Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету fistulina hepatica (schaeff.) sibth. fh-18 – продуцент позаклітинних каротиноїдів

Реферат: Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth. Fh-18 - продуцент позаклітинних каротиноїдів. UA 101911 U (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР ДЕРЕВОРУЙНІВНОГО БАЗИДІОМІЦЕТУ FISTULINA HEPATICA (SCHAEFF.) SIBTH. FH-18 - ПРОДУЦЕНТ ПОЗАКЛІТИННИХ КАРОТИНОЇДІВ UA 101911 U UA 101911 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікробіологічної промисловості і стосується нового штаму базидіоміцетів, який може бути використаний для одержання каротиноїдів. Натуральні пігменти - каротиноїди, що належать до полієнових ізопреноїдів терпенового ряду, мають низку лікарських властивостей. Зокрема виявлена їх антиоксидантна, радіопротекторна, антиканцерогенна, імуномодулююча та інші фізіологічні функції. До біосинтезу каротиноїдів здатні рослини, гриби і деякі тварини та мікроорганізми. Зокрема, відомі види мікроорганізмів, які використовуються для промислового отримання каротиноїдів Blakeslea trispora, Sporobolomyces pararoseus, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula aurantiaca та Rh. glutinis [1, 2, 3, 5, 10]. Недостатність та вибірковість даних щодо каротиногенезу базидіоміцетів, не дозволяє всебічно судити про можливість їх використання як продуцентів цих речовин. Зростаючий попит на каротиноїди обумовлює пошук потенційних джерел їх отримання з розширенням номенклатури біологічних агентів, у тому числі, за рахунок грибних організмів [1, 10, 12, 13]. Актуальність пошуку продуцентів природних каротиноїдів пояснюється і тим, що синтетичні барвники та мінеральні пігменти, у більшості випадків, мають канцерогенну дію на організм людини та тварин [4]. Відомий штам дріжджів Rhodosporidium diobovatum МКПМ Y-3158 продуцент каротиноїдів. Культивують цей штам на живильному середовищі, що містить джерела карбону, нітрогену та мінеральні солі. Отримують біомасу, що містить каротиноїди в кількості 3000-4000 мкг/г сухої біомаси, в тому числі-каротину 2500-3500 мкг/г, тобто до 90 % [9]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів у культурах базидіоміцетів, культури дріжджів потенційно можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні в якості продуцентів у мікробіологічній промисловості. Відомий штам дріжджів Rhodotorula glutinis МКПМ У-2210 продуцент каротиноїдів. Вміст каротиноїдів 3000-4000 мкг/г [7]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів у культурах базидіоміцетів, культури дріжджів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні в якості продуцентів у мікробіологічній промисловості. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є пара штамів гриба + Blakeslea trispora КР 74 і КР 86" - продуцентів бета-каротину. Вміст каротиноїдів 190 мг/100 мл середовища [9]. Не надаються дані щодо вмісту каротиноїдів у культурах базидіоміцетів, культури нижчих грибів можуть викликати професійні захворювання обслуговуючого персоналу при їх використанні в якості продуцентів у мікробіологічній промисловості. В основу корисної моделі поставлена задача отримання нового штаму соматичних структур ксилотрофного базидіоміцету Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth. Fh-18, який відрізняється від прототипу видовою приналежністю та високим вмістом каротиноїдів у міцелії - до 3,44 мг/г та у культуральному фільтраті - до 0,22 мг/мл на 12-ту добу культивування на глюкозо-пептонному середовищі. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Fistulina hepatica Fh-18, згідно корисної моделі, має високий вміст каротиноїдів у міцелії та культуральному фільтраті при поверхневому культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12-ти діб. Інтродукований штам макроскопічного гриба Fistulina hepatica Fh-18 має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкту дослідження [13]. Царство: Fungi Відділ: Basidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes Підклас: Agaricomycetidae Порядок: Agaricales Родина: Fistulinaceae Рід: Fistulina Вид: Fistulina hepatica Штам Fistulina hepatica Fh-18 отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів із дикорослих плодових тіл [12], що були зібрані на деревині ушкодженого листяного дерева Quercus robur - дуба гостролистого в Краснолиманському лісництві у 2008 році. Плодові тіла на коротких бокових ніжках невеликою групою знаходилися на деревині, у вигляді м'ясистих наростів, що за формою нагадували бичачий язик, мали розмір 50-100 мм, напівкруглі, щільні та пружні, пурпурово-червоні або пурпурово-м'ясо-червоні, гіменофор трубчастий, білувато-жовтий. М'якуш забарвлений, м'який, соковитий. 