Спосіб інактивації інфекційних властивостей гемаглютинуючих вірусів

Реферат: UA 92404 U UA 92404 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної вірусології, діагностики та біотехнології і може бути використана при виробництві діагностичних тест-систем, засобів специфічної профілактики (вакцин) інфекційних захворювань сільськогосподарської птиці, що викликаються гемаглютинуючими вірусами. На сьогоднішній день існує велика кількість методів та способів інактивації гемаглютинуючих вірусів. Так, Міжнародне епізоотичне бюро пропонує проводити інактивацію вірусів грипу та ньюкаслської хвороби формальдегідом та β-пропіолактоном [International Office of Epizootics, Biological Standards Commission, International Office of Epizootics, and International Committee. 2008. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals mammals, birds and bees. Office international des epizooties, Paris]. Але на сьогоднішній день є певні проблеми, пов'язані з використанням цих інактивантів. Так, β-пропіолактоном дозволяє ефективно проводити інактивацію вірусів грипу, але основними недоліками є дуже висока його вартість, а також нестабільність самого β-пропіолактоном, який необхідно зберігати та транспортувати виключно за низьких температур. В іншому разі β-пропіолактоном гідролізується та повністю втрачає свої властивості. Існує спосіб інактивації гемаглютинуючих вірусів за допомогою формальдегіду, але він негативним чином впливає на гемаглютинаційні властивості антигену. При проведенні інактивації формальдегідом реєструють суттєве зниження рівня гемаглютиніну в інактивованому антигені, як у процесі інактивації, так і у процесі тривалого зберігання [Стегній А.Б. Розробка бівалентної інактивованої вакцини проти високопатогенного грипу птиці та ньюкаслської хвороби [Текст] / Стегній А.Б. // автореф.дис… канд.вет.наук. - Одеса, 2011. - 21 с.]. Також існує спосіб інактивації інфекціозності вірусів препаратом амінометилольних сполук (ПАМС), які отримують шляхом змішування 40-% формальдегіду та лізину (Способ инактивации инфекциозности вирусов. А.С. № 490824 МПК С12К 5/00 від 05.11.75. Бюлетень № 41). За цим способом проводять обробку зливу на сепараторі, ультрафільтрацію, введення ПАМС у фільтрат культурального вірусу, інактивацію. Цей спосіб може бути прототипом. Але головним недоліком цього способу інактивації інфекційних властивостей гемаглютинуючих вірусів є використання формальдегіду як компонента ПАМС, що призводить до руйнування гемаглютинінів в процесі інактивації та як наслідок зниження антигенних властивостей інактивованих гемаглютинуючих вірусів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб інактивації інфекційних властивостей гемаглютинуючих вірусів, збудників інфекційних хвороб сільськогосподарскої птиці, що включає інактивацію вірусів шляхом одержання вірусовміщуючої рідини, центрифугування, доведення рН вірусної рідини до 7,4 та використання як інактиванта бінарного етиленіміну в кінцевій концентрації 1-3 %, щоб забезпечити повну інактивацію інфекційних властивостей вірусів при збереженості гемаглютинінів вірусів, а також їх антигенних властивостей. Заявлений спосіб представляє собою новий спосіб, в якому для інактивації гемаглютинуючих вірусів (наприклад вірусу грипу, або вірусу ньюкаслської хвороби) використовують бінарний етиленімін в кінцевій концентрації 1-3 % протягом 24-48 годин. Це дозволяє повністю інактивувати інфекційні властивості при повному збереженні гемаглютинаійних та антигенних властивостей, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Для інактивації використовують свіжу вірусовміщуючу рідину отриману шляхом інфікування ембріонів птиці або культур клітин (екстраембріональну або культуральну рідину). Вірусовміщуючу рідину попередньо звільняють від баластних домішок (частки клітин, клітинний детрит, еритроцити, частки ембріонів та інше) низькошвидкісним центрифугуванням за 2000 об/хв. протягом 10 хвилин за температури 4 °C. Після центрифугування в подальшій роботі використовують надосадову рідину. Для інактивації використовують бінарний етиленімін в кінцевій