Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета trametes hirsuta (wulfen) lloyd th-11- продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів

Реферат: UA 82088 U UA 82088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана в різних галузях промисловості і сільського господарства для отримання біологічно активних речовин, деструкції лігноцелюлозних відходів, в паперовому виробництві, а також в екології - в процесах біоремедіації забруднених середовищ. Лігніни - великі за розміром полімери ароматичної природи, що характеризуються значною хімічною стійкістю і нерегулярністю структури. Вони забезпечують захист інших макромолекул деревини, зокрема целюлози, завдяки утворенню хімічних зв'язків, а тому є лімітуючим фактором процесів біодеградації деревини. Ксилотрофи білої гнилі мають унікальні лігнінолітичні механізми, завдяки яким вони можуть повністю розкладати лігноцелюлозний комплекс деревини. Тому саме вони відіграють головну роль в наземних екосистемах в процесах деградації та рециркуляції здерев'янілої біомаси [2, 4, 10, 11]. Окрім цього встановлено, що в процесі деструкції лігніновуглеводневого комплексу грибами білої гнилі утворюються гуміноподібні речовини, які мають фізіологічну активність [9]. Лігнінолітичні ферменти грибів характеризуються широкою субстратною специфічністю, а отже здатні каталізувати розкладання різноманітних органічних сполук, що забруднюють навколишнє середовище і мають токсичну дію. Це відкриває можливість створення технологій розкладання лігніноцелюлозних відходів деревообробної і харчової галузей промисловості та сільського господарства, а також біоремедіації довкілля із залученням дереворуйнівних базидіоміцетів [4, 6, 13]. Неспецифічний характер дії лігнін-деградуючих ензиматичних систем ксилотрофів пов'язують з утворенням вільних радикалів, у тому числі перекисних радикалів ліпідів, які мають високу реакційну здатність [4, 10, 11]. Отже існує необхідність пошуку штамів ксилотрофних базидіоміцетів, які мають високий рівень вільнорадикальних процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) в культуральній рідині, та водночас є стійкими до негативного впливу активних форм кисню і здатні швидко нарощувати біомасу. Відомі результати дослідження, в якому для твердофазного культивування Trametes hirsuta з метою отримання лактази, застосовували різні харчові відходи, такі як яблучні, апельсинові і картопляні рештки. При 8-денній ферментації Trametes hirsuta на картопляних очистках були отримані високі результати лактазної активності. Вона становила 5000 од/л, що було вище, ніж повідомлялося раніше. Не проводилося культивування досліджуваного штаму Trametes hirsuta глибинним методом, не визначалася інтенсивність процесів ПОЛ [12]. Відомі результати порівняльного дослідження оксидазної активності 20 штамів дереворуйнівних грибів роду Trametes Fr. в глибинній культурі. Встановлено діапазон максимальної продуктивності за екстрацелюлярною оксидазною активністю для різних видів. Показано відсутність кореляції між оксидазною активністю в глибинній культурі і величиною зони зафарбування на агаризованих середовищах (реакція Бавендамма). З найбільш продуктивних штамів Т. hirsuta 56 і Т. ochracea 92-78 отримані лаккази, гомогенні за даними ДДС-електрофорезу. Визначено деякі біохімічні показники, що характеризують дані ферменти. Не проводилося визначення інтенсивності процесів ПОЛ в культуральній рідині та міцелії досліджуваних штамів [1]. Відомі результати порівняльного дослідження вмісту в грибах продуктів ПОЛ. Штами ксилотрофних базидіоміцетів культивують в глибинній культурі на глюкозо-пептонному середовищі. Надаються дані щодо вмісту продуктів ПОЛ в гомогенатах міцелію і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп. Не представлено даних про вміст продуктів ПОЛ в культуральній рідині штамів, не досліджувалися штами Trametes hirsuta [3]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжністю результату є штам F-610 Flammulina velutipes, в міцеліальних культурах якого, отриманих шляхом штучного культивування на живильних середовищах, які містять фенол у концентрації 0,005-0,15 %, проводять визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів з метою визначення ступеня токсичного навантаження фенолом на природні системи [5]. Було застосовано модифікацію методу визначення продуктів ПОЛ, що не дозволяє порівняти отримані дані з іншими дослідженнями, інтенсивність процесів ПОЛ не досліджувалася при глибинному методі культивування, а використання методу поверхневого культивування може бути не ефективним в біотехнологічних процесах, не було досліджено штами Trametes hirsuta. Задача корисної моделі отримати новий штам соматичних структур ксилотрофного базидіоміцету Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd, який відрізняється від прототипу за видовою приналежністю та високою інтенсивністю процесів ПОЛ в культуральній рідині, отже є продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Th-11 гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd, згідно з корисною моделлю, має високу інтенсивність процесів ПОЛ в 1 UA 