Спосіб зниження інфекційних властивостей днк- та рнк-вмісних вірусів

Реферат: Спосіб зниження інфекційних властивостей ДНК- та РНК-вмісних вірусів, в якому застосовують як інгібітор вірусів індолвмісну конденсовану тетрациклічну сполуку 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3бензотриазолу. Процес здійснюють у культурах клітин тваринного походження ВНK-21, СНЕВ та SK-6 за використання трьох схем застосування сполуки. UA 101429 U (12) UA 101429 U UA 101429 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, зокрема - вірусології, може бути використана для створення противірусного препарату і стосується індолвмісної тетрациклічної конденсованої сполуки 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу, яка може застосовуватись в якості інгібітору реплікації ДНК- та РНК-вмісних вірусів (на прикладі збудників хвороби Ауєскі та трансмісивного гастроентериту свиней). Віруси займають провідне місце в інфекційній патології людини, тварин, рослин. Вірусні інфекції характеризуються високою контагіозністю. Яка спричиняє їх широке розповсюдження, що зумовлює значний рівень захворюваності, а іноді й смертності серед людей та тварин. До вже відомих вірусних захворювань додаються нові, емерджентні інфекції. Тому, пошук нових способів боротьби з вірусними захворюваннями є актуальним. Оскільки створення вакцинних препаратів, ефективних по відношенню до нових вірусних інфекцій потребують значного часу, тому, етіотропні хіміопрепарати на основі синтезованих нових хімічних сполук можуть бути єдиним засобом попередження, а іноді і лікування вірусних захворювань. Виникнення та існування резистентності у деяких штамів вірусів до вже застосованих раніше хімічних речовин спонукає пошук нових дієвих сполук, які набудуть практичного значення у хіміопрепаратах з противірусною дією. Протягом останніх шістдесяти років дослідники з різних галузей наук створили більше ніж 60 ефективних противірусних сполук, що використовуються у наш час. Тим не менш, більшість, якщо і не всі, мають ряд суттєвих недоліків, а саме, недостатня біодоступність, токсичний ефект та формування резистентності у вірусів при разовому чи багаторазовому прийманні лікарських препаратів. Приблизно половина препаратів використовується при лікуванні ВІЛ-інфікованих. Інша половина сполук застосовується при лікуванні хворих на інфекційні гепатити, різноманітні герпесвірусні інфекції, грип. Проблема пошуку та ефективного використання противірусних препаратів на сьогоднішній день залишається надзвичайно актуальною. Відомий спосіб застосування бутилгідроксітолуолу (БГТ) як сполуки, яка знижує активність вірусу хвороби Ауєскі (ВХА) в системі in vitro. Культури клітин залишаються не інфікованими після внесення до них вірусної суспензії, яка до цього інкубувалась з невеликою кількістю БГТ при 37 °C протягом 30 або 60 хвилин [1]. Недоліком аналога є наявність у сполуки БГТ тільки віруліцидної дії щодо ВХА. Відомий спосіб застосування трьох 2-флуоропіримідинових нуклезидів (1-(2-дезокси-2-фторбета-D-арабінофуранозил)-5-йодоцитозин, 1-(2-дезокси-2-фтор-бета-D-арабінофуранозил)-5йодоурацил, 1-(2-дезокси-2-фтор-бета-D-арабінофуранозил)-5-метилурацил)) щодо інгібування ВХА. Сполуки показують високу противірусну активність у культурі клітин RK-13 (нирки кроля) [2]. Відомий спосіб зниження активності ВХА, який передбачає застосування 3-х нуклеотидів: бромовінілдеоксіуридину (БВДУ), ацикловіру та дигідроксипропоксиметилгуаніну (ДГПГ). Дія нуклеотидів оцінювалась за здатністю до інгібування бляшкоутворення. БВДУ інгібує ВХА в системі in vitro, але ця сполука не в змозі захистити мишей від летальної