концентрації 1-3 %. Перед безпосереднім додаванням інактиванту доводять рН вірусної рідини до показника 7,4. Після змішування процедуру інактивації продовжують за температури 37 С протягом 24-48 годин. Процес інактивації через 24-48 годин зупиняють 1М тіосульфатом натрію шляхом додавання до суміші цього реагенту у співвідношенні 10 % від об'єму використаного інактиванту. Після завершення усіх зазначених процедур інактивований вірус переливають у чисті стерильні флакони та проводять перевірку повноти інактивації шляхом триразових "сліпих" пасажів на 9-11 добових ембріонах, що розвиваються. Інактивований таким чином вірусний матеріалі зберігає усі гемаглютинуючі властивості при повній втраті інфекційних властивостей, а і відповідно здатності до реплікації. Це пов'язано з тим, що бінарний етиленімін впливає виключно на генетичний матеріал вірусу призводить до депуринізації з послідуючою деполімеризацією нуклеїнових кислот. 1 UA 92404 U 5 10 15 20 Приклад 1. Збереженість гемаглютинаційних властивостей інактивованих бінарним етиленіміном рідких антигенів вірусу ньюкаслької хвороби проводили кожні 30 діб протягом 9 місяців при зберіганні за температури 4-8 °C. Рівень гемаглютинінів визначали в РГА з 1 % суспензією еритроцитів півня. Результати представлені в таблиці 1. За 9 місяців спостереження встановлено, що рівень гемаглютинінів в інактивованих бінарним етиленіміном антигенах вірусу ньюкаслської хвороби знизився на 2-3 log2. Приклад 2. Для вивчення антигенних властивостей вірусу ньюкаслської хвороби, інактивованого бінарним етиленіміном, було використано штам НХ/крижень/Асканія-Нова//ТМ 434774/2002. Інактивацію його проводили бінарним етиленіміном в кінцевій концентрації 3 % протягом 48 годин. Після перевірки повноти інактивації виготовлено експериментальні серії вакцини до складу якої увійшли інактивований антиген вірусу НХ, а також масляний ад'ювант. Ці 3 експериментальні серії вакцини в дозах 0,5 та 1,0 см були введені курям внутрішньом'язово. За птицею було встановлено спостереження протягом 28 діб з відбором крові та дослідженням сироватки в РЗГА на 7, 14, 21, 28 добу після імунізації. Результати дослідження сироваток крові наведено в таблиці 2 Таким чином, використання даного способу інактивації гемаглютинуючих вірусів дозволить значним чином зберегти при проведенні інактивації гемаглютиніни вірусів (наприклад, грипу та ньюкаслської хвороби), як основні проективні антигени, що дасть можливість використовувати ці антигени у виробництві засобів специфічної профілактик та діагностики. Таблиця 1 Спосіб інактивації інфекційних властивостей гемаглютинуючих вірусів Термін зберігання 1% антигенів (міс.) 11 год. до інактивації після 9 log2 інактивації 1 8 log2 2 9 log2 3 7 log2 4 8 log2 5 8 log2 6 7 log2 7 7 log2 8 7 log2 9 6 log2 Серія антигену (концентрації БЕІ та тривалості інактивації) 1% 1% 1% 3% 3% 3% 24 год. 33 год. 48 год. 11 год. 24 год. 33 год. 10 log2 3% 48 год. 10 log2 9 log2 9 log2 9 log2 9 log2 10 log2 9 log2 12 log2 12 log2 7 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 7 log2 7 log2 10 log2 10 log2 7 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 11 log2 12 log2 8 log2 9 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 10 log2 8 log2 8 log2 8 log2 7 log2 7 log2 7 log2 7 log2 8 log2 10 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 7 log2 11 log2 11 log2 7 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 8 log2 12 log2 10 log2 8 log2 9 log2 9 log2 9 log2 8 log2 8 log2 8 log2 Таблиця 2 Доза антигену 3 0,5 cм 3 1,0 cм 7 0 0 Термін дослідження (діб)/рівень антитіл в РЗГА (log2) 14 21 28 6,0±1,0 6,71±0,49 10,86±0,69 7,6±1,14 11,0±0,17 12,25±1,5 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб інактивації інфекційних властивостей гемаглютинуючих вірусів, що включає інактивацію вірусів, який відрізняється тим, що одержують вірусовміщуючу рідину, центрифугують, доводять рН вірусної рідини до 7,4 та використовують як інактиванта бінарний етиленімін в кінцевій концентрації 1-3 %. 2 UA 92404 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3