82088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культуральній рідині при глибинному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0°С протягом 6-ти діб на лабораторній качалці. Інтродукований штам Th-11 ксилотрофного базидіоміцета Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкта дослідження. Царство: Fungi Відділ: Basidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes Incertae sedis Порядок: Polyporales Родина: Polyporaceae Рід: Trametes Вид: Trametes hirsuta Штам Th-11 Trametes hirsuta отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів з дикорослих плодових тіл [8], що були зібрані на пні листяного дерева (ймовірно роду тополя Populus) в м. Донецьку у 2011 році. Пласкуваті плодові тіла знаходилися на деревині в черепицеподібній групі. Плодові тіла напівкруглі або ниркоподібні, діаметром 6-12 см, сидячі. Поверхня дуже густо опушена, концентрично зонально-борозниста, зони сірого кольору чергуються зі світлішими. Край жовтуватого кольору. Ворсинки вертикальні, жорсткі, до 4 мм, сірі. Гіменофор трубчастий, сіруватий. Пори у кількості 3-4 шт. на 1 мм, округлі, рівновеликі, трубочки доволі товстостінні, довжиною до 5 мм. М'якоть біла, шкіряста, при розриві волокнисто-ватоподібна, без запаху. Гіфальна система тримітична. Генеративні гіфи розгалужені, мають тонкі або дещо потовщені стінки, септи і пряжки. їхній діаметр складає 2,5-4 мкм. Скелетні гіфи товстостінні, гіалінові, довгі, діаметром 4-7 мкм. Зв'язуючі гіфи звивисті, сильно розгалужені, товстостінні, діаметром 2,5-6 мкм. Базидії розміром 12-15  4-5 мкм. Споровий порошок білого кольору. Спори безбарвні, гладенькі, циліндричні, розміром 6-8  22,5 мкм. Чисту міцеліальну культуру штаму Τη-11 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. Культурально-морфологічні ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам Th-11 культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі і картопляно-глюкозному агарі в чашках Петрі, а також на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі в поверхневій та глибинній культурі. На агаризованому середовищі міцелій розповсюджується рівномірно. Колонія гриба має круглу форму. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті повітряні гіфи. Молодий ростучий міцелій пухкий, висота повітряних гіф становить близько 4 мм, через 15-20 діб він стає більш щільним, дуже міцним і жорстким, притиснутим до поверхні. З часом (півтора - два місяці) займає майже весь простір над середовищем в пробірці або чашці Петрі. Утворює примордії та плодові тіла на краю колонії. Колір міцелію білий, при старінні жовтуватий. Субстрат не забарвлює. Аромату не має. На рідкому середовищі в статичній культурі через 4-5 діб штам утворює міцеліальну плівку, що повністю вкриває поверхню середовища. Висота повітряних гіф менша, ніж при рості на агаризованому середовищі - близько 2 мм, а занурений міцелій досить швидко (7-10 діб) займає весь об'єм середовища. Молодий міцелій білий, а старий набуває жовтуватого відтінку. Примордій і плодових тіл не утворює. При глибинній ферментації штам утворює сферичні структури білого кольору - пелети. Діаметр пелетів 4-9 мм, що залежить від терміну культивування, співвідношення об'єму живильного середовища та інокулюму, ступеня подрібненості останнього. На поверхні пелетів присутні численні радіальні міцеліальні тяжі. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба септовані, з пряжками, тонкостінні, гілчасті. Діаметр гіф складає 2,5-4 мкм. Стінки незабарвлені. Фізіолого-біохімічні ознаки. Аероб. Швидкість росту висока. Росте при температурі 24,032,5°С. Для росту в культурі використовує моно-, ді- та поліцукри, а також органічний, амонійний та нітратний азот. Приклад конкретного виконання. В цьому прикладі описується скринінгове культивування 10 штамів 7 видів ксилотрофних базидіоміцетів, зокрема, штаму Trametes hirsuta Th-11 і визначення ростових показників та інтенсивності процесів ПОЛ в міцелії та культуральному фільтраті (КФ). 2 UA 82088 U 5 10 15 20 25 30 35 З метою визначення ростових показників та інтенсивності ПОЛ в міцелії та КФ, штами культивують глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 50 мл. Готують ГПС наступного складу, г/ л [5]: Глюкоза - 10,0; пептон - 3,0; КН2РО4 - 0,6; К2НРО4 - 0,4; MgSO4•7H2O - 0,5; СаСl2 - 0,05; ZnSO4•7H2O - 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Співвідношення C:N дорівнює 13:1, рН становить 6,70 одиниць. Готове живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2°С протягом 45 хвилин. Після стерилізації рН середовища складає 6,62±0,05 од. Стерильне охолоджене до кімнатної температури середовище інокулюють чистою 7-ми денною глибинною міцеліальною культурою штаму Th-11, вирощеною на ГПС. Контроль чистоти інокулюму проводять за допомогою світлового мікроскопу, наприклад, XS-5520 MICROmed. Готують мікропрепарат за загальноприйнятими методиками, розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, констатують відсутність бактеріальних клітин. Інокуляцію здійснюють асептично шляхом внесення 5 мл (10% за об'ємом) посівної культури за допомогою стерильної піпетки. Культивування проводять при температурі 