також пропонує спосіб лікування або профілактики захворювання або порушення, спричиненого CD40L, в індивідуума, 94213 22 який потребує такого лікування, спосіб, що включає введення індивідууму терапевтично ефективної кількості композиції, яка включає моновалентний поліпептид антитіла проти CD40L, переважно, композиції, яка включає одинарний варіабельний домен імуноглобуліну людини, який зв'язує CD40L. В одному втіленні захворювання або порушення є аутоімунним захворюванням або порушенням. Даний винахід також пропонує спосіб лікування або профілактики симптому системного червоного вовчака (SLE) в індивідуума, який передбачає введення названому індивідууму моновалентного поліпептиду антитіла проти CD40L у кількості, достатній для лікування або профілактики симптому SLE. Даний винахід також пропонує спосіб зменшення або полегшення симптому захворювання, такого як системний червоний вовчак, розсіяний склероз, ревматоїдний артрит, відторгнення алотрансплантата, відторгнення ксенотрансплантата та діабет, включаючи інсулін-залежний діабет Iтипу. Даний винахід також надає поліпептид антитіла, що є моновалентним для зв'язування CD40L, де поліпептид антитіла включає універсальну каркасну ділянку. В одному втіленні універсальна каркасна ділянка включає каркасну ділянку VH, обрану із групи, яка включає DP47, DP45 і DP38, та/або каркасну ділянку VL, яка є DPK9. В іншому втіленні поліпептид антитіла включає характерну ділянку зв'язування ліганда. В іншому втіленні характерна ділянка зв'язування ліганда зв'язує загальний ліганд, обраний із групи, яка включає Протеїн А, Протеїн L і Протеїн G. В іншому втіленні поліпептид антитіла включає варіабельний домен, який має одну або більше каркасних ділянок, які включають амінокислотну послідовність відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена антитіла зародкової лінії людини, або амінокислотні послідовності однієї або більше каркасних ділянок, які спільно включають до 5 амінокислотних розходжень у порівнянні з амінокислотною послідовністю відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена антитіла зародкової лінії людини. В іншому втіленні поліпептид антитіла включає варіабельний домен, де амінокислотні послідовності FW1, FW2, FW3 і FW4 є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментом гена антитіла зародкової лінії людини, або послідовності антитіл FW1, FW2, FW3 і FW4 разом містять до 10 амінокислотних розходжень у порівнянні з амінокислотними послідовностями відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментом гена антитіла зародкової лінії людини. В іншому втіленні поліпептид антитіла включає варіабельний домен антитіла, який включає ділянки FW1, FW2 та FW3, де амінокислотні послідовності названих FW1, FW2 та FW3 є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які 23 кодуються сегментом гена антитіла зародкової лінії людини. В іншому втіленні сегмент гена антитіла зародкової лінії людини обирається із групи, яка складається з DP47, DP45, DP48 і DPK9. Даний винахід включає поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, де поліпептид має амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності DOM8-24, або відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 не більше ніж в 25 положеннях амінокислот, і має послідовність, щонайменше, на 80% гомологічну 3послідовності DOM8-24. В одному втіленні поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 в 25 або менше положеннях амінокислот, в 20 або менше положеннях амінокислот, в 15 або менше положеннях амінокислот, в 10 або менше положеннях амінокислот, в 5 або менше положеннях амінокислот, в 2 або менше положеннях амінокислот, або в одному положенні амінокислоти. В іншому втіленні поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла є, щонайменше, на 80% гомологічним послідовності DOM8-24, наприклад, щонайменше, на 85% гомологічним, щонайменше, на 90% гомологічним, щонайменше, на 95% гомологічним, і навіть на 96%, 97%, 98% або 99% гомологічним. Даний винахід включає поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, де поліпептид має амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності DOM8-24, або відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 не більше ніж в 25 положеннях амінокислот, і має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR1 DOM8-24, або має послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24, і має послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR3 DOM8-24. Даний винахід також включає поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, де dAb має амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності DOM8-24, або відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 не більше ніж в 25 положеннях амінокислот, і має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR1 DOM8-24, і має послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50 % гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24. Даний винахід також включає поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, де dAb має амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності DOM8-24, або відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 не більше ніж в 25 положеннях амінокислот, і має послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24, і 94213 24 має послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50 % гомологічна до послідовності CDR3 DOM8-24. Даний винахід також включає поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, де dAb має амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності DOM8-24, або відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 не більше ніж в 25 положеннях амінокислот, і має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна CDR1 послідовності DOM8-24, або має послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50 % гомологічна CDR3 послідовності DOM8-24. Даний винахід також включає поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, де dAb має амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності DOM8-24, або відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 не більше ніж в 25 положеннях амінокислот, і має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна CDR1 послідовності DOM8-24, і має послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна CDR2 послідовності DOM8-24, і має послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50% гомологічна CDR3 послідовності DOM8-24. В одному втіленні поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, який зв'язує CD40L, якщо не є ідентичним послідовності DOM8-24, відрізняється від амінокислотної послідовності DOM8-24 в 25 або менше положеннях амінокислот, в 20 або менше положеннях амінокислот, в 15 або менше положеннях амінокислот, в 10 або менше положеннях амінокислот, в 5 або менше положеннях амінокислот, в 2 або менше положеннях амінокислот, або навіть в одному амінокислотному положенні. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR1 DOM8-24. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR3 DOM8-24. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR1 DOM8-24, і послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24, і послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR3 DOM8-24. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності 25 CDR1 DOM8-24, і послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR3 DOM8-24. Даний винахід також включає антагоніст CD40L, який має послідовність CDR1, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR1 DOM8-24, і послідовність CDR2, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR2 DOM8-24, та послідовність CDR3, яка, щонайменше, на 50% гомологічна до послідовності CDR3 DOM8-24. В одному втіленні антагоніст CD40L інгібує зв'язування CD40 з CD40L та/або інгібує активність CD40 та/або CD40L, та/або призводить до збільшення агрегації тромбоцитів за стандартних умов визначення не більше ніж на 25%. В одному втіленні антагоніст призводить до збільшення агрегації тромбоцитів на 25% або менше, на 20% або менше, на 15% або менше, на 10% або менше, на 5% або менше, або практично не змінює агрегації тромбоцитів. Даний винахід також включає ліганд із подвійною специфічністю, який включає перший одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який має зв‟язуючу специфічність до першого антигену, і другий одинарний варіабельний домен, який має активність відносно іншого антигену, де перший антиген є CD40L, а зв'язування другого одинарного варіабельного домена із другим антигеном призводить до збільшення часу напівжиття ліганда in vivo. В одному втіленні ліганд із подвійною специфічністю є чотириланцюговим імуноглобуліном IgG. В одному втіленні чотириланцюговий імуноглобулін IgG включає два подвійних специфічних ліганда, де названі подвійні специфічні ліганди відрізняються за їхніми варіабельними доменами. Даний винахід також включає ліганд із подвійною специфічністю, який включає dAb проти CD40L людини та dAb проти SA. В одному втіленні dAbs є доменами VHH мозоленогих. В одному втіленні ліганд із подвійною специфічністю, або (i) перший та другий варіабельні домени імуноглобуліну є варіабельними доменами важких ланцюгів; або (ii) перший та другий варіабельні домени імуноглобуліну є варіабельними доменами легких ланцюгів. В одному втіленні ліганд подається як імуноглобулін IgG, який включає чотири одинарних домена важких ланцюгів або чотири одинарних домена легких ланцюгів. Важкі ланцюги можуть включати домени VHH мозоленогих. В іншому втіленні ліганда з подвійною специфічністю перший і другий домени зв'язують незалежно, так що ліганд із подвійною специфічністю може одночасно зв'язувати і перший і другий антигени. В одному втіленні ліганда з подвійною специфічністю перший одинарний варіабельний домен має константу дисоціації (Кд) 110-8 M або меншу для CD40L людини, і константу швидкості Koff 110-3 c-1 або меншу, при вимірюванні мето 94213 26 дом поверхневого плазмового резонансу. В одному втіленні ліганда з подвійною специфічністю другий одинарний варіабельний домен є специфічним для сироваткового альбуміну (SA) і має константу дисоціації (Кд) від 1 нМ до 500 мкМ для SA, при вимірюванні методом поверхневого плазмового резонансу. В іншому втіленні другий домен зв'язує SA у стандартній системі вимірювання з IC50 від 1 нМ до 500 мкМ. Другий одинарний варіабельний домен може бути специфічним для SA і включати амінокислотну послідовність MSA-16 або послідовність, яка, щонайменше, на 80% гомологічна даній послідовності. Альтернативно цьому, другий одинарний варіабельний домен може бути специфічним для SA і включати амінокислотну послідовність MSA-26 або послідовність, яка, щонайменше, на 80% гомологічна даній послідовності. В одному втіленні ліганда з подвійною специфічністю варіабельний домен або dAb проти CD40L включає універсальну каркасну ділянку. Варіабельний домен або dAb проти CD40L також включають каркасну ділянку VH, обрану із групи, яка складається з DP47, DP45 і DP38; або каркасну ділянку VL, яка представляє собою DPK9. В іншому втіленні ліганд із подвійною специфічністю або dAb можуть включати зв‟язуючу ділянку для спільного ліганда. В одному втіленні зв‟язуюча ділянка для спільного ліганда вибирається із групи, яка складається з зв‟язуючих ділянок для Протеїну А, Протеїну L і Протеїну G. В одному втіленні подвійного специфічного ліганда, варіабельний домен або dAb проти CD40L включають одну або більше каркасних ділянок, які містять амінокислотну послідовність, яка ідентична до амінокислотної послідовності каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена антитіла зародкової лінії людини, або амінокислотні послідовності однієї або більше з названих каркасних ділянок спільно включають до 5 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотною послідовністю названої відповідної каркасної ділянки, яка кодується сегментом гена антитіла зародкової лінії людини. В одному втіленні амінокислотні послідовності FW1, FW2, FW3 і FW4 варіабельного домена або dAb проти CD40L є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментами гена антитіла зародкової лінії людини, або амінокислотні послідовності FW1, FW2, FW3 і FW4 спільно включають до 10 амінокислотних відмінностей у порівнянні з амінокислотними послідовностями відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментами гена антитіла зародкової лінії людини. В