дії вірусу, і характеризується лише незначним зменшенням титру вірусу та незначним періодом подовження виживання мишей. Ацикловір та ДГПГ менш активні, ніж БВДУ при тестуванні проти вірусу в клітинах ВНК-21 (нирки новонародженого сирійського хом'яка), але терапія із застосуванням ДГПГ є ефективнішою для мишей, за якої зменшується титр вірусу, та, збільшується строк виживання мишей, які отримували потенційно смертельну дозу інфекційного агента. Ацикловір та ДГПГ більш активні в системі in vitro щодо ВХА при застосуванні їх у первинній культурі фібробластів ембріона миші замість культури клітин хом'яка [3]. Відомий спосіб зниження активності вірусу трансмісивного гастроентериту свиней (ТГС) в культурі клітин ST (тестикулу свині), при якому як інгібітори використовували дві солі цинку: хлорид цинку (ZnCl2) та сульфат цинку (ZnSO4), які знижували титри вірусу, а також знижували синтез вірусних білків при їх застосуванні під час проникнення вірусу в чутливу клітину та в різні моменти часу після проникнення вірусу до клітини. Солі цинку інгібували проникнення або вихід вірусу з клітин, а також впливали на внутрішньоклітинні фази життєвого циклу вірусу. Однак, ці солі цинку не проявляли віруліцидний ефект та не впливали на адсорбцію вірусу ТГС на чутливих клітинах [4]. Відомий спосіб зниження інфекційної активності вірусу ТГС в культурі клітин ST та РК-15 (нирки свині) при застосуванні як інгібуючого агента солі - хлориду літію (LiCl). Інфікування клітин вірусом не відбувалось при попередній обробці цією сполукою клітин або вірусу. При додаванні хлориду літію у вже інфіковані клітини також знижувалась інфекційна активність вірусу ТГС [5]. Відоме застосування у культурі клітин ST як інгібіторів вірусу ТГС наносполук срібла, включаючи сферичні наночастинки (NM-300), 2 типи нанопровідників (XFJ011) та колоїди 1 UA 101429 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (XFJ04). Наносполуки срібла ефективні у запобіганні розвитку інфекції в системі in vitro як віруліцидного препарату або як інгібітор взаємодії вірусу з чутливою клітиною, а саме на стадії проникнення вірусу в клітини [6]. Недоліком вищезазначених способів є зниження інфекційної активності тільки одного вірусу: або вірусу ТГС, або вірусу хвороби Ауєскі, а не проявляли комплексну дію на обидві групи вірусів. Запропонований спосіб вирішує цю задачу. Крім того, відмінністю від аналогів є застосування нової хімічної сполуки, що підвищує результативність досягнення цілі. Відмінністю від аналогів є і використання трьох культур клітин як доказової бази (замість 1 або 2), що дозволило нам виявити біологічний ефект та підтвердити біологічну закономірність. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити новий спосіб зниження інфекційних властивостей in vitro у обох групах вірусів: ДНК- та РНК-вмісних вірусів, а саме вірусів хвороби Ауєскі та ТГС. Поставлена задача вирішена шляхом застосування нової індолвмісної тетрациклічної конденсованої сполуки, а саме 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу, синтезованої в Грузинському технічному університеті. Спосіб здійснюється наступним чином. Сполуку вводять до перещеплюваних культур клітин тварин: ВНК-21 (нирки новонародженого сирійського хом'яка), СНЕВ (нирки ембріону свині версенізованої), SK-6 (нирки свині) за схемами: за добу до зараження вірусом (профілактична схема), під час адсорбції (лікувально-профілактична схема) та після адсорбції (лікувальна схема) вірусу. Приклад. Визначення противірусної активності 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу в культурах клітин щодо вірусів хвороби Ауєскі та ТГС. Вплив