25°С 6 діб на лабораторній качалці зі зворотнопоступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Наприкінці терміну ферментації міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат. Водневий показник культурального фільтрату визначають потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі "рН-150МИ". Міцелій промивають дистильованою водою. Вимірюють концентрацію абсолютно сухої біомаси міцелію ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних бюксах при 105°С до постійної маси та зважують. Інтенсивність процесів ліпідної пероксидації в водній витяжці гомогенізованого міцелію (МГ) та КФ визначають за вмістом продуктів ПОЛ, активних до тіобарбітурової кислоти (ТБК-АП), з використанням модифікації методу [7]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють за допомогою Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Таблиця Накопичення біомаси та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів в міцелії і культуральному фільтраті штамів ксилотрофних базидіоміцетів Вид Flammulina velutipes Fistulina hepatica Ganoderma hicidum Pleurotus ostreatus Trametes hirsuta Trametes trogii Trichaptum biforme Примітка: p  0,05 40 Штам F-107 F-610 Fh-09 G.1.-1 P-089 P-191 Р-кл Th-11 Tt-11 Tb-11 Біомаса, г/ л 3,04±0,ll 3,39±0,3 3,79±0,13 1,29±0,07 3,51±0,24 3,79±0,11 1,70±0,08 3,87±0,09 3,57±0,22 2,01±0,15 pH КФ 6,08 6,24 6,04 3,23 6,74 6,68 6,76 3,78 4,51 6,69 ТБК-АП, нмоль/ г (мл) Міцелій КФ 130,45±8,19 0,86±0,06 114,20±10,00 0,87±0,06 109,15±8,78 0,95±0,01 82,43±4,12 0,84±0,01 85,13±6,65 1,00±0,03 68,60±5,33 0,88±0,02 79,97±8,88 0,85±0,05 91,96±3,49 1,53±0,09 95,21±5,03 1,25±0,03 123,74±6,44 1,02±0,08 Таким чином, запропонований штам Th-11 базидіального гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd є високоактивним продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів і може 3 UA 82088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 бути використаний при моделюванні біотехнологічних процесів в різних галузях промисловості та сільського господарства для отримання біологічно активних речовин, та в екології в процесах деструкції та біоремедіації. Джерела інформації, які використані при складанні заявки: 1. Горшина Е.С. Динамика оксидазной активности в процессе культивирования базидиальных грибов рода Trametes Fr. / Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, В.В. Бирюков, О.В. Морозова, СВ. Шлеев, А.И. Ярополов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006., № 6. С. 638 -644. 2. Кадималиев Д.А. Влияние модификации древесины на потребление лигнина и синтез лигнолитических ферментов грибом Partus (Lentinus) tigrinus / Д.А. Кадималиев, В.В. Ревин, Н.А. Атыкян, В.Д. Самуилов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003., №5. - С. 555 560. 3. Капич А.Н. Содержание в грибах продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой / А.Н. Капич, Т.С. Гвоздкова // Микология и фитопатология. - 1998. - Вып. 4. - С. 30 -36. 4. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов /А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : сб. науч. тр. - 2011. - Т. 3. - С. 316-335. 5. Патент 57945 України. Спосіб мікотестування забруднення навколишнього середовища фенолом / Федотов О.В., Перцевой М.С. Заявка № и201009019, від 19.07.2010, МПК (2011.01), кл. A01G7/00, А01Н15/00 Бюл.№ 6, від 25.03.2011. (прототип) 6. Рабинович М.Л. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами (обзор) / М.Л. Рабинович, А.В. Болобова, Л.Г. Васильченко // Прикладная биохимия и микробиология. 2004., № 1.-С.5-23. 7. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д.Стальная, Т.Г.Гаришвили / Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66 - 68. 8. Федотов О.В. Колекція культур шапинкових грибів - основа мікологічних досліджень та стратегії збереження біорізноманіття базидіоміцетів / О.В. Федотов, О.В. Чайка, Т.Є. Волошко, А.К. Велигодська // Вісник Донецького національного університету. Серія А природничі науки. Донецьк, ДонНУ, 2012. - № 1. - С 209 - 213. 9. Явметдинов И.С. Получение и характеристика гуминоподобных веществ, синтезируемых дереворазрушающими грибами, возбудителями белой гнили / И.С. Явметдинов, Е.В. Степанова, В.П. Гаврилова, Б.В. Локшин, И.В. Перминова, О.В. Королева // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003., № 3. - С. 293 - 301. 10. Кігк Т.К. Enzymatic "combustion": the microbial degradation of lignin / Т.К.Kirk, R.L. Farrell // Annal. Rev. Microbiol. - 1987. - P. 465 - 505. 11. Rodriguez Couto S. Laccase activity from the fungus Trametes hirsuta using an air-lift bioreactor / S. Rodriguez Couto, A. Rodriguez, R.R.M. Paterson, N.Lima, J.A. Teixeira // Letters in Applied Microbiology. - 2006. - P. 612-616. 12. Rosales E. New uses of food waste: application to laccase production by Trametes hirsuta / E. Rosales, S. Rodriguez Couto, A. Sanroman // Biotechnology Letters. - 2002., № 9. - P. 701 - 704. 13. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka // Biochem. Eng. J. 2008. - P. 128 -132. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd Th11 - продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4