одному втіленні амінокислотні послідовності названих FW1, FW2, FW3 і FW4 варіабельного домена або dAb проти CD40L є такими ж, як амінокислотні послідовності відповідних каркасних ділянок, які кодуються сегментами гена антитіла зародкової лінії людини. Сегменти гена антитіла зародкової лінії людини 27 бажано обираються із групи, яка складається з DP47, DP45, DP48 і DPK9. Даний винахід також включає спосіб одержання ліганда з подвійною специфічністю, що його тут описано, який включає перший одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, специфічно зв‟язувальний CD40L і другий одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, специфічно зв‟язуючий білок, що збільшує час напівжиття ліганда in vivo, спосіб, який включає стадії: вибір першого варіабельного домена за його здатністю зв'язувати CD40L; вибір другого варіабельного домена за його здатністю зв'язувати названий білок; об'єднання варіабельних доменів; і вибір ліганда за його здатністю зв'язувати CD40L і названий білок. В одному втіленні перший варіабельний домен обирається для зв'язування CD40L при відсутності комплементарного варіабельного домена. Даний винахід також включає нуклеїнову кислоту, яка кодує ліганд із подвійною специфічністю, описаний тут. Нуклеїнова кислота може включати послідовність нуклеїнової кислоти MSA-16 або послідовність, яка, щонайменше, на 80% гомологічна до неї, або альтернативно може включати послідовність нуклеїнової кислоти MSA26 або послідовність, яка, щонайменше, на 70% гомологічна до неї. Нуклеїнова кислота може бути включена у вектор, який може бути уведений у клітину-хазяїна. Даний винахід також включає фармацевтичну композицію, яка включає ліганд із подвійною специфічністю, як тут описано, і фармацевтично прийнятний наповнювач, носій або розчинник. Даний винахід також включає мономер dAb, специфічний відносно CD40L, де мономер має константу дисоціації (Кд) 110-8 M або менше для CD40L людини та константу швидкості Koff 110-3 с-1 або менше, визначені методом поверхневого плазмового резонансу. В одному втіленні мономер dAb, специфічний відносно CD40L, має константу дисоціації (Кд) 110-7 M або менше, визначену методом поверхневого плазмового резонансу. В одному втіленні мономер dAb, специфічний відносно CD40L, має константу дисоціації (Кд) 110-8 M або менше, визначену методом поверхневого плазмового резонансу. В одному втіленні мономер dAb має зв‟язуючу специфічність відносно CD40L з константою дисоціації (Кд) від 50 нМ до 20 пМ, визначеною методом поверхневого плазмового резонансу. В одному втіленні мономер інгібує зв'язування CD40 з CD40L з IC50 50 нМ або менше. В іншому втіленні мономер dAb має зв‟язуючу специфічність відносно CD40L з константою швидкості Koff 110-3с-1 або менше, 110-4 с-1 або менше, 110-5 с-1 або менше, 110-6 с-1 або менше, виміряної методом поверхневого плазмового резонансу. В одному втіленні мономер dAb нейтралізує CD40L за стандартних умов вимірювання з ND50 94213 28 50 нМ або менше. Даний винахід також включає ліганд із подвійною специфічністю, який включає перший та другий одинарні варіабельні домени важкого ланцюга, або перший та другий одинарні варіабельні домени легкого ланцюга, де перший варіабельний домен є мономером dAb проти CD40L. В одному втіленні другий варіабельний домен має зв‟язуючу специфічність відносно антигена, відмінного від CD40L. В іншому втіленні другий варіабельний домен має зв‟язуючу специфічність стосовно антигена, обраного із групи, яка складається з рецептора EPO, ApoE, Apo-SAA, BDNF, Кардіотропіну-1, EGF, рецептора EGF, ENa-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-2, EpoR, FGF-кислого, FGF-основного, фактора росту фібробластів-10, ліганда FLT3, Fractalkine (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GFbl, інсуліну, IFN-g, IGF-I, IGF-II, IL-1a, Il-1b, IL-2, Il3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.к.), IL-8 (77 a.к.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL18 (IGIF), інгібіну a, інгібіну b, IP-10, фактора росту кератиноцитів-2 (KGF-2), KGF, лептину, LIF, лімфотактину, інгібіторної субстанції Мюлера (Mullerian inhibitory substance), інгібіторного фактора колоній моноцитів, білка-атрактанта моноцитів, M-CSF, MDC (67 a.к.), MDC (69 a.к.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.к.), MIG, MIP-1a, MIP-1b, MIP-3a, MIP-3b, MIP-4, інгібіторного фактора мієлоїдних попередників -1 (MPIF-1), NAP-2, Нейртурину, фактора росту нервів, b-NGF, NT-3, NT-4, онкостатину M, PDGFAA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, DFG1b SCF, SCGF, фактора стовбурових клітин, (SCF), TARC, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, фактора некрозу пухлин (TNF), TNF-a, TNF-b, TNF рецептора I, TNF рецептора II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF рецептора 1, VEGF рецептора 2, VEGF рецептора-3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-b, GRO-g, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, ділянки, яка впізнає TACE, TNF BP-1, TNF BPII, і антигенів, які розкриваються в Додатках 2 або 3. Даний винахід також включає поліпептид антитіла, який порушує або інгібує зв'язування DOM8-24 з CD40L, або поліпептид антитіла, який зв'язується з тим же епітопом CD40L, з яким зв'язується DOM8-24. Даний винахід також включає ліганд із подвійною специфічністю, який включає перший одинарний варіабельний домен, який має зв‟язуючу специфічність стосовно першого антигену, і другий одинарний варіабельний домен, який має зв‟язуючу специфічність стосовно другого антигену, де перший антиген є CD40L, а другий одинарний варіабельний домен є поверхневим антигеном антиген-презентуючих клітин або поверхневим антигеном Т-клітин. Поверхневий антиген антиген-презентуючих клітин може обиратися із однієї груп, з які складаються з поверхневих антигенів дендритних клітин, поверхневих антигенів активованих макрофагів, поверхневих антигенів активованих В-клітин, поверхневих антигенів ко-стимуляторних сигнальних шляхів, і 29 головного комплексу гістосумісності (MHC). В одному втіленні МНС є класом II, і клас II може бути альфа або бета. Поверхневий антиген антиген-презентуючої клітини може обиратися із групи, яка складається з CD28, індуцибельної ко-стимуляторної молекули (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ліганда індуцибельної ко-стимуляторної молекули (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, медіатора входу вірусу герпеса HVEM (Herpes Virus Entry Mediator), та LIGHT, але переважно є CD28, індуцибельною ко-стимуляторною молекулою (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, або CD3. Поверхневий антиген переважно є поверхневим антигеном гена В7, такий як B7-2 або B7-1. Визначення: Термін «людини» або «людський», коли він застосовується тут стосовно поліпептиду антитіла або варіабельного домена імуноглобуліну означає, що поліпептид має послідовність, яка походить з імуноглобуліну людини. Послідовність вважають такою, що «походить з» послідовності, яка кодує імуноглобулін людини, коли послідовність або: а) виділена з людини, або клітин, або клітинної лінії людини; б) виділена з бібліотеки клонованих послідовностей генів антитіл людини (або з бібліотеки послідовностей V доменів антитіл людини); або в) коли було клоновано послідовність гена антитіла людини (або було клоновано послідовність ділянки V людини (включаючи, наприклад, сегмент гена V зародкової лінії)), і ця послідовність була використана для одержання однієї або більше різних послідовностей, які потім відбиралися для зв'язування з бажаним антигеном-мішенню. Термін «людський», так, як він тут застосовується у відношенні до поліпептиду антитіла або до варіабельного домену імуноглобуліну не включає імуноглобулін, який походить від інших видів, наприклад, миші, верблюда, тощо, який був «гуманізований» за допомогою вставки послідовностей константних ділянок людини в поліпептид антитіла (тобто, шляхом заміни константних ділянок не людини на константні ділянки людини) або за допомогою вставки послідовностей каркасних ділянок V домена у варіабельний домен зі ссавця не людини (тобто, шляхом заміни каркасних ділянок V домена не людини на каркасні ділянки людини). Як мінімум, варіабельний домен людини має, щонайменше, 85% подібності амінокислот (включаючи, наприклад, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% або більш високу подібність) з послідовністю варіабельного домена природного імуноглобуліну людини. Термін «домен», у тому значенні, яке тут використовується, означає укладену білкову структуру, яка зберігає свою третинну структуру незалежно від іншої частини білка. Як правило, домени відповідають за певні функціональні властивості білка і, у багатьох випадках, можуть бути додані, вилучені, або перенесені в інші білки без втрати функціональних властивостей частини білка та/або самого домена, яка залишилася. 94213 30 Під терміном «одинарний варіабельний домен імуноглобуліна» мають на увазі укладений поліпептидний домен, який включає послідовність, характерну для варіабельних доменів імуноглобуліну і яка специфічно зв'язує антиген (наприклад, з константою дисоціації 500 нМ або менше). Таким чином, «одинарний варіабельний домен імуноглобуліну» включає повні варіабельні домени антитіла, а також модифіковані варіабельні домени, наприклад, у яких одна або більше з петель були замінені на послідовності, які не є характерними для варіабельних доменів антитіла, або варіабельні домени антитіла, які були вкорочені або включають N- або C-кінцеві подовження, а також укладені фрагменти варіабельних доменів, які зберігають значення константи дисоціації на рівні 500 нМ або менше (наприклад, 450 нМ або менше, 400 нМ або менше, 350 нМ або менше, 300 нМ або менше, 250 нМ або менше, 200 нМ або менше, 150 нМ або менше, 100 нМ або менше) і специфічність до антигену-мішені повнорозмірного домена. Де це необхідно, або у випадку будь-яких сумнівів, правила нумерації та розмежування, установлені Kabat et al. (1991, дивися вище) можуть бути застосовані до варіабельних та константних доменів імуноглобуліну, які згадуються у даному винаході. Поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла у тому значенні, яке тут використовується, означає поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну ссавця, переважно людини, але також включає гризунів (наприклад, як це розкрито в WO00/29004, зміст якого включений у даний винахід у всій своїй повноті як посилання) або VHH dAbs мозоленогих. dAbs мозоленогих є поліпептидами одинарного варіабельного домена, які були отримані від видів, які включають верблюда, ламу, альпаку, дромадера та гуанако, і які включають важкі ланцюги антитіл, що в природі позбавлені легких ланцюгів: VHH. Молекули VHH приблизно в 10 разів менші, ніж молекули IgG, і як одинарні поліпептиди, вони дуже стабільні, витримуючи екстремальні значення рН і температури. Більше того, поліпептиди одинарного варіабельного домена антитіла мозоленогих стійкі до дії протеаз. Антитіла мозоленогих описані, наприклад, в U.S. Pat. Nos. 5,759,808; 5,800,988; 5,840,526; 5,874,541; 6,005,079; та 6,015,695, зміст кожного з яких включений у даний винахід у всій своїй повноті як посилання. Поліпептиди одинарного варіабельного домена VHH антитіла мозоленогих, які є придатними відповідно до даного винаходу, включають клас поліпептидів одинарного варіабельного домена антитіла мозоленогих, який має послідовності, подібні до таких людини, де даний клас характеризується тим, що домени VHH містять амінокислоти із групи, яка складається із гліцину, аланіну, валіну, лейцину, ізолейцину, проліну, фенілаланіну, тірозину, триптофану, метіоніну, серину, треоніну, аспарагіну або глутаміну в положенні 45, такі, наприклад, як L45, і також містять триптофан у положенні 103 відповідно до правила нумерації 31 Кабата. Гуманізовані поліпептиди VHH мозоленогих розглянуті, наприклад, в WO04/041862, вміст якого включений у даний винахід у всій своїй повноті як посилання. Фахівцеві в даній галузі техніки повинно бути зрозумілим, що поліпептиди одинарного варіабельного домена антитіла мозоленогих можуть бути модифіковані відповідно до WO04/041862 (наприклад, шляхом амінокислотних замін у положеннях 45 і 103) для одержання гуманізованих поліпептидів VHH мозоленогих. Даний винахід також включає поліпептиди одинарного варіабельного домена антитіла, які є VHH вусатих акул (акул-няньок). dAbs вусатих акул є поліпептидами