1 UA 101911 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Чисту міцеліальну культуру штаму Fh-18 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° за Баллінгом) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. Культурально-морфологічні ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам Fh-18 культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі (СА) і картопляноглюкозному агарі (КГА) в чашках Петрі, та на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі (ГПС) в поверхневій культурі. На сусло-агарі у чашках Петрі міцелій розповсюджується рівномірно. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті субстратні гіфи. Колонія гриба має круглу форму однакової щільності. Колір колонії жовтувато-коричневий. Субстрат забарвлює в темнокоричневий колір з оливковим відтінком. Текстура міцелію бавовняна, висота повітряних гіф становить близько 0,5-1 мм. На застосованих для культивування живильних середовищах, колонія має специфічний не грибний запах. Утворення примордій та плодоношення не спостерігали. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і численні перегородки гіф. Фізіолого-біохімічні ознаки. Аероб. Росте при температурі 20-30 °C. Оптимум рН живильного середовища 6-6,5 од. За інтенсивністю росту накопичення абсолютно сухої біомаси (АСБ) та біосинтетичними показниками, найкращими джерелами вуглецевого живлення є глюкоза, маноза і фруктоза. Високий вміст каротиноїдів у міцелії та культуральному фільтраті (КФ) відмічається у віці 12 діб при культивуванні штаму на живильному середовищі, яке містило фруктозу. Приклад конкретного виконання 1. Співставлення рівня накопичення каротиноїдів деякими штамами базидіоміцетів. Культивування штамів проводять в колбах Ерленмейєра поверхневим методом на ГПС. Готують ГПС наступного складу, г/л [3]: глюкоза 10,0 пептон 3,0 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4•7Н2О 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4•7H2Ο 0,001 дистильована вода до 1 літра. Характеристики ГПС наступні: співвідношення за масою C:N дорівнює 13:1, а рН-6,7 од. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,5±0,2 од. Інокулюмом слугують 10-ти денні міцеліальні культури штамів на СА. Термін культивування складає 12 діб при оптимальній для росту обраних штамів температурі 27,5 °C. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Після закінчення терміну культивування, міцелій при 5+1 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування, отримуючи КФ. Отриманий міцелій додатково підсушують на фільтрувальному папері і охолоджують до 1±0,5 °C. Підготовлений міцелій гомогенізують шляхом розтирання в охолодженій ступці, отримуючи гомогенат міцелію. Водневий показник КФ встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі "рН-150МИ". Накопичення АСБ міцелію визначають ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують [3]. Визначення вмісту каротиноїдів проводять у ацетонових витяжках мікологічного матеріалу (міцелій і КФ) спектрофотометричним методом та розраховують за формулою Ветштейна [6]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Результати вивчення рівня каротиногенезу деяких штамів базидіоміцетів представлені в табл. 2 UA 101911 U Таблиця Динаміка накопичення каротиноїдів у міцелії та культуральному фільтраті деяких штамів базидіоміцетів Штам Fistulina hepatica Fh-08 Fistulina hepatica Fh-18 Flammulina velutipes F-03 Flammulina velutipes F-06 Flammulina velutipes F-l Pleurotus ostreatus P-208 Pleurotus ostreatus P-004 Schizophyllum commune Sc-10 Schizophyllum commune Sc-1101 5 10 15 20 25 30 35 40 6 1,53±0,02 1,78±0,12 0,09±0,01 0,13±0,03 0,11±0,01 0,15±0,01 0,14±0,01 Міцелій, мг/г КФ, мг/мл Термін культивування, доба 9 12 6 9 2,20±0,06 3,06±0,12 0,14±0,04 0,19±0,02 2,54±0,05 3,44±0,10 0,16±0,03 0,18±0,01 0,12±0,02 0,15±0,01 0 0 0,16±0,06 0,19±0,02 0 0 0,17±0,03 0,19±0,01 0 0 0,22±0,06 0,31±0,12 0,04±0,01 0,09±0,05 0,43±0,05 0,55±0,12 0,06±0,01 0,09±0,01 