сполуки 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу (надалі-Сполука) на розвиток та прояв цитопатичної дії вірусів хвороби Ауєскі штаму "Арський" та ТГС штаму "Чугуєв", які були отримані з колекції Банку штамів мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів, досліджували у лікувально-профілактичній, лікувальній та профілактичній схемах. Культури клітин: ВНK-21, СНЕВ, SK-6 були отримані з Клітинного банку ліній з тканин людини та тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Для культивування клітин використовували поживне середовище DMEM (HyClone) з додаванням 10 % ембріональної сироватки крові телят (HyClone), прогрітої при +56 °C протягом 1 години. Сполуку розчиняли у нетоксичній концентрації диметилсульфоксиду (1 %), яку досягали шляхом додавання поживного середовища. Дослідження у культурах клітин проводили у 96-лункових планшетах, які інкубували у СС2 інкубаторі за температури +37 °C та 88 % вологості повітря протягом 4-ох діб. Для визначення максимально допустимої концентрації (МДК) Сполуки використовували вказані вище культури клітини. В дослідах застосовували не менш ніж три лунки в планшетах з культурою клітин для кожного розведення Сполуки в поживному середовищі. Щодня проводили мікроскопічне обстеження дослідних та контрольних культур клітин для виявлення наявності або відсутності цитотоксичної дії. За МДК Сполуки приймали її найбільше значення, яке не викликало дегенерації моношару клітин. При лікувально-профілактичній схемі на моношар культур клітин вносили підтримуюче 3 середовище, що містило Сполуку у МДК (25 мкг/см ) для кожної культури клітин та десятикратні розведення вірусної суспензії по 4 лунки на кожне у співвідношенні 1:1. Лікувальна схема передбачала внесення МДК Сполуки через 1,5 год. після інфікування клітин вірусом. При профілактичній схемі МДК Сполуки вводили на клітини за 24 год. до зараження їх вірусом. Противірусну активність Сполуки оцінювали протягом 96-ти год. за здатністю до інгібіції цитопатогенної дії (ЦПД) вірусів обох груп вірусів: ДНК-вмісних - на прикладі вірусу хвороби Ауєскі (див. табл.1) та РНК-вмісних - на прикладі вірусу трансмісивного гастроентериту свиней (див. табл. 2). Таблиця 1 Зниження титру інфекційної активності в системі in vitro вірусу хвороби Ауєскі 3 при застосуванні 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу за двома схемами, lg ТЦД50/см Культура клітин ВНK-21 СНЕВ SK-6 Схеми застосування та показник інгібування інфекційних властивостей ВХА в lg ТЦД50/см, n=5 Лікувальна Лікувально-профілактична 4,67±0,08 4,23±0,07 3,73±0,06 3,53±0,08 4,14±0,12 2 UA 101429 U 5 10 Таким чином, при застосуванні Сполуки щодо вірусу хвороби Ауєскі в лікувальнопрофілактичній схемі виявили значний інгібуючий ефект, а саме: зниження титру інфекційної 3 активності збудника на 3,53±0,08-4,23±0,07 lg ТЦД50/см , що є достовірно значимим та підтвердженим у трьох біологічних системах - культурах клітин різного походження, як за видовим, так і органним джерелом їх отримання, а саме: нирки новонародженого сирійського хом'яка, нирки ембріону свині, нирки дорослої свині. У лікувальній схемі застосування Сполука мала значний противірусний ефект у двох біологічних системах, знижуючи титр вірусу 3 достовірно на 3,73±0,06-4,67±0,08 lg ТЦД50/см , що є значним показником для сполуки, яка є кандидатом у противірусний препарат. Таблиця 2 Зниження титру інфекційної активності in vitro вірусу ТГС при застосуванні 3 індолвмісної сполуки 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу в трьох схемах, lg ТЦД50/см Культура клітин ВНK-21 СНЕВ SK-6 15 20 25 30 35 40 45 Схеми