одинарного варіабельного домена антитіл вусатих акул, які включають важкі ланцюги антитіл і в природі позбавлені легких ланцюгів: VHH. VHH вусатих акул описані, наприклад, в Greenberg et al. (Nature 374 pp168-173 1995) та U.S. 20050043519. Фраза «поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну» означає не тільки ізольований поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла, але і більш довгі поліпептиди, які включать у себе мономер послідовності поліпептиду одинарного варіабельного домена імуноглобуліну. «Доменне антитіло» або «dAb» є еквівалентом «поліпептиду одинарного варіабельного домена імуноглобуліну» у тому значенні, яке тут використовується. Відносно поліпептиду одинарного варіабельного домена імуноглобуліну, зв'язування антигену, наприклад, CD40L, опосередковане одинарним поліпептидом V домена імуноглобуліну без необхідності комплементарного V домена. Відповідно до даного винаходу, терміни «поліпептид одинарного варіабельного домена антитіла», «одинарний варіабельний домен антитіла» і «одинарний варіабельний домен імуноглобуліну» повинні розглядатися як еквівалентні. У тому значенні, яке тут використовується, фраза «послідовність, характерна для варіабельних доменів імуноглобуліну» означає амінокислотну послідовність, яка є гомологічною протягом 20 або більше, 25 або більше, 30 або більше, 35 або більше, 40 або більше, 45 або більше, 50 або більше розташованих поруч амінокислот, до послідовності, яка включає послідовність варіабельного домена імуноглобуліну. Послідовності, подібні або гомологічні (наприклад, щонайменше, близько 70% ідентичності послідовності) послідовностям, які розкриваються в даному винаході, також є частиною даного винаходу. У деяких втіленнях, ідентичність послідовності на рівні амінокислот може бути близькою до 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або вище. На рівні нуклеїнової кислоти, ідентичність послідовності може бути близькою до 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або вище. Альтернативно цьому, значна ідентичність має місце, коли сегменти нуклеїнової кислоти будуть гібридизуватися в 94213 32 селективних умовах гібридизації (наприклад, у дуже жорстких умовах гібридизації) з комплементарним ланцюгом. Нуклеїнові кислоти можуть бути присутніми у цілих клітинах, у клітинному лізаті, або частково очищеному або по суті очищеному стані. У тому значенні, яке тут використовується, термін «гомологія» або «подібність» означає ступінь, з якою дві послідовності нуклеотидів або амінокислот структурно схожі одна з одною. У тому значенні, яке тут використовується, «подібність» послідовності є мірою ступеня, до якого амінокислотні послідовності мають однакові амінокислотні залишки у відповідних положеннях при вирівнюванні послідовностей. Амінокислоти є подібними одна до одної, якщо їхні бічні ланцюги є подібними. Більш конкретно, «подібними» є амінокислоти, які служать консервативними замінами одна для одної. «Консервативною» заміною є будь-яка заміна, яка має позитивне значення в матриці замін blosum62 (Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Фраза «послідовність А є на n% подібною послідовністі В» означає, що в n% положеннях при оптимальному загальному вирівнюванні послідовностей А та В присутні ідентичні амінокислоти або консервативні заміни. Оптимальне загальне вирівнювання може бути зроблене з використанням наступних параметрів в алгоритмі вирівнювання по Needleman-Wunsch: Для поліпептидів: Матриця замін: blosum62. Функція оцінки проломів (gap scoring function): -A -B*LG, де A=11 (штраф за пролом), B=1 (штраф за довжину пролому) та LG є довжиною пролому. Для послідовностей нуклеотидів: Матриця замін: 10 для збігів, 0 для розбіжностей. Функція оцінки проломів (gap scoring function): -A -B*LG, де A=50 (штраф за пролом), B=3 (штраф за довжину пролому) та LG є довжиною пролому. Типовими консервативними замінами є заміни серед Met, Val, Leu і Ile, серед Ser та Thr; серед залишків Asp, Glu і Asn; серед залишків Gln, Lys та Arg; або ароматичних залишків Phe і Tyr. У тому значенні, яке тут використовується, дві послідовності є «гомологічними» або «подібними» одна одній, якщо вони мають, щонайменше, 70%, 80%, або 85% подібності послідовностей одна до одної, включаючи, наприклад, 90%, 95%, 97%, 99% або навіть 100% подібності послідовностей, коли вирівнювання проводиться з використанням або алгоритму за Needleman-Wunsch, або алгоритму «BLAST 2 sequences», описаного Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. Коли амінокислотні послідовності вирівнюються з використанням алгоритму «BLAST 2 sequences algorithm», матриця Blosum 62 є матрицею за замовчуванням. У тому значенні, яке тут використовується, терміни «інгібувати», «інгібує» або «інгібується» 33 означають зниження даної вимірюваної активності (наприклад, активності зв'язування), щонайменше, на 10% порівняно з контролем. Якщо інгібування є бажаним, таке інгібування переважно становить, щонайменше, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або більше, до 100% включно, тобто повне інгібування або відсутність даної активності. У цьому випадку інгібування зв'язування CD40L з CD40 вимірюється, як описано тут у Прикладі 6. У тому значенні, яке тут використовується, термін «значно інгібує» означає зниження даної вимірюваної активності (наприклад, зв'язування CD40L з CD40), щонайменше, на 50% стосовно контролю. Наприклад, «значно інгібує» означає зниження даної вимірюваної активності, щонайменше, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% і більше до 100% включно порівняно з контролем. У тому значенні, яке тут використовується, «інгібує зв'язування», стосовно зв'язування поліпептиду антитіла, що зв'язується з CD40L, або зв'язування CD40 з CD40L, означає зниження зв'язування, щонайменше, на 10% порівняно з контролем. «Інгібує зв'язування» переважно означає зниження зв'язування, щонайменше, на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або більше, до 100% включно. У тому значенні, яке тут використовується, термін «активувати», «активує», «активується» означає збільшення даної вимірюваної активності, щонайменше, на 5% порівнюючи з контролем, наприклад, щонайменше, на 10%, 25%, 50%, 75% або навіть 100%. У тому значенні, яке тут використовується, термін «антагоніст» відноситься до агента, який інгібує, принаймні, одну активність, опосередковувану CD40L, інгібує зв'язування CD40 з CD40L, та/або призводить не більше ніж до 25% активації та/або агрегації тромбоцитів у системі для вимірювання агрегації тромбоцитів або системі для вимірювання активації тромбоцитів, як тут описано, і переважно призводить до 25% або меншої агрегації та/або активації тромбоцитів, 20% або менше, 15% або менше, 10% або менше, 5% або менше, і не призведе до активації та/або агрегації тромбоцитів. Активність піддається дії «антагоніста», якщо активність (тобто, опосередкована CD40L активність, зв'язування CD40 або CD40L, або агрегація та/або активація тромбоцитів) зменшується, щонайменше, на 10%, і переважно, щонайменше, на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% або навіть 100% (тобто, активність відсутня) у присутності антагоніста, у порівнянні з активністю за його відсутності. Антагоніст, як термін, переважно використовується тут для позначення одинарного варіабельного домена імуноглобуліну, який моновалентно зв'язує CD40L. У тому значенні, яке тут використовується, термін «агоніст» відноситься до агента, який активує, принаймні, одну активність, опосередковувану CD40L, або сам, або якщо він діє разом з іншим ко-стимулятором, у порівнянні з контролем. Активність піддається дії «агоніста», якщо 94213 34 активність збільшується, щонайменше, на 10%, наприклад, на 50%, за умов присутності агоніста, порівняно з його відсутністю. У тому значенні, яке тут використовується, термін «епітоп» відноситься до структурної одиниці, яка зазвичай зв'язується парою імуноглобулінів VH/VL. Епітопи визначають мінімальну зв‟язуючу ділянку для антитіла, і таким чином, є мішенню специфічності антитіла. У випадку одинарного варіабельного домена імуноглобуліну, епітоп є одиницею конформації, яка зв'язується одинарним варіабельним доменом окремо. Таким чином, ділянка зв'язування забезпечується єдиним одинарним варіабельним доменом імуноглобуліну. У тому значенні, яке тут використовується, термін «уповільнене вивільнення» або еквівалентні терміни «контрольоване вивільнення» або «відтерміноване вивільнення» відноситься до такого складу ліків, який вивільняє активні ліки, такі як поліпептидні ліки, протягом певного періоду часу після введення пацієнтові. Уповільнене вивільнення поліпептидних ліків, яке може відбуватися протягом бажаного періоду часу, наприклад, хвилин, годин, днів, тижнів або довше, залежно від складу лікарського препарату, відрізняється від стандартного складу лікарського препарату, при якому значна частина або вся доза є доступною для негайної абсорбції або негайного рознесення кровотоком. Кращі лікарські склади для уповільненого вивільнення забезпечують рівень циркулюючого лікарського засобу після одноразового прийому, який підтримується, наприклад, протягом 8 годин або більше, 12 годин або більше, 24 годин або більше, 36 годин або більше, 48 годин або більше, 60 годин або більше, 72 годин або більше, 84 годин або більше, 96 годин або більше, і навіть, наприклад, протягом 1 тижня або 2 тижнів або більше, наприклад 1 місяця або більше. У тому значенні, яке тут використовується, термін «активність CD40L» означає активність, яка втягує або є результатом зв'язування CD40L з CD40, і яка включає, але цим не обмежується, зв'язування з CD40 (вимірюване, наприклад, відповідно до методу, описаного в Прикладі 6), активацію Jun-N-термінальної кінази (JNK), індукцію продукції та секреції Т-клітинами цитокінів, включаючи, наприклад, IL-10, IFN- та TNF-, і посередництво в активації та/або агрегації тромбоцитів. Способи вимірювання цих активностей наведені нижче. У тому значенні, яке тут використовується, термін «істотно не діє як агоніст» означає, що даний агент, наприклад, поліпептид антитіла проти CD40L, не активує одну або більше з активностей CD40L, включаючи активацію Jun-Nтермінальної кінази (фосфорилювання) у Тклітинах Jurkat і індукцію продукції або секреції IFN- у Т-клітинах Jurkat, стимульованих антитілом проти CD3, у тому значенні терміна «активувати», яке тут визначене. У тому значенні, яке тут використовується, «істотно не діє як агоніст» означає, що агент не активує більше ніж 35 на 20% активність, яка активується при зв'язуванні CD40 з CD40L, бажано, агент не активує більше ніж на 10%, 8%, 5%, 3%, або більше ніж на 2% або менше, включаючи відсутність збільшення активності, яка активується при зв'язуванні CD40 з CD40L. У тому значенні, яке тут використовується, термін «поліпептид антитіла» відноситься до поліпептиду, який або є антитілом, або є частиною антитіла, може бути модифікованим або немодифікованим, котрий зберігає здатність специфічно зв'язувати антиген. Таким чином, термін «поліпептид антитіла» включає антигензв'язуючий важкий ланцюг, легкий ланцюг, димер важкий ланцюг-легкий ланцюг, Fab фрагмент, F(ab')2 фрагмент, dAb або Fv фрагмент, включаючи одноланцюговий Fv (scFv). Фраза «поліпептид антитіла» призначена для позначення рекомбінантних злитих поліпептидів, які включають поліпептидну послідовність, яка зберігає здатність специфічно зв'язувати антиген у складі злитого білка. У тому значенні, яке тут використовується, термін «моновалентний» означає, що даний поліпептид антитіла або поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну може зв'язувати тільки одну молекулу своєї мішені. Природні антитіла звичайно є дивалентними, тому що вони мають дві функціональні антигензв‟язуючі руки, кожна з яких включає VH і VL домени. Коли немає стеричних перешкод, дивалентне антитіло може зв'язувати дві окремі молекули того самого антигену. На відміну від цього, «моновалентне» антитіло здатне зв'язувати тільки одну молекулу цього антигену. У тому значенні, яке тут використовується терміна, «моновалентне» антитіло також може включати більш ніж один антигензв‟язуючий центр, наприклад, два антигензв‟язуючих центри, але ці зв‟язуючі центри повинні бути для різних антигенів, так що антитіло може в цей момент зв'язати тільки одну молекулу CD40L. Антигензв‟язуючий домен моновалентного антитіла може включати VH і VL домени, але