Спосіб діагностики та ідентифікації рнк-вмісних вірусів мікроскопічних та їстівних грибів

Реферат: Спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних вірусів мікроскопічних та їстівних грибів включає зразок, його гомогенізування, фенольне виділення та очистку загальних нуклеїнових кислот, два цикли целюлозного фракціонування, ресуспендування. Для екстракції длРНК міковірусів пропонується використовувати 10 г наважки вихідного матеріалу, збільшувати об'єм STE буфера до 30 мл для первинної відмивки, додавати 1/2 від об'єму фенолу, 17 мл хлороформу та 2 мл ізоамілового спирту. UA 68995 U (12) UA 68995 U UA 68995 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі мікробіологія. Аналогом до запропонованого способу є патент №55096, опубл. 16.08.2004, бюл. № 8. Спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів. Він передбачає наступні етапи його проведення: 3,5 г рослинного зразка (уражені ділянки листя, стебел, коренеплодів, насіння тощо) гомогенізувати в буферному розчині STE (ОДМ NaCl, 0.05M tris-НСl, 1,0 mM EDTA, pH 7,0) в умовах рідкого азоту. Після проведення гомогенізації проводиться фенольне виділення та очистка загальних нуклеїнових кислот і два цикли целюлозного фракціонування, що включають декілька стадій, використовуючи 16 % розчин етанолу. Фракцію длРНК після целюлозного фільтрату переводять на STE-буфер без етанолу і концентрують в двох об'ємах охолодженого 95 % етилового спирту та 0,1 об'єму 0,2М натрій ацетату, рН 5,5. Проводять ресуспендування в STE-буфері. Отримані проби в кількості 40 мкл наносять в індивідуальні кишені 6 % поліакриламідного гелю (ПААГ) (1,5мм7см8см, 40:1 акриламід/бісакриламід), і поміщають на вертикальний прилад для електрофорезу. Проаналізувавши спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних фітовірусів, виявлено, що запропонована методика виділення у випадку для мікроскопічних та їстівних грибів не забезпечує у повній мірі чистоту та достатню концентрацію длРНК вірусів. Запропонований нами спосіб полягає у тому, що при використанні проби грибів в кількості 10 г отримували зразки, які після гомогенізації в умовах рідкого азоту переносять в центрифугальні пробірки, додають 12 мл буфера 2х STE (Н2О - 500 мл, NaCl-29г, tris-30,5г, EDTA-1,85г), 1 мл 1 % SDS (Н2О - 100 мл, додицилосульфат натрію - 10 г) і 1мл бентоніту, перемішують на шейкері протягом 15 хв до утворення однорідної маси. Далі додають 17 мл STE-фенолу (Н2О - 500 мл, 2х STE-500 мл, рН 4,5) та 17 мл розчину хлороформ-ізоамілу (24:1) й центрифугують 20 хв при 2500 об/хв. Після центрифугування відбирають водну фазу і знову центрифугують 10 хв при 8000 об/хв, відбираючи надосад з додаванням 1,5 г целюлози і 3 мл абсолютного етанолу, перемішують протягом 15-20 хв, надалі зразки переносять на лід на 30 хв при температурі -15 °C. Вміст пробірок переливають в колонки, додають буфер STE-OH (STE100 мл, етиловий спирт - 174 мл, Н2О - 726 мл) 20 мл та буфер STE-20 мл. Фільтрати переливають в центрифужні пробірки та додають 30 мл етилового спирту, центрифугують 30 хв при 8000 об/хв, зливали надосад й підсушували на фільтрувальному папері при температурі плюс 18-20 °C-2 год., додають 200 мкл 10Х РНК-буфера (0,35 % (w/v) Orange G, 30 % (w/v) Ficoll 400, 1 mM EDTA). В отриманий розчин додають 1 мкл MgCb й переносять в термостат на 1 год. при температурі плюс 37 °C. Електрофоретичне розділення нуклеїнових кислот длРНК проводили в 1 %-ному агарозному гелі протягом 30 хв при напрузі 5-15 В/см. Решту зразків зберігають при температурі мінус 20 °C. В результаті модифікації способу, що передбачає збільшення маси наважки вихідного матеріалу до 10 г, збільшення об'єму STE буфера (30 мл) для первинної відмивки та додавання 50 % від об'єму фенолу, 17 мл хлороформу і 2 мл ізоамілового спирту, отримано можливість якісно проводити діагностику та ідентифікацію РНК-вмісних вірусів мікроскопічних та їстівних грибів. Отже, завдяки модифікації способу, що передбачає збільшення маси наважки вихідного матеріалу до 10 г, збільшення об'єму STE буфера (30 мл) для первинної відмивки, додавання 50 % від об'єму фенолу, 17 мл хлороформу і 2 мл ізоамілового спирту при виділенні дволанцюгової вірусної РНК можна говорити про ефективність запропонованого способу діагностики та ідентифікації РНК-вмісних вірусів мікроскопічних та їстівних грибів. Таким чином, застосовуючи спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних вірусів мікроскопічних та їстівних грибів, ми забезпечуємо отримання достатньої концентрації длРНК вірусів, в результаті чого можна стверджувати про підвищення ефективності наукових досліджень. 50 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб діагностики та ідентифікації РНК-вмісних вірусів мікроскопічних та їстівних грибів, що включає зразок, його гомогенізування, фенольне виділення та очистку загальних нуклеїнових кислот, два цикли целюлозного фракціонування, ресуспендування, який відрізняється тим, що для екстракції длРНК міковірусів пропонується використовувати 10 г наважки вихідного матеріалу, збільшувати об'єм STE буфера до 30 мл для первинної відмивки, додавати 1/2 від об'єму фенолу, 17 мл хлороформу та 2 мл ізоамілового спирту. 1 UA 68995 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2