12 0,25±0,05 0,22±0,03 0 0 0 0,12±0,05 0,07±0,01 0,05±0,01 0,11±0,02 0,13±0,01 0 0 0 0,07±0,02 0,09±0,01 0,12±0,02 0 0 0 Для досліджених штамів характерне максимальне накопичення каротиноїдів у міцелії на 12 добу росту. Максимальний вміст каротиноїдів у міцелії, серед поліпоральних грибів, зафіксовано для виду F. hepatica з найбільшим значенням близько 3,44 мг/г у штаму Fh-18. Щодо вмісту каротиноїдів у КФ, то для більшості штамів максимальний вміст цих речовин зафіксовано на 12-ту, а для штаму P. ostreatus P-004 - на 9-ту добу культивування. Найвищий рівень накопичення каротиноїдів у КФ спостерігався у штамів F. hepatica Fh-18 та Fh-08, які мали максимальний вміст каротиноїдів на 12-ту добу культивування 0,22 та 0,25 мг/мл відповідно. Не зареєстровано вміст каротиноїдів у КФ штамів S. commune Sc-1101, Sc-10 TaF. velutipes F-03, F-06, F-l. Таким чином, запропонований штам Fh-18 їстівного базидіального гриба Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth. є активним продуцентом каротиноїдів та накопичує їх у міцелії і культуральній рідині. Він може бути використаний у промисловому грибівництві та для одержання каротиноїдів у мікробіологічній промисловості. Штам Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth. Fh-18 зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету (м. Вінниця) та переданий для зберігання у Колекцію культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІВК). Джерела інформації: 1. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів / Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2010. - 323 с. 2. Гесслер Н.Н. Участие β-каротина в антиоксидантной защите грибной клетки. / Н.Н.Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская // Прикладная биохим. и микробиол. 2003. - Τ 39. № 4, - с. 427-429. 3. Дудка И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. / И.Α. Дудка, С.П. Вассер, И.А. Элланская. - К.: Наук. думка, 1982. - 550 с. 4. Зерщикова Т.А. Эколого-гигиеническая оценка синтетических и натуральных красителей в разнообразных напитках Текст. // Т.А. Зерщикова, Л.П. Флоринская // Успехи современного естествознания, -2010. -№ 3.- С. 124-125. 5. Камінська М. Каротинсинтезуючі дріжджі Phaffia rhodozyma /Μ. Камінська, Л. Сологуб // Вісник Львів, ун-ту. Сер. біол., 2004. - Вип. 37. - С. 3-12. 6. Мусиенко М.М. Спектрофотометрические методы в практике физиологии, биохимии и экологии растений / М.М. Мусиенко, Т.В. Паршикова, П.С. Славный. - К.: Фитосоциоцентр, 2001. - 200 с. 7. Патент 2103350 Российской Федерации Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis - продуцент каротиноидов / Авчиева П.Б., Буторова И.А., Вустин М.М., Синеокий С.П. Заявка 96112874/13, от 27.06.1996, МПК (2006.01), кл. C12N1/16, С12Р23/00 Бюл. № 3, від 27.01.1998. 8. Патент 2177505 Российской Федерации Пара штаммов гетероталличного гриба Blakeslea + trispora КР 74 і КР 86" продуцирующая бета-каротин / Кунщикова И.С., Казарян Р.В., Кудинова 3 UA 101911 U 5 10 15 С.П., Кунщикова Е.А. Заявка 2011119634/10, от 15.12.2000, МПК (2006.01), кл. С12Р23/00, C12N1/14 C12N1/14,C12R1:645 Бюл. № 12, від 27.12.2001 (прототип). 9. Патент 2399659 Российской Федерации Штамм дрожжей Rhodosporidium diobovatum продуцент каротиноидов / Вустин М.М., Великая М.А., Синеокий С.П. Заявка 2009126300/10, от 10.07.2009, МПК (2006.01), кл. C12N1/16, С12Р23/00 Бюл. № 3, від 27.01.2010. 10. Феофилова Е.П. Каротиноиды грибов: биологические функции и практичесоке использование / Е.П. Феофилова // Прикладная биохимия и микробиология. 1994.-Т.30, №2.-С. 181-195 11. Barros L. Antimicrobial activity and bioactive compounds of Portuguese wild edible mushrooms methanolic extracts // L. Barros, R. C. Calhelha, J. A. Vaz, I. С F. R. Ferreira et. / Eur Food Res Technol, 2007. - № 225-P. 151-156 12. Cerda-Olmedo E. Production of carotenoids with fungi / Biotechnology of Vitamins, Pigments and Growth Factors, 1989. - P. 21-42. 13. Kirk P.M. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the fungi. 9th ed. / P.M. Kirk, P.F. Cannon, J.C. David, J.A. Stalpers-Wallingford, CAB International, 2001. - 655 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцету Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth. Fh-18 - продуцент позаклітинних каротиноїдів. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4