бажано щоб він включав тільки одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, тобто, VH або VL домен, який здатний зв'язувати CD40L у відсутність відповідного VL або VH домена, відповідно. Моновалентне антитіло не має здатності зшивати молекули одного антигену. У тому значенні, яке тут використовується, термін «стандартне вимірювання агрегації тромбоцитів» означає метод вимірювання, описаний нижче в секції за назвою «Вимірювання агрегації тромбоцитів». У тому значенні, яке тут використовується, терміни «VH домен» і «VL домен» відносяться до варіабельних ділянок імуноглобуліну, які визначені в роботі Kabat et al. (дивися вище), яка включена в даний винахід як посилання. У тому значенні, яке тут використовується, термін «зв'язаний» відноситься до приєднання полімерного залишку, такого як ПЕГ, до амінокислотного залишку поліпептиду антитіла. Приєднання полімеру ПЕГ до амінокислотного 94213 36 залишку поліпептиду антитіла, наприклад, dAb проти CD40L, називається «ПЕГ-іліюванням» і може бути досягнуте з використанням декількох залишків для приєднання ПЕГ, включаючи, але не обмежуючись цим, активний складний ефір Nгідроксилсукциніміду (NHS), сукцинімідилпропіонат (SPA), малеімід (MAL), вінілсульфон (VS) або тіол. Полімер ПЕГ або інший полімер можуть бути пов'язані з поліпептидом антитіла або в заздалегідь визначеному положенні, або випадковим чином пов'язані з молекулою поліпептиду антитіла. Однак є бажаним, щоб полімер ПЕГ був пов'язаний з поліпептидом антитіла в заздалегідь визначеному положенні. Полімер ПЕГ може бути пов'язаний з будь-яким залишком у поліпептиді антитіла, однак є бажаним, щоб полімер був зв'язаний або з лізином, або із цистеїном, які або від початку присутні в поліпептиді антитіла, або можуть бути уведеними в поліпептид антитіла, наприклад, шляхом заміни початково присутнього в поліпептиді антитіла залишку або на цистеін, або на лізин. Приєднання ПЕГ також може бути опосередковане через пептидний лінкер, злитий з поліпептидом антитіла. Таким чином, залишок ПЕГ може бути приєднаний до пептидного лінкеру, злитого з поліпептидом антитіла, де лінкер забезпечує сайт, наприклад, вільний цистеін або лізин, для приєднання ПЕГ. У тому значенні, яке тут використовується, термін «зв'язаний» також відноситься до об'єднання двох або більше поліпептидів антитіла, наприклад, мономерів dAb для одержання димерів, тримерів, тетрамерів або інших мультимерів. Мономери поліпептидів антитіла можуть бути зв'язані для одержання мультимера у різні способи, відомі фахівцям у даній галузіі техніки, включаючи, але не обмежуючись цим, експресією мономерів поліпептидів антитіла у вигляді злитого білка, об'єднанням двох або більше мономерів через пептидний лінкер між мономерами, або хімічним зшиванням мономерів після трансляції або безпосередньо один до одного, або через лінкер за рахунок дисульфідних зв'язків, або шляхом пришивання до ди-, три- або мультивалентного зв‟язуючого залишку (наприклад, до багатоланцюгового ПЕГ). Коли мультимери dAb тут заздалегідь спеціально розробляються, наприклад, у випадку поліпептидних конструкцій антитіл з подвійною специфічністю або мультиспецифічних антитіл, спеціально підкреслюється, що для будь-якої даної конструкції поліпептидів антитіла, конструкція повинна зв'язувати тільки одну молекулу CD40L, тобто конструкції можуть мати тільки один CD40 L-зв‟язуючий елемент і не повинні зшивати CD40L між собою. У тому значенні, яке тут використовується, термін «полімер» відноситься до макромолекули, побудованої з повторюваних мономерних одиниць, і може відноситися до синтетичного або природного полімеру, такого як необов'язково заміщений лінійний або розгалужений полімер поліалкілену, поліалкенілену або поліоксиалкілену або лінійний або розгалужений 37 полісахарид. У тому значенні, яке тут використовується, термін «полімер» специфічно відноситься до не обов'язково заміщеного або розгалуженого поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю або полівінілалкоголю та їхніх похідних. У тому значенні, яке тут використовується, «ПЕГ» або «полімер ПЕГ» відноситься до поліетиленгліколю, і більш спеціально може відноситися до похідних ПЕГ, включаючи, але ними не обмежуючись, активні ефіри Nгідроксилсукциніміду (NHS) ПЕГ, такі як сукцинімідилпропіонат, активні складні ефіри бензотриазолу, похідні ПЕГ із приєднаним 94213 38 малеімідом, вінілсульфонами або тіоловими групами. Конкретні види ПЕГ можуть включати ПЕГO-CH2CH2CH2-CO2-NHS; ПЕГ-O-CH2-NHS; ПЕГ-OCH2CH2-CO2-NHS; ПЕГ-S-CH2CH2-CO-NHS; ПЕГO2CNH-CH(R)-CO2-NHS; ПЕГ-NHCO-CH2CH2-CONHS; та ПЕГ-O-CH2-CO2-NHS; де R є (CH2)4)NHCO2(mПЕГ). Придатні для даного винаходу полімери ПЕГ можуть бути лінійними молекулами або бути розгалуженими, де множинні залишки ПЕГ представлені у вигляді одного полімеру. Деякі особливо бажані конформації ПЕГ, які придатні для даного винаходу, включають, але не обмежуються, наступними: 39 94213 40 41 У тому значенні, яке тут використовується, «тіол-селективний реагент» є реагентом, який є придатним для приєднання полімеру ПЕГ до тіолвмісної амінокислоти. Тіолові групи амінокислотного залишку цистеіну є особливо придатними для взаємодії з тіол-селективними реагентами. Тіол-селективні реагенти, які є придатними для такого приєднання, включають, але ними не обмежуються, малеімід, вінілсульфон та тіол. Використання тіол-селективних реагентів для приєднання за залишками цистеіну відомо фахівцям у даній галузі техніки та може бути адаптовано, як це необхідно відповідно до даного винаходу (дивися, наприклад Zalipsky, 1995, Bioconjug. Chem. 6:150; Greenwald et al., 2000, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101; Herman et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195:203). Приєднання ПЕГ або іншого агента, наприклад, HAS, до поліпептиду антитіла або до поліпептиду одинарного варіабельного домена імуноглобуліну, як тут описано, бажано не повинно знижувати здатність поліпептиду специфічно зв'язувати CD40L. Таким чином, пов'язаний з ПЕГ поліпептид антитіла або поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну буде зберігати свою зв‟язуючу активність у порівнянні з не пов'язаним з ПЕГ аналогом. У тому значенні, яке тут використовується «зберігати активність» відноситься до такого рівня активності пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла, який становить, щонайменше, 10% від рівня активності не пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла, бажано, щонайменше, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% та до 90%, переважно до 95%, 98%, і до 100 % від активності не пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла, який включає такий же антигензв‟язуючий домен або домени. Більш точно, активність пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла у порівнянні з не пов'язаним з ПЕГ варіабельним доменом антитіла повинна визначатися на основі молярної концентрації поліпептиду антитіла, тобто в кожному вимірюванні повинна використовуватися еквівалентна кількість молів кожного з пов'язаного з ПЕГ і не пов'язаного з ПЕГ поліпептидів антитіла. При визначенні, чи «зберігає» конкретний пов'язаний з ПЕГ поліпептид антитіла свою активність, бажано, щоб активність цього пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла рівнялася з активністю того ж поліпептиду антитіла при відсутності ПЕГ. У тому значенні, яке тут використовується, термін «час напівжиття in vivo» означає час, необхідний для того, щоб концентрація ліганда (наприклад, одинарного варіабельного домена імуноглобуліну) у сироватці крові знизилася на 50% in vivo, наприклад, за рахунок деградації ліганда та/або кліренсу або захоплення ліганда через природні механізми. Поліпептиди антитіла проти CD40L або поліпептиди одинарного варіабельного домена імуноглобуліну, описані тут, можуть бути стабілізовані in vivo і час їхнього напівжиття буде збільшено за рахунок зв'язування з молекулами, такими як ПЕГ, які 94213 42 перешкоджають деградації та/або кліренсу або захопленню. Час напівжиття поліпептиду антитіла є збільшеним, якщо його функціональна активність зберігається in vivo протягом більш тривалого періоду часу в порівнянні з тим же поліпептидом антитіла, який не пов'язаний з полімером ПЕГ. Як правило, час напівжиття поліпептиду антитіла, пов'язаного з ПЕГ, збільшується на 10%, 20%, 30%, 40%, 50% або більше в порівнянні з поліпептидом антитіла, не пов'язаним з ПЕГ. Збільшення часу напівжиття в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 або більше разів також можливо. Альтернативно цьому або додатково, час напівжиття може бути збільшений у 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 разів. Відповідно до даного винаходу, пов'язаний з ПЕГ одинарний варіабельний домен антитіла має час напівжиття в діапазоні від 0,25 до 170 годин, бажано в діапазоні від 1 до 100 годин, ще краще, у діапазоні від 30 до 100 годин, а найкраще, у діапазоні від 50 до 100 годин, і до 170, 180, 190 і 200 годин або більше. У тому значенні, яке тут використовується, «стійкий до деградації» або «є стійким до деградації» у відношенні пов'язаного з ПЕГ або з іншим полімером мономера або мультимера поліпептиду антитіла означає, що мономер або мультимер поліпептиду антитіла, пов'язаний з ПЕГ або іншим полімером, деградує не більше, ніж на 10%, при експозиції з пепсином при рН 2,0 протягом 30 хв, і переважно зовсім не деградує. У тому значенні, яке тут використовується «гідродинамічний розмір» відноситься до здогадного розміру молекули (наприклад, молекули білка) на основі швидкості дифузії молекули у водному розчині. Дифузія або рух білка крізь розчин може використовуватися для розрахунку розміру білка, де розмір дається як «радіус Стокса» або «гідродинамічний радіус» частки білка. «Гідродинамічний розмір» білка залежить як від маси, так і від форми (конформації), так що два білки, які мають однакову молекулярну масу, можуть мати різні гідродинамічні розміри через розходження в загальній конформації білків. Гідродинамічний розмір вимірюється, наприклад, методом ексклюзійної хроматографії (гельфільтрації). Гідродинамічний розмір пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла, наприклад, одинарного варіабельного домена імуноглобуліну (включаючи описані тут мультимери варіабельного домена антитіла) може перебувати в діапазоні від 24 кДа до 500 кДа; від 30 до 500 кДа; від 40 до 500 кДа; від 50 до 500 кДа; від 100 до 500 кДа; від 150 до 500 кДа; від 200 до 500 кДа; від 250 до 500 кДа; від 300 до 500 кДа; від 350 до 500 кДа; від 400 до 500 кДа та від 450 до 500 кДа. Бажано, щоб гідродинамічний розмір пов'язаного з ПЕГ поліпептиду антитіла даного винаходу становить від 30 до 40 кДа; від 70 до 80 кДа або від 200 до 300 кДа. Якщо поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну призначений для застосування в одержанні зображень, поліпептид повинен мати гідродинамічний розмір у діапазоні від 50 до 100 кДа. Альтернативно 43 цьому, якщо поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну призначений для терапевтичного застосування, поліпептид повинен мати гідродинамічний розмір більший, ніж 200 кДа. У тому значенні, яке тут використовується, термін «IC50» відноситься до концентрації інгібітору, необхідної для інгібування даної активності на 50%. Значення IC50 визначається в середовищі вимірювання даної активності, наприклад, вимірювання зв'язування CD40L з CD40 у присутності різних кількостей інгібітору (наприклад, моновалентного поліпептиду антитіла проти CD40L), і побудови графіка залежності вимірюваної активності-мішені від концентрації інгібітору. Зв'язування CD40L з CD40 вимірюється, як описано в Прикладі 6. Альтернативно цьому, може використовуватися SPR. У тому значенні, яке тут використовується, термін «злитий з поліпептидом антитіла» означає, що поліпептид злитий з даним антитілом з використанням техніки рекомбінантних ДНК. Таким чином, антитіла, «злитого» з іншим поліпептидом, наприклад, з іншим антитілом з іншою специфічністю зв'язування, у природі не існує, воно отримане за допомогою рекомбінантної техніки. Термін «злитий з поліпептидом антитіла» також позначає приєднання поліпептиду до даного антитіла через, наприклад, дисульфідні або інші хімічні зв'язки, де злитий поліпептид у злитому вигляді з поліпептидом антитіла в природі не виявляється. Рекомбінантні та хімічні методи пришивання одного поліпептиду до іншого добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. У тому значенні, яке тут використовується, термін «Fc домен» відноситься до константної ділянки послідовностей антитіл, які включають СН2 і СН3 константні домени, які визначаються згідно Kabat et al., дивися вище. Ділянка Fc поліпептиду важкого ланцюга має здатність до самоасоціації, ця функція сприяє утворенню дивалентних антитіл. Термін «відсутність Fc домена» означає, що даний поліпептид антитіла позбавлений, щонайменше, частини домена Fc імуноглобуліну (за визначенням даних доменів згідно Kabat et al., дивися вище), достатньої для опосередкування димеризації Fc-вмісних поліпептидів антитіл. Димеризація Fc-вмісних поліпептидів антитіл визначається, наприклад, хроматографічними методами або за допомогою поверхневого плазмонного резонансу. Поліпептид антитіла, позбавлений домена Fc, не бере участі у взаємодії Fc із тромбоцитами й, отже, не індукує агрегації тромбоцитів. У тому значенні, яке тут використовується «лікувати», «знижувати», «запобігати» або «полегшувати» стосовно симптому захворювання слід розуміти як зниження прояву симптому, щонайменше, на 10% виходячи з показника клінічновимірюваного параметра, або, щонайменше, на один пункт у клінічно-застосовної шкали захворювання або тяжкості симптому. У тому значенні, яке тут використовується, термін «симптом системного червоного вовчака» відноситься до кож 94213 44 ного із клінічно значимих симптомів SLE, відомих фахівцям у даній галузі техніки. Приклади, які не є обмежуючими, включають акумуляцію аутоантитіл IgG (наприклад, проти ядерних антигенів, таких як хроматин, snРНК (особливо U1, Sm, Ro/SSA і La/SSB), фосфоліпідів і молекул клітинної поверхні), гемолітичну анемію, тромбоцитопенію, лейкопенію, гломерулонефрит, васкуліт, артрит та серозит. Зниження проявів такого симптому є зниженням, щонайменше, на 10% клінічно вимірюваного параметра, або, щонайменше, на один пункт у клінічно-застосовній шкалі тяжкості захворювання. У тому значенні, яке тут використовується, фраза «специфічно зв'язує» відноситься до зв'язування антигену варіабельним доменом імуноглобуліну з константою дисоціації (Кд) 1 мкМ або нижчою, при вимірюванні методом поверхневого плазмонного резонансу з використанням, наприклад, системи поверхневого плазмонного резонансу BIAcore і програмного забезпечення для кінетичних вимірювань BIAcore (наприклад, версія 2.1). Спорідненість або Кд для специфічного зв'язування, бажано, становить близько 500 нМ або менше, а ще краще, близько 300 нМ або менше. У тому значенні, яке тут використовується «спільний ліганд» є лігандом, який зв'язує значну частину функціональних членів даного репертуару, наприклад, бібліотеки фагового дисплея. Таким чином, той самий спільний ліганд може зв'язувати велику кількість членів даного репертуару, незалежно від їхньої специфічності відносно лігандів-мішеней. Як правило, наявність зв‟язуючої ділянки функціонального спільного ліганда вказує на те, що члени даного репертуару правильно експресуються та згортаються. Таким чином, зв'язування спільного ліганда з його ділянкою зв'язування забезпечує метод попередньої селекції поліпептидів з репертуару поліпептидів. Спільні ліганди включають, наприклад, Протеїн А, Протеїн G і Протеїн L. У тому значенні, яке тут використовується, термін «універсальний каркас» відноситься до послідовності каркасної ділянки одинарного антитіла, яка відповідає консервативним ділянкам у послідовності антитіла, за визначенням, згідно Kabat (дивися вище), або відповідної послідовності імуноглобуліну зародкової лінії людини, або структурі яку визначено Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. Даний винахід надає застосування одинарної каркасної ділянки, або репертуару таких каркасних ділянок, які забезпечують одержання практично будь-якої специфічності зв'язування за рахунок змін тільки в гіперваріабельних ділянках. Короткий опис рисунків Фіг. 1 демонструє дані аналізу з використанням гель-електрофореза якості біотин-міченого CD40L, використаного в процедурах скринінгу, описаних тут. (а) 1 мкг не-біотинільованого CD40L (Доріжка 1) і 0,3 мкг біотинільованого CD40L (Доріжка 2) були проаналізовані електрофорезом у поліакриламідному гелі в присутності SDS (SDS-PAGE) та профарбовані за допомогою 45 Simply Blue Safe-Stain. (b) 0,1 мкг біотин- CD40L (Доріжка 1) та 0,02 мкг біотин-CD40L (Доріжка 2) були виявлені методом Вестерн-блотингу з використанням Стрептавідин- HRP у розведенні 1:5000. Фіг. 2 демонструє графічне подання даних концентраційної залежності вимірювання зв'язування рецептора (receptor binding assay (RBA)) при аналізі інгібування зв'язування CD40L з CD40-Fc антитілами dAbs DOM-10, -20, -27, -30, -31, -62, -77, при титруванні від 10 мкМ до 10 пМ. Антитіла dAbs DOM-20, -30, та -31 є найбільш сильнодіючими зі значеннями IC50 приблизно 8 нМ. Фіг. 3 демонструє графічне подання даних концентраційної залежності вимірювання зв'язування рецептора при аналізі інгібування зв'язування CD40L з CD40-Fc антитілами dAbs DOM-4 та DOM-5, при титруванні від 1 мкМ до 500 пМ. Значення IC50 для DOM-5 і DOM-4 становлять приблизно 3 нМ та 100 нМ відповідно. Фіг. 4 демонструє графічне подання даних концентраційної залежності вимірювання зв'язування рецептора при аналізі інгібування зв'язування CD40L з CD40-Fc антитілом dAbs DOM-24, при титруванні від 100 нМ до 0,5 пМ. Дані апроксимували кривою з використанням програмного забезпечення GraphPad Prism. Фіг. 5 показує послідовність каркасної ділянки VH на основі послідовності зародкової лінії DP47 JH4b (SEQ ID NO: 1, амінокислотна послідовність; SEQ ID NO: 2, нуклеотидна послідовність - показані обидва, смисловий та анти-смисловий ланцюги - SEQ ID NO: 2 є верхнім ланцюгом (смисловий) та SEQ ID NO: 476 є нижнім ланцюгом (анти-смисловий)). HCDRs 1-3 відзначені підкресленням. Фіг. 6 показує послідовність каркасної ділянки Vκ на основі послідовності зародкової лінії DPΚ9 JΚ1 (SEQ ID NO: 3, амінокислотна послідовність; SEQ ID NO: 4, нуклеотидна послідовність показані обидві смисловий та анти-смисловий ланцюги - SEQ ID NO: 4 є верхнім ланцюгом (смисловий ) та SEQ ID NO: 477 є нижнім ланцюгом (анти-смисловий )). LCDRs 1-3 відзначені підкресленням. Фіг. 7 схематично показує систему для аналізу зв'язування CD40L, використану тут, наприклад, у Прикладі 6. Фіг. 8 показує кодуючі послідовності для різних сигнальних пептидів секреції GAS1. GAS дикого типу: Природна послідовність, яка зустрічається в дріжджах. GAS Е. coli: Нуклеотидна послідовність, яка відповідає оптимальному використанню кодонів Е. coli (Wada et al. 1992 NAR 20 p 2111). GAS лідерна АТ: багата на АТ нуклеотидна послідовність. Всі нуклеотидні послідовності кодують однакові амінокислотні послідовності. Жовтим кольором (ясно-сірим на чорно-білому малюнку) відзначені нуклеотиди, які є однаковими для всіх послідовностей. Блакитним кольором (темно-сірим на чорно-білому малюнку) відзначені нуклеотиди, такі ж, як у послідовності дикого типу. Білим кольором (білим на чорно-білому малюнку) відзначені нуклеотиди, 94213 46 які відрізняються від нуклеотидів послідовності дикого типу. Фіг. 9 показує результати аналізу зв'язування рецептора, які демонструють спорідненість зв'язаного з ПЕГ DOM8-24cys, або для 30К ПЕГ MAL, або для 40K ПЕГ2-MAL. Фіг. 10 показує результати вимірювання одночасного зв'язування подвійного специфічного димера з HSA і CD40L (затінені стовпчики). Показане також зв'язування з контрольним антигеном BSA (суцільні стовпчики). Фіг. 11 показує результати вимірювання одночасного зв'язування подвійного специфічного Fab з HSA і CD40L (затінені стовпчики). Показане також зв'язування з контрольним антигеном порошку знежиреного молока (суцільні стовпчики). Фіг. 12 показує результати FACS аналізу інгібіторної дії мономерного DOM-24 (сіра пунктирна лінія). Контрольні стимульовані клітини показані у вигляді суцільної чорної лінії та контрольне dAb показано у вигляді суцільної сірої лінії. Фіг. 13 показує результати FACS аналізу інгібіторної дії V(dAb DOM-116 (пунктирна лінія). Контрольні стимульовані клітини показані у вигляді суцільної чорної лінії та контрольне dAb показано у вигляді суцільної сірої лінії. Здійснення винаходу Даний винахід надає поліпептиди антитіла, які є моновалентними для зв'язування CD40L. Моновалентність для зв'язування CD40L усуває можливість перехресного зв'язування, що є характерним для відомих раніше антитіл, і яке призводить до небажаних побічних ефектів, які спостерігаються з моноклональними антитілами проти CD40L. Більше того, не бажаючи бути обмеженим яким-небудь специфічним механізмом або теорією, оскільки поліпептиди антитіла, моновалентні у відношенні CD40L, не призводять до зшивання CD40L, усувається можливість того, що зшиті один з одним CD40L можуть у свою чергу зшивати CD40 на клітинній поверхні та призводити до активації сигнальної активності CD40. Таким чином, у кращому аспекті, антитіла проти CD40L, які розкриваються у даному винаході, не тільки інгібують або виступають як антагоністи зв'язування CD40L з CD40, вони в значній мірі не виступають у якості агоністів активності CD40 та/або CD40L. В одному аспекті, антитіла, моновалентні відносно зв'язування CD40L, є поліпептидами антитіл людини. Поліпептиди антитіл людини можуть прийматися пацієнтами-людьми без побоювання значної імунної відповіді проти антитіл, яка часто виникає при застосуванні антитіл інших видів тварин, наприклад, мишачих. Хоча мишачі антитіла можуть бути «гуманізовані» шляхом введення константних доменів антитіл людини в мишачі антигензв‟язуючі домени, антитіла людини, які розкриваються тут, виробляються без необхідності трудомістких і генетичних маніпуляцій з послідовностями мишачих антитіл, які віднімають багато часу. Моновалентні поліпептиди антитіла: Поліпептиди важких і легких ланцюгів антитіл 47 включають варіабельні (V) ділянки, які безпосередньо беруть участь у взаємодії з антигеном, та константні (С) ділянки, які забезпечують структурну підтримку та беруть участь в антигеннеспецифічних взаємодіях з імунними ефекторами. Антигензв‟язуючий домен звичайного антитіла складається із двох окремих доменів: варіабельного домена важкого ланцюга (VH) та варіабельного домена легкого ланцюга (VL: який може бути або V, або V). Сам антигензв‟язуючий центр утворений шістьма поліпептидними петлями: трьома з домена VH (H1, H2 і H3) і трьома з домена VL (L1, L2 і L3). In vivo продукується різноманітний первинний репертуар генів V, які кодують домени VH і VL, за рахунок комбінаторної перебудови сегментів генів. Ділянки С включають ділянки С легких ланцюгів (позначаються як CL ділянки) та ділянки С важких ланцюгів (позначаються як CH1, CH2 і CH3 ділянки). Природне антитіло звичайно включає два антигензв‟язуючих домена і, таким чином, є дивалентним. Після розщеплення протеазами було ідентифіковано велику кількість більш дрібних антигензв‟язуючих фрагментів природних антитіл. Такі фрагменти включають, наприклад, «Fab фрагмент» (VL-CL-CH1-VH), «Fab‟ фрагмент» (Fab фрагмент із шарнірною ділянкою важкого ланцюга), і «F(ab‟)2 фрагмент» (димер Fab‟ фрагментів, з'єднаних шарнірною ділянкою важкого ланцюга). Для одержання таких фрагментів використовувалися рекомбінантні методи, які дозволили одержати навіть більш дрібні антигензв‟язуючі фрагменти, наприклад, такі, як, так звані, «одноланцюговий Fv» (варіабельний фрагмент) або «scFv», який складається з VL і VH, з'єднаних синтетичним пептидним лінкером (VLЛінкер-VH). Fab фрагменти, Fab‟ фрагменти та scFv фрагменти є моновалентними стосовно зв'язування антигену, тому що кожний з них включає тільки один антигензв‟язуючий домен, який включає димер VH/VL. Ще більш дрібними фрагментами моновалентних антитіл є «доменні антитіла» або «dAbs», які включають тільки одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, наприклад, VH або VL, який сам специфічно зв'язує антиген, тобто без необхідності участі комплементарного VL або VH домена відповідно. Термін «dAb» буде означати тут поліпептид одинарного варіабельного домена імуноглобуліну (VH або VL), який специфічно зв'язує антиген. «dAb» зв'язує антиген незалежно від інших V доменів, однак «dAb» може бути присутнім у складі гомо- або гетеромультимера з іншими VH або VL доменами, де інші домени не є необхідними для зв'язування антигену dAb, тобто, де dAb зв'язує антиген незалежно від додаткових VH або VL доменів. Одержання одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну описано в наведених нижче Прикладах. Моновалентні пептиди антитіла можуть бути отримані декількома різними шляхами. