Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета daedalеa quercina (l.) pers. dq-08 – продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів

Реферат: UA 79323 U UA 79323 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана в медичній галузі для отримання біологічно активних речовин, екології - для деструкції лігноцелюлозних відходів промисловості і сільського господарства. Ксилотрофи є важливими елементами природних екосистем. Вони розкладають деревину та інші рослинні залишки, причому основна роль в цьому процесі належить видам Polyporaceae. Деградація субстрату грибами бурої гнилі, зокрема Daedalea quercina, включає на початковій стадії процесу утворення позаклітинних активних форм кисню. Вони спричинюють вільнорадикальні ланцюгові реакції, внаслідок яких відбувається руйнування складного полімерного комплексу деревини, знижується рівень полімеризації целюлоз та геміцелюлоз, що уможливлює подальший їх метаболізм [1, 6, 11]. Через те, що ці реакції не мають субстратної специфічності, стає можливим залучення ксилотрофних базидіоміцетів до процесів розкладання лігноцелюлозних відходів деревообробної і харчової галузей промисловості та сільського господарства, а також біоремедіації забруднених середовищ [10, 11]. Крім того, численна група ксилотрофних базидіоміцетів, здатних до синтезу біологічно активних речовин, має широкі перспективи до використання у медицині [8, 9]. Отже, існує необхідність пошуку штамів ксилотрофних базидіоміцетів, які мають високий рівень вільнорадикальних процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) в культуральній рідині, та водночас є стійкими до негативного впливу активних форм кисню і ефективно нарощують біомасу. Відомі результати дослідження хімічного складу, морфологічних особливостей та антимікробної і протигрибкової активності Daedalea quercina. Досліджувалися спорокарпи, не здійснювалося виділення отриманих штамів в чисту культуру. Не проводилися дослідження процесів ПОЛ [7]. Відомі результати дослідження ферментативної системи Daedalea quercina, залученої до процесу руйнування деревини, згідно з яким ксилотроф D. quercina культивується на рідкому живильному середовищі з метою отримання лаккази. Було виділено, очищено та охарактеризовано лакказу з культуральної рідини і оцінено можливість її застосування для знебарвлення синтетичних барвників. Не проводилося визначення інтенсивності процесів ПОЛ в культуральній рідині та міцелії досліджуваного штаму [5]. Відомі результати порівняльного дослідження вмісту в грибах продуктів ПОЛ. Штами ксилотрофних базидіоміцетів культивують в глибинній культурі на глюкозо-пептонному середовищі. Надаються дані щодо вмісту продуктів ПОЛ в гомогенатах міцелію і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп. Не представлено даних про вміст продуктів ПОЛ в культуральній рідині штамів, а також не досліджувалися штами Daedalea quercina [2]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є штам F-610 Flammulina velutipes, в міцеліальних культурах якого, отриманих шляхом штучного культивування на живильних середовищах, які містять фенол у концентрації 0,005-0,15 %, проводять визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів з метою визначення ступеня токсичного навантаження фенолом на природні системи [3]. Було застосовано модифікацію методу визначення продуктів ПОЛ, що не дозволяє порівняти отримані дані з іншими дослідженнями, не досліджувалася інтенсивність ПОЛ при глибинному методі культивування, а використання методу поверхневого культивування не є ефективним в біотехнологічних процесах, не досліджувалися штами Daedalea quercina. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму соматичних структур ксилотрофного базидіоміцету Daedalea quercina (L.) Pers., який відрізняється від прототипу за видовою приналежністю та високою інтенсивністю процесів ПОЛ в культуральній рідині, отже є продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Dq-08 гриба Daedalea quercina (L.) Pers., згідно з корисною моделлю, має високу інтенсивність процесів ПОЛ в культуральній рідині при глибинному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 25,0 °C протягом 6-ти діб на лабораторній качалці. Інтродукований штам Dq-08 макроскопічного гриба Daedalea quercina (L.) Pers. має наступні характеристики. Систематичне положення об'єкта дослідження. Царство: Fungi Відділ: Вasidiomycota Підвідділ: Agaricomycotina Клас: Agaricomycetes Incertae sedis 1 UA 79323 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Порядок: Polyporales Родина: Fomitopsidaceae Рід: Daedalea Вид: Daedalea quercina Штам Dq-08 Daedalea quercina отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур базидіоміцетів з дикорослих плодових тіл [3], що були зібрані на деревині ушкодженого дуба звичайного або черешчатого (Quercus robur L., синонім - Q. pedunculata) в Краснолиманському лісництві у 2008 році. Чисту міцеліальну культуру штаму Dq-08 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців. Культурально-морфологічні ознаки. Для дослідження культурально-морфологічних ознак штам Dq-08 культивували на агаризованому незахміленому пивному суслі і картопляно-глюкозному агарі в чашках Петрі, та на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі в поверхневій та глибинній культурі. На агаризованому середовищі міцелій розповсюджується рівномірно. Субстратні і повітряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвинуті субстратні гіфи. Колонія гриба має круглу форму, в центрі більш щільна, гіфи притиснуті до поверхні; на периферії пухка, висота повітряних гіф становить близько 3 мм. Субстрат не забарвлює. Колір молодої колонії білий. Має фруктовий аромат. За тривалого зберігання косяків з культурою, повітряний міцелій набуває світло-бурого відтінку, можливе утворення плодових тіл. На рідкому середовищі в поверхневій культурі через 5-6 діб утворюється досить щільна міцеліальна плівка. З часом занурений міцелій займає весь об'єм середовища, а поверхневий набуває гетерогенної структури: ділянки плівки, що знаходяться урівень з поверхнею середовища, чергуються з ділянками висотою до 4-х мм, утвореними сплетіннями повітряних гіф. Колір міцелію протягом всього терміну культивування залишається білим. При ферментації в глибинній культурі штам росте у вигляді сферичних структур - пелетів білого кольору. Поверхня пелетів рівна. Діаметр до 8 мм, що залежить від терміну культивування, співвідношення об'єму живильного середовища та інокулюму, ступеня подрібненості останнього. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, часто розгалужені, звивисті, вони тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і багаточисельні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях появи пряжок, так і між клітинами без пряжок. Стінки незабарвлені, нерівномірно потовщені. Просвіти молодих гіф до 6 мкм, при старінні звужуються. Хламідоспори численні, яйцеподібні, з товстими стінками, 13-15 мкм в діаметрі. Апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. Під час старіння в клітинах міцелію з'являються вакуолі, жирові включення та кристали. Споровий відбиток білого кольору. Спори еліпсоїдальні, розміром 3×6 мкм. Фізіолого-біохімічні ознаки. Аероб. Росте при температурі 22-28 °C. Для росту в культурі використовує моно-, ди- та поліцукри, а також органічний, амонійний та нітратний азот. Приклад конкретного виконання. В цьому прикладі описується скринінгове культивування 10 штамів 8 видів ксилотрофних базидіоміцетів, зокрема, штаму Daedalea quercina