застосування та показник 3 інгібування титру активності вірусу в lg ТЦД50/см , n=5 Лікувальна Лікувально-профілактична Профілактична 2,16±0,04 2,11±0,05 1,83±0,04 2,98±0,02 3,12±0,08 2,94±0,05 Таким чином, другий приклад із застосування Сполуки щодо представника РНК-вмісних вірусів - вірусу ТГС свідчить про значну противірусну дію у лікувально-профілактичній схемі застосування, що підтверджено достовірне значиме зниження показників титру інфекційної 3 активності вірусу на 2,11±0,05-2,98±0,02 lg ТЦД50/см у трьох біологічних системах (культурах клітин ВНK-21, СНЕВ, SK-6). Спостерігали у двох культурах клітин значну інгібіцію активності 3 вірусу (в культурі клітин ВНK-21 та SK-6) на 2,16±0,04-3,12±0,08 lg ТІДД50/см , а також виявили противірусну активність у профілактичній схемі за застосування Сполуки у культурі клітин ВНK3 21 за зниження титру інфекційної активності на 1,83±0,04 lg ТЦД 50/см . Таким чином, нами доведено ефективність застосування Сполуки як противірусного засобу у способах зниження інфекційної активності для представників ДНК- та РНК-вмісних вірусів, а саме герпесвірусу І типу (вірусу хвороби Ауєскі) та коронавірусу (вірусу трансмісивного гастроентериту свиней) у культурах клітин тваринного походження. Виявлена біологічна закономірність противірусної дії Сполуки у декількох біологічних системах та у різних схемах її застосування. Отже, нами доведено ефективність способу зниження інфекційної активності герпесвірусу та коронавірусу із застосуванням 3Н-бензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу. Сполука може бути рекомендована як ефективний противірусний засіб у клінічних випробуваннях за розробленим способом зниження інфекційних властивостей вірусів. Джерела інформації: 1. Pirtle Е.С, Sacks J.М., Nachman R.J. Antiviral effectiveness of butylated hydroxytoluene against pseudorabies (Aujeszky's disease) virus in cell culture, mice, and swine // Am J Vet Res.1986. - V. 47(9). - P. 1892-5. 2. Rollinson E.A. Comparative efficacy of three 2'-fluoropyrimidine nucleosides and 9-(1,3dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine (BW B759U) against pseudorabies and equine rhinopneumonitis virus infection in vitro and in laboratory animals // Antiviral Res.-1987. - V. 7(1). - P. 25-33. 3. Field HJ. Chemotherapy of Aujeszky's disease (pseudorabies) in the mouse by means of nucleoside analogues: bromovinyldeoxyuridine, acyclovir, and dihydroxypropoxymethylguanine // Antiviral Res.-1985. - V. 5(3). - P. 157-68. 4. Wei Z., Burwinkel M., PalissaC, Ephraim E., Schmidt M. F. Antiviral activity of zinc salts against transmissible gastroenteritis virus in vitro // Vet Microbiol.-2012.-V. 160(3-4).-P. 468-72. 5. Ren X, Meng F, Yin J, Li G, Li X, Wang C, Herrler G. Action mechanisms of lithium chloride on cell infection by transmissible gastroenteritis coronavirus // PLoS One.-2011. - V. 6(5). - P. e18669. 6. Lv X., Wang P., Bai R., Cong Y., Suo S., Ren X., Chen С Inhibitory effect of silver nanomaterials on transmissible virus-induced host cell infections // Biomaterials.-2014. - V. 35(13). P. 4195-203. 3 UA 101429 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб зниження інфекційних властивостей ДНК- та РНК-вмісних вірусів, який відрізняється тим, що застосовують як інгібітор вірусів індолвмісну конденсовану тетрациклічну сполуку 3Нбензофуро(2,3-f)-1,2,3-бензотриазолу, при цьому процес здійснюють у культурах клітин тваринного походження ВНK-21, СНЕВ та SK-6 за використання трьох схем застосування сполуки. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, УкраїнаДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4