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує важкі та легкі ланцюги антитіла, яке зв'язує CD40L, може бути перебудована таким чином, 94213 48 щоб одержати репертуар різних поліпептидів антитіла, які є моновалентними щодо зв'язування CD40L. Таким чином, одержавши послідовності, які кодують поліпептиди важкого та легкого ланцюгів, які складають антитіло, використовуючи стандартні методи молекулярного клонування, можна створити такі моновалентні антигензв‟язуючі конструкції, як Fab фрагменти, scFv, dAbs або навіть біспецифічні антитіла (тобто антитіла, які включають дві різні антигензв‟язуючі ділянки та можуть, таким чином, зв'язувати два різних антигени, бажано, одночасно), і які є моновалентними щодо CD40L. Таким чином, одержання моновалентних поліпептидів антитіла, специфічних у відношенні CD40L, означає ампліфікацію та експресію VH та VL ділянок ізольованих послідовностей генів важкого та легкого ланцюгів, наприклад, з гібрідоми (наприклад, з мишачої гібрідоми), яка експресує моноклональне антитіло проти CD40L. Границі VH і VL доменів зазначені в роботі Kabat et al. (1991, дивися вище). Інформація відносно границь VH і VL доменів генів важкого та легкого ланцюгів використовується для створення ПЦР-праймерів для ампліфікації V домена з важкого або легкого ланцюга, що кодує послідовність антитіла, яке зв'язує CD40L. Ампліфіковані V домени вставляються в придатний експресійний вектор, наприклад, pHEN-1 (Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137), і експресуються, наприклад, як злиті VH і VL у складі scFv або в іншій придатній моновалентній формі. Потім проводиться скринінг отриманих поліпептидів для виявлення високої спорідненості відносно зв'язування CD40L. Для всіх аспектів даного винаходу скринінг відносно зв'язування проводиться методами, добре відомими фахівцям у даній галузі техніки, або так, як описано нижче. Альтернативно цьому, можуть використовуватися методи скринінгу бібліотек для ідентифікації моновалентних білків, специфічних щодо зв'язування CD40L. Технологія фазового дисплея (дивися, наприклад, Smith, 1985, Science 228: 1315; Scott & Smith, 1990, Science 249: 386; McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552) надає підхід до селекції поліпептидів антитіла, які зв'язуються з бажаною мішенню, серед широкого та різноманітного репертуару поліпептидів антитіла. Такі фагові бібліотеки антитіл можуть бути згруповані у дві категорії: природні бібліотеки, які використовують перебудовані V гени, отримані з В клітин людини (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech., 14: 309), або синтетичні бібліотеки, у яких сегменти V гена зародкової лінії або кодуючих послідовностей інших поліпептидів антитіл «перебудовані» in vitro (Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim et al., 1994, EMBO J., 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al., 1995, J. Mol. Biol., 248: 97), або де синтетичні CDRs включені до одинарного перебудованого V гену (Barbas et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Методи, які включають використання пакетів генетичного дисплея (наприклад, фаговий дисплей, 49 полісомний дисплей), добре підходять для селекції моновалентних специфічних конструкцій антитіла проти CD40L, оскільки вони зазвичай експресують тільки моновалентні фрагменти, а не цілі дивалентні антитіла, у пакетах дисплея. Методи одержання бібліотек фагового дисплея, які містять різні фрагменти антитіл, описані в наведених вище публікаціях. Такі методи також описані, наприклад, в U.S. Patent No. 6,696,245, що включається до даного винахіду як посилання. Метод, описаний у патенті „245 зазвичай включає рандомізацію обраних ділянок кодуючих послідовностей гена імуноглобуліну, зокрема VH і VL кодуючих ділянок, і залишає інші ділянки нерандомізованими (дивися нижче). Патент „245 також описує одержання scFv конструкцій, які включають індивідуально рандомізовані VH і VL домени. Ген VH продукується шляхом рекомбінації трьох сегментів гена, VH, D та JH. У людини є приблизно 51 функціональний сегмент VH (Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25 функціональних сегментів D (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol. 268: 69) та 6 функціональних сегментів JH (Ravetch et al. (1981) Cell 27: 583), залежно від галотипу. Сегмент VH кодує ділянку поліпептидного ланцюга, яка формує першу та другу антигензв‟язуючі петлі VH домена (H1 і H2), тоді як сегменти D і JH поєднуються для утворення третьої антигензв‟язуючої петлі VH домена (Н3). Ген VL продукується шляхом рекомбінації тільки двох сегментів гена, VL і JL. У людини є приблизно 40 функціональних сегментів V (Schäble and Zachau (1993) Biol. Chem. HoppeSeyler 374: 1001), 31 функціональний сегмент V (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7: 250), 5 функціональних сегментів J (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516) та 4 функціональних сегменти J (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609), залежно від галотипу. Сегмент VL кодує ділянку поліпептидного ланцюга, яка формує першу та другу антигензв‟язуючі петлі VL домена (L1 і L2), тоді як сегменти VL і JL поєднуються для утворення третьої антигензв‟язуючої петлі VL домена (L3). Можна сподіватися, що антитіла, обрані із цього первинного репертуару, будуть досить різноманітні, щоб зв'язувати майже всі антигени, принаймні, з помірною спорідненістю. Антитіла з високою спорідненістю одержують in vivo шляхом «дозрівання спорідненості» перебудованих генів, у яких створюються точкові мутації та імунна система проводить добір на основі поліпшеного зв'язування. Аналіз структур і послідовностей антитіл показав, що п'ять із шести антигензв‟язуючих петель (H1, H2, L1, L2, L3) демонструють обмежений репертуар конформацій або канонічних структур основного ланцюга (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877). Конформації основного ланцюга визначаються: (i) довжиною антигензв‟язуючої петлі та (ii) певними залишками, або типами залишків у певних ключових положеннях анти 94213 50 гензв‟язуючої петлі або каркасної ділянки антитіла. Аналіз довжини петель і ключових залишків зробив можливим передбачення конформацій основного ланцюга H1, H2, L1, L2 і L3, які кодуються більшістю послідовностей антитіл людини (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220). Хоча ділянка Н3 є більш різноманітною у плані послідовності, довжини та конформації (через використання D сегмента), вона також формує обмежений репертуар конформацій основного ланцюга для коротких петель, залежно від довжини та присутності певних залишків або типів залишків у ключових положеннях петлі та каркасної ділянки антитіла (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399: 1). Хоча в одному з підходів різноманітність може бути додана в синтетичний репертуар у будьякій ділянці в CDRs різних антигензв‟язуючих петель, цей підхід призводить до більшої пропорції V доменів, які згортаються неправильно і, таким чином, забезпечує меншу пропорцію молекул, які здатні зв'язувати антиген. Розуміння ролі залишків, які вносять основний внесок у конформацію основного ланцюга антигензв‟язуючих петель, дозволяє ідентифікувати специфічні залишки для внесення різноманітності в синтетичний репертуар VH або VL доменів. Таким чином, найкраще вносити різноманітність у залишки, які не є істотними для підтримки конформації основного ланцюга. Наприклад, для модифікації петлі L2 стандартним підходом є зміна всіх залишків у відповідній ділянці CDR (CDR2), як визначається за Kabat et al. (1991, дивися вище), тобто всіх семи залишків. Однак для петлі L2 відомо, що положення 50 і 53 відрізняються в природних антитілах, і що вони забезпечують контакт із антигеном. Кращим підходом була б зміна тільки цих двох залишків у даній петлі. Це забезпечує значне поліпшення в плані функціональної різноманітності, необхідної для створення репертуару антигензв‟язуючих ділянок з різною специфічністю. Бібліотеки поліпептидів імуноглобулінів можуть переважно створюватися на базі попередньо встановленої конформації основного ланцюга варіабельного домена. Такі бібліотеки можуть бути створені, як описано в заявці International Patent Application WO 99/20749, зміст якої включається до даного винахіду як посилання. Таким чином, в одному аспекті поліпептид антитіла включає амінокислотну послідовність даної V ділянки сегмента гена зародкової лінії людини, наприклад, VH сегмента гена зародкової лінії DP-47, або V сегмента гена зародкової лінії DPK9. Такі поліпептиди варіабельної ділянки можуть застосовуватися для одержання scFvs або Fabs, наприклад scFv або Fab, які включають (i) варіабельний домен важкого ланцюга антитіла (VH), або його антигензв‟язуючий фрагмент, який включає амінокислотну послідовність VH сегмента зародкової лінії DP-47, та (ii) варіабельний домен легкого ланцюга антитіла (V), або його 51 антигензв‟язуючий фрагмент, який включає амінокислотну послідовність V сегмента зародкової лінії DPK9. Модифікація послідовностей у контексті обраних сегментів гена важкого та легкого ланцюгів зародкової лінії, наприклад DP-47, DPK 9, DP45, DP38 і т.д., може дозволити створити репертуар різних кодуючих послідовностей імуноглобуліну. Один з підходів описаний нижче в контексті створення бібліотеки модифікованих послідовностей dAb або scFv. Ці поліпептиди варіабельної ділянки можуть також експресуватися у вигляді dAbs і піддаватися скринінгу для виявлення високої спорідненості щодо CD40L. Репертуар може клонуватися в, або включатися у вектор, який підходить для фагового дисплея, наприклад, вектор дисплея на основі фага лямбда або ниткоподібний бактеріофаг, і потім піддаватися скринінгу за зв'язуванням з даним антигеном-мішенню, наприклад, CD40L. Приготування поліпептидів одинарного варіабельного домена імуноглобуліну Одинарний варіабельний домен імуноглобуліну є поліпептидним доменом з певною укладкою, який включає послідовності, характерні для варіабельних доменів імуноглобуліну, і який специфічно зв'язує антиген (наприклад, з константою дисоціації 500 нМ або менше), і який зв'язує антиген як одинарний варіабельний домен, тобто, є одна зв‟язуюча ділянка, яка забезпечується одинарним варіабельним доменом імуноглобуліну без будьякого іншого комплементарного варіабельного домена. Таким чином, одинарний варіабельний домен імуноглобуліну включає повні варіабельні домени антитіла, а також модифіковані варіабельні домени, наприклад, у яких одна або більше з петель замінені на послідовності, що не є характерними для варіабельних доменів антитіла, або варіабельні домени антитіла, які були вкорочені або включають N- або С-кінцеві подовження, а також фрагменти варіабельних доменів з певною укладкою, які зберігають значення константи дисоціації 500 нМ або менше (наприклад, 450 нМ або менше, 400 нМ або менше, 350 нМ або менше, 300 нМ або менше, 250 нМ або менше, 200 нМ або менше, 150 нМ або менше, 100 нМ або менше) і специфічність відносно антигену-мішені повнорозмірного домена. Бажано, одинарний варіабельний домен антитіла, який застосовується у даному винаході, обирається із групи VH і VL, включаючи Vkappa і Vlambda. Бажано також, щоб одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який застосовується у даному винаході, був би доменом імуноглобуліну людини, відповідно до прийнятої тут термінології. Приготування одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну Одинарні варіабельні домени імуноглобуліну можуть бути отримані різними способами. Для кожного із цих підходів можуть бути застосовані добре відомі методи одержання (наприклад, ампліфікація, мутація, тощо.) і маніпулювання з послідовностями нуклеїнових кислот. Одним зі способів одержання одинарних 94213 52 варіабельних доменів імуноглобуліну є ампліфікація та експресія VH або VL ділянок гена важкого ланцюга або легкого ланцюга для клонованого антитіла, для якого відомо, що воно зв'язує бажаний антиген. Таким чином, VH або VL домен кодуючої ділянки, відомого антитіла проти CD40L може бути ампліфікований та експресований як одинарний домен (або як злитий одинарний домен) і охарактеризований за зв'язуванням CD40L. Границі VH і VL доменів визначені в роботі Kabat et al. (1991, дивися вище). Інформація щодо границь VH і VL доменів генів важкого та легкого ланцюгів використовується для створення ПЦР-праймерів, які застосовуються для ампліфікації V домена з кодуючої послідовності, клонованого важкого або легкого ланцюга, який кодує антитіло, про яке відомо, що воно зв'язує CD40L. Ампліфікований V домен вставляється в придатний експресійний вектор, наприклад pHEN-1 (Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137), і експресується, або сам по собі, або в злитому вигляді з іншою поліпептидною послідовністю. У кращому підході, репертуар VH або VL доменів, бажано VH або VL доменів людини, піддається скринінгу, наприклад, методом фагового дисплея, відносно бажаного антигену. Методи створення бібліотек бактеріофагового дисплея та бібліотеки експресії бібліотек фага лямбда добре відомі фахівцям у даній галузі техніки, і можуть бути отримані, наприклад, з: McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang et al.,1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991, Gene 104: 147; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; та Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313. Fab бібліотеки фагового дисплея відомі, наприклад, з Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, дивися вище; Clackson et al., 1991, дивися вище; Marks et al., 1991, дивися вище; Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10: 80; і Marks et al., 1992, дивися вище. Були описані різні втілення бібліотек дисплея scFv у білках оболонки бактеріофага. Тонкості підходу з використанням фагового дисплея також відомі, наприклад, як описано в WO96/06213 та WO92/01047 (Medical Research Council et al.) і WO97/08320 (Morphosys, дивися вище). Репертуар VH або VL доменів може бути природним репертуаром послідовностей імуноглобуліну або синтетичним репертуаром. Природний репертуар може бути приготовлений, наприклад, з клітин, які експресують імуноглобулін, і які отримані з одного або більше індивідуумів. Такий репертуар може бути «наївним», тобто отриманим, наприклад, з фе 53 тальних клітин людини, які експресують імуноглобулін або клітин немовляти, або «перебудованим», тобто отриманим, наприклад, з Вклітин дорослої людини. Природний репертуар описаний, наприклад, в Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581 та Vaughan et al., 1996, Nature Biotech. 14: 309. Якщо це бажано, клони, ідентифіковані в природному репертуарі або в будь-якому репертуарі на предмет зв'язування антигену-мішені, потім піддаються мутагенезу та подальшому скринінгу, щоб одержати та відібрати варіанти з поліпшеними характеристиками зв'язування. Синтетичні репертуари одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну одержують шляхом штучного введення змін у клонований V домен. Синтетичні репертуари описані, наприклад, в Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97; та WO 99/20749. В одному аспекті, репертуар синтетичних варіабельних доменів готується на базі VH або V, на основі штучно змінених послідовностей VH або V зародкової лінії. Наприклад, репертуар VH домена може ґрунтуватися на клонованих сегментах гена VH зародкової лінії V3-23/DP47 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768) та JH4b. Репертуар V домена може ґрунтуватися, наприклад, на сегментах гена V зародкової лінії O2/O12/DPK9 (Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) та J1. Зміни вносяться до цих або інших сегментів гена, наприклад, за допомогою ПЦРмутагенезу. Зміни можуть вноситися випадковим чином, наприклад, за допомогою пошкодженої помилками ПЦР (error prone PCR (Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889)) або методом хімічного мутагенезу. Однак, як обговорювалося вище, бажано, щоб введення змін було спрямовано на певні залишки. Також краще коли бажані залишки є мішенню змін шляхом введення кодона NNK з використанням мутагенних праймерів (використовуючи номенклатуру IUPAC, де N = G, A, T або C, і K = G або T), який кодує всі амінокислоти та стоп-кодон TAG. Інші кодони, які дозволяють досягти тієї ж мети, також можна використовувати, включаючи NNN кодон (який призводить до появи додаткових стоп-кодонів TGA і TAA), DVT кодон ((A/G/T) (A/G/C)T), DVC кодон ((A/G/T)(A/G/C)C), та DVY кодон ((A/G/T)(A/G/C)(C/T). Кодон DVT кодує 22% серину та 11% тірозину, аспарагіну, гліцину, аланіну, аспартату, треоніну та цистеіну, які найбільш точно імітують розподіл амінокислотних залишків для антигензв‟язуючих центрів природних антитіл людини. Репертуари виготовляються з використанням ПЦР-праймерів, які мають певний вироджений кодон або кодони в кожній ділянці, яка повинна бути змінена. ПЦР-мутагенез добре відомий у даній галузі техніки. В одному аспекті, зміна вноситься в послідовність сегментів гена VH зародкової лінії людини V3-23/DP47 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. 94213 54 Biol. 227: 7768) та JH4b з використанням NNK кодона в ділянках H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97 та H98, які відповідають розходженням в CDRs 1, 2 та 3 за нумерацією, яка використовується в U.S. 6,696,245. В іншому аспекті, зміна вноситься також у послідовність сегментів гена VH зародкової лінії людини V3-23/DP47 та JH4b, наприклад, з використанням NNK кодона в ділянках H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a та H100b, які відповідають розходженням в CDRs 1, 2 та 3 за нумерацією, яка використовується в U.S. 6,696,245. В іншому аспекті, зміна вноситься також у послідовність сегментів гена V зародкової лінії людини O2/O12/DPK9 та J1, з використанням NNK кодона в ділянках L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94 та L96, які відповідають розходженням в CDRs 1, 2 та 3 за нумерацією, яка використовується в U.S. 6,696,245. Диверсифіковані репертуари клонуються у вектори фагового дисплея, як це відомо в даній галузі техніки та як описано, наприклад, в WO 99/20749. Звичайно молекули нуклеїнової кислоти та конструкції вектора, необхідні для здійснення даного винаходу, доступні в даній галузі техніки; вони конструюються та з ними проводяться маніпуляції, як це описано в стандартних лабораторних методиках, таких як Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA. Маніпуляції з нуклеїновими кислотами в даному винаході звичайно проводяться в рекомбінантних векторах. У тому значенні, яке тут використовується, «вектор» означає дискретний елемент, який використовується для введення гетерологічної ДНК у клітини для її експресії та/або реплікації. Методи, за допомогою яких можна вибрати або сконструювати та потім використовувати такі вектори, добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Численні вектори, включаючи бактеріальні плазміди, бактеріофаги, штучні хромосоми та епісомальні вектори доступні всім бажаючим. Такі вектори можуть використовуватися для простого клонування та мутагенезу; альтернативно цьому, як це характерно для векторів, у яких перебуває репертуар (або попередній репертуар) членів даного винаходу, використовується вектор для експресії гена. Вектор для застосування згідно із даним винаходом обирається таким чином, щоб він міг включити послідовність бажаного розміру, яка кодує поліпептид, звичайно довжиною від 0,25 тисяч пар основ (тпо) до 40 тпо. Придатна клітинахазяїн трансформується вектором після маніпуляцій з клонування in vitro. Кожний вектор містить різні функціональні компоненти, які звичайно включають сайт клонування (або «полілінкер»), оріджин реплікації та, щонайменше, один селектований маркерний ген. Якщо даний вектор є експресійним вектором, він додатково має один або більше з наступних елементів: енхансерний елемент, промотор, послідовності 55 термінації транскрипції та сигнальні послідовності, кожний з яких розташований у безпосередній близькості від ділянки, яка клонується так, щоб вони були функціонально зв'язані з геном, який кодує один із членів поліпептидного репертуару, відповідно до даного винаходу. Як вектори для клонування, так і вектори для експресії звичайно містять послідовності нуклеїнової кислоти, які забезпечують реплікацію вектора в одній або більше з обраних клітинхазяїв. Зазвичай у векторах для клонування ця послідовність є такою послідовністю, яказабезпечує реплікацію вектора незалежно від хромосомної ДНК хазяїна та включає оріджин реплікації або автономні послідовності, які реплікуються. Такі послідовності добре відомі для багатьох бактерій, дріжджів та вірусів. Оріджин реплікації із плазміди pBR322 є придатним для більшості грамнегативних бактерій, оріджин плазміди 2 підходить для дріжджів, а різні вірусні оріджини (наприклад, аденовірусу SV40) є придатними для клонування векторів у клітинах ссавців. Звичайно оріджин реплікації не є необхідним для експресійних векторів ссавців, якщо вони використовуються в клітинах ссавців, здатні реплікувати більші кількості ДНК, такі як COS клітини. Бажано, щоб вектор для клонування або експресії також містив ген для селекції, так званий селективний маркер. Цей ген кодує білок, необхідний для виживання або росту трансформованих клітин-хазяїв на селективному культуральному середовищі. Таким чином, клітинихазяни, не трансформовані вектором, який містить ген для селекції, не будуть виживати в культуральному середовищі. Типові гени для селекції кодують білки, які забезпечують стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, неоміцину, метотрексату або тетрацикліну, заповнюють ауксотрофні дефіцити або забезпечують синтез критичних поживних речовин, які відсутні в середовищі росту. Оскільки реплікація векторів відповідно до даного винаходу найбільш зручно проводиться в E. coli, використовується E. coli селективний маркер, наприклад, ген -лактамази, який забезпечує стійкість до антибіотика ампіциліну. Такі гени можуть бути отримані із плазмід E. coli, таких як pBR322, або із плазміди pUC, такої як pUC18 або pUC19. Екпресійні вектори звичайно містять промотор, який розпізнається організмом хазяїна і який функціонально сполучений з кодуючою послідовністю, яка і є предметом інтересу. Такий промотор може бути індуцибельним або коститутивним. Термін «функціонально сполучений» означає таке взаємне розташування, при якому описані компоненти перебувають у таких взаємовідношеннях, які дозволяють їм функціонувати притаманим їм способом. Контрольна послідовність, «функціонально сполучена» з кодуючою послідовністю, лігується таким чином, щоб експресія кодуючої послідовності, за даних умов досягала значень, які можна 94213 56 порівняти з контрольними послідовностями. Промотори, які є придатними для застосування в прокаріотичних клітинах-хазяїнах включають, але цим не обмежуючись, наприклад, систему (-лактамази та лактозного промотору, лужну фосфатазу, систему промотору триптофану (trp) і гібридні промотори, такі як tac промотор. Промотори для застосування в бактеріальних системах також зазвичай містять послідовність ShineDalgarno, функціонально сполучену з кодуючою послідовністю. У бібліотеках або репертуарах, як тут описано, кращими векторами є експресійні вектори, які забезпечують експресію нуклеотидної послідовності, яка відповідає члену поліпептидної бібліотеки. Таким чином, вибір проводиться шляхом розмноження та експресії одного клону, який експресує певний поліпептид бібліотеки, або за допомогою будь-якої системи селекційного дисплея. Як описано вище, краща система селекційного дисплея використовує бактеріофаговий дисплей. Таким чином, можуть використовуватися вектори фагів або фагмід. Кращими векторами є вектори фагмід, які мають оріджин реплікації з E. coli (для дволанцюгової реплікації) і також оріджин реплікації фага (для одержання одноланцюгової ДНК). Маніпуляції з такими векторами та їх експресія добре відомі в даній галузі техніки (Hoogenboom and Winter (1992) дивися вище; Nissim et al. (1994) дивися вище). Коротко кажучи, вектор містить ген лактамази або інший селективний маркерний ген для надання селективності фагміді, і розташований вище експресійної касети lac-промотор, який складається (від N до C кінця) із лідерної послідовності pelB (яка направляє поліпептид, який експресується у периплазматичний простір), множинних ділянок клонування (для клонування нуклеотидних версій члена бібліотеки), не обов'язково однієї або більше пептидних міток (для детекції), не обов'язково одиного або більше TAG стоп-кодонів та фагового білка pIII. В одному втіленні вектор кодує не лідерну послідовність pelB, а еукаріотичну лідерну послідовність GAS1, яка забезпечує напрямок секреції злитого поліпептиду в периплазматичний простір E. coli або в культуральне середовище в еукаріотичних клітинних системах. Використовуючи різні супресорні та не супресорні штами E. coli при додаванні глюкози, ізопропілтіо--D-галактозиду (IPTG) або хелперного фага,одержують великі кількості тільки певного поліпептиду з бібліотеки, або одержують фаги, деякі з яких містять, щонайменше, одну копію злитої конструкції поліпептид-pIII на своїй поверхні. Прикладом кращого вектора є фагмідний вектор pHEN1 (Hoogenboom et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137; послідовність доступна, наприклад, як SEQ ID NO: 7 в WO 03/031611), у якому продукція злитого білка pIII перебуває під контролем промотору LacZ, який інгібується в присутності глюкози та індукуєся під дію IPTG. При вирощуванні в супресорних штамах E. coli, наприклад, в TG1, злитий білок III продукується та упаковується у фаг, тоді як вирощування в не 57 супресорних штамах, наприклад, в HB2151, забезпечує секрецію розчинного злитого білка в бактеріальну периплазму та у культуральне середовище. Оскільки експресія гена III запобігає наступному інфікуванню хелперним фагом, бактерії, які несуть фагмідні вектори, вирощуються в присутності глюкози до інфікування хелперним фагом VCSM13 для збереження фага. При конструюванні векторів, відповідно до даного винаходу, використовують стандартні техніки лігування. Ізольовані вектори або фрагменти ДНК розщеплюються, до них додаються липкі кінці, і вони знову ре-лігуються в бажаному вигляді для одержання необхідного вектора. Якщо необхідно, з використанням стандартних методів проводиться аналіз послідовності для підтвердження того, що в сконструйованому векторі присутні правильні послідовності. Придатні методи для конструювання експресійних векторів, приготування транскриптів in vitro, введення ДНК у клітину-хазяїна та проведення аналізу для оцінки експресії та функціональних характеристик добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Присутність послідовності гена в зразку визначають та кількісно оцінюють його ампліфікацію та/або експресію за допомогою стандартних методів, таких, як Саузерн або Нозерн аналіз, ВестернБлотинг, дот-блотинг ДНК, РНК або білка, гібридизація in situ, імуноцитохімія або аналіз послідовності нуклеїнової кислоти або білка. Фахівці в даній галузі техніки легко зрозуміють, як ці методи можуть бути модифіковані, якщо це необхідно. Скринінг одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну за зв'язуванням антигену Після експресії репертуару одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну на поверхні фага проводиться селекція шляхом контактування фагового репертуару з іммобілізованим антигеном-мішенню (наприклад, CD40L та/або епітоп, зв'язаний DOM8-24), промивання для видалення фага, який не зв'язався та розмноження фага, який зв'язався; цей процес часто називають пенінгом (panning). Даний процес можна застосовувати для скринінгу одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну, а також інших фрагментів антитіла, які можуть бути експресовані в бібліотеці дисплея, наприклад, scFv, Fab і т.і. Альтернативно цьому, фаги попередньо відбираються для експресії правильно згорнутих варіантів шляхом пенінгу проти іммобілізованого загального ліганда (наприклад, Протеїну А або Протеїну L), які зв'язують правильно згорнуті білки. Перевага цього підходу полягає в зменшенні пропорції нефункціональних членів, збільшуючи, таким чином, пропорцію членів, які можуть зв'язувати антиген-мішень. Попередній добір із загальними лігандами описаний в WO 99/20749. Скринінг бібліотек фагових антитіл описаний у загальному вигляді, наприклад, Harrison et al., 1996, Meth. Enzymol. 267: 83109. Скринінг зазвичай проводиться з використанням очищеного антигену, іммобілізованого на 94213 58 твердій підкладці, наприклад, у пластикових пробірках або планшетах, або на хроматографічній матриці, наприклад, Sepharose (Pharmacia). Скринінг і добір може також проводитися на комплексних антигенах, таких, як поверхня клітин (Marks et al., 1993, BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3938). Інша альтернатива включає добір за зв'язуванням біотинільованого антигену в розчині, з наступним захопленням покритими стрептавидіном частками. У кращому аспекті, пенінг проводиться на іммобілізованому антигені (загальному або специфічному) у пробірках або планшетах, наприклад, 8-ямкових стрічках Nunc MAXISORP immunotube. Ямки заповнюються 150 мкл антигену (200 мкг/мл в PBS) та інкубуються протягом ночі. Потім ямки промиваються 3 рази PBS і блокуються 400 мкл PBS-2% знежиреного молока (2% MPBS) при 37С протягом 2 годин. Потім ямки промиваються 3 рази PBS, після чого додається розчин фага в 2% MPBS. Суміш інкубується за кімнатної температури протягом 90 хв, після чого видаляється рідина, яка містить фаг, який не зв'язався. Ямки промиваються 10 разів розчином PBS-0,1% твін 20, потім 10 разів PBS для видалення детергенту. Зв'язаний фаг елююється додаванням 200 мкл твіду 100 мМ триетиламіну, все добре перемішується та інкубується 10 хв за кімнатної температури. Елюйований фаг переноситься в пробірку, яка містить 100 мкл 1 М Трис-НСl, рН 7,4 та перемішується на Вортексі для нейтралізації триетиламіну. Експоненціально - зростаючі клітини E. coli (наприклад, TG1) інфікуються, наприклад, 150 мл елюйованого фага шляхом інкубації протягом 30 хв при 37°С. Інфіковані клітини осаджуються, ресуспендуються у свіжому середовищі та висівають на агарозу. Фагові бляшки елююються або відбираються та вносяться у свіжі культури клітин-хазяїнівв для розмноження та аналізу або для наступних стадій добору. Проводиться одна або більше стадій очищення бляшок, якщо необхідно впевнитися в чистоті популяцій обраного фага. Інші підходи для скринінгу описані by Harrison et al., 1996, дивися вище. Після ідентифікації фага, який експресує одинарний варіабельний домен імуноглобуліну, який зв'язує бажану мішень, якщо використовувався фагмідний вектор, такий як pHEN1, злиті білки варіабельного домена легко продукуються в розчинному вигляді шляхом інфікування несупресорних штамів бактерій, наприклад, HB2151, що забезпечує секрецію розчинного злитого білка гена III. Якщо вектор кодує сигнальний пептид секреції GAS1, злитий білок може секретуватися клітинами еукаріот (наприклад, дріжджів або ссавців) або прокаріот (наприклад, E. coli). Альтернативно цьому, послідовність V домена може бути субклонована в придатний експресійний вектор для одержання розчинного білка методами, відомими в даній галузі техніки. Очищення та концентрування одинарних 59 варіабельних доменів імуноглобуліну Поліпептиди одинарного варіабельного домена імуноглобуліну або інші моновалентні поліпептиди антитіла, які секретуються в периплазматичний простір або в середовище вирощування бактерій, збираються та очищуються за допомогою відомих методів ((Harrison et al., 1996, дивися вище). Skerra & Pluckthun (1988, Science 240: 1038) та Breitling et al. (1991, Gene 104: 147) описують одержання поліпептидів антитіла з периплазми, і Better et al. (1988, Science 240: 1041) описують одержання їх із супернатанта культури. Для деяких поліпептидів антитіла, очищення також може бути досягнуте шляхом зв'язування із загальним лігандом, таким як Протеїн А або Протеїн L. Альтернативно цьому, варіабельні домени можуть експресуватися з пептидними мітками, наприклад, Myc, HA або 6X-His мітками, які полегшують очищення за рахунок афінної хроматографії. Якщо це необхідно, моновалентні поліпептиди антитіла проти CD40L концентруються кожним з методів, добре відомим у даній галузі техніки, включаючи, наприклад, ультрафільтрацію, діафільтрацію або тангенціальну проточну фільтрацію. Спосіб ультрафільтрації використовує напівпроникні мембрани та тиск, щоб розділити види молекул виходячи з їхнього розміру та форми. Тиск забезпечується тиском газу або за допомогою центрифугування. Комерційні продукти для ультрафільтрації є широко доступними, наприклад, від фірм Millipore (Bedford, MA; приклади включають концентратори Centricon and Microcon) та Vivascience (Hannover, Germany приклади включають концентратори Vivaspin). Вибір відсікання за молекулярною вагою, меншою ніж поліпептид-мішень, (звичайно від 1/3 до 1/6 від молекулярної ваги поліпептиду-мішені, хоча успішно можна використовувати і розходження в 10 кДа), дозволяє поліпептиду залишатися в комірці, тоді як розчинник і більш дрібні розчинні речовини проходять крізь мембрану. Таким чином, відсікання за молекулярною вагою в 5 кДа може бути застосованим для одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну проти CD40L, описаних у даному винаході. Діафільтрація, яка поєднує використання мембран для ультрафільтрації із процесом «промивання», використовується тоді, коли бажаним є видалити або замінити сіль або буфер у препараті поліпептиду. Поліпептид концентрується шляхом пропущення розчинника та дрібних розчинних речовин крізь мембрану, а солі, які залишилися, або буфер видаляються шляхом розведення поліпептиду, який залишився, новим буфером, або сольовим розчином, або водою, як це бажано, з безперервною ультрафільтрацією. При безперервній ультрафільтрації новий буфер додається з тією ж швидкістю, з якою фільтрат проходить крізь мембрану. Об‟єм діафільтрації є об‟ємом розчину поліпептиду до початку діафільтрації - використовуючи безперервну діафільтрацію можна видалити більше, ніж 99,5% повністю проникаючого 94213 60 розчину шляхом пропущення шести об‟ємів нового буфера діафільтрації. Альтернативно цьому, процес може проводитися перериваючись, коли зразок декілька разів розводиться та потім фільтрується до його вихідного об‟єму для заміни солі або буфера та, в остаточному підсумку, для концентрування поліпептиду. Устаткування для діафільтрації та детальний опис способу її використання легко доступні, наприклад, від Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) та Sartorius AG/Vivascience (Hannover, Germany). Тангенціальна проточна фільтрація (tangential flow filtration, TFF), також відома як «поперечноточна» фільтрація, також використовує мембрану для ультрафільтрації. Рідина, яка містить поліпептид-мішень, прокачується тангенціально уздовж поверхні мембрани. Тиск забезпечує проходження частини рідини крізь мембрану, тоді як поліпептид-мішень залишається над фільтром. Однак на відміну від стандартної ультрафільтрації, молекули, які залишаються не накопичуються на поверхні мембрани, а несуться далі минаючим потоком. Розчин, що не пройшов крізь фільтр (який містить поліпептид-мішень) може повторно циркулювати над поверхнею мембрани для досягнення бажаного рівня концентрування. Устаткування для TFF і детальний опис способу її використання легко доступні, наприклад, від Millipore (наприклад, системи ProFlux M12 Benchtop TFF та системи Pellicon), Pall Life Sciences (наприклад, система Minim Tangential Flow Filtration). Концентрація білка вимірюється різними способами, які добре відомі в даній галузі техніки. Вони включають, наприклад, амінокислотний аналіз, поглинання при 280 нм, методи Бредфорд та Лоурі, і електрофорез а ПААГ у присутності SDS. Найбільш точним методом є повний гідроліз із наступним амінокислотним аналізом методом ВЕРХ, потім визначається концентрація та порівнюється з відомою послідовністю поліпептиду одинарного варіабельного домена імуноглобуліну. Хоча цей метод є найбільш точним, він дорогий і трудомісткий. Визначення білка за вимірюванням УФ поглинання при 280 нм є набагато швидшим та дешевшим, але все-таки залишається досить точним і є кращим у порівнянні з амінокислотним аналізом. Визначення поглинання при 280 нм було використано для визначення концентрації білка, про що говориться в наведених нижче Прикладах. Методи визначення білка за Бредфордом та Лоурі ((Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry et al.,1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275) порівнюють концентрацію білка зі стандартною кривою, найбільш часто побудованою за бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Ці методи менш точні та мають тенденцію до завищення концентрації одинарних варіабельних доменів імуноглобуліну. Однак їхня точність може бути поліпшена при використанні поліпептидів одинарних доменів a VH або V як стандарту. Додатковим методом визначення білка є метод з використанням біцинхонінової кислоти, описаний в U.S. Patent No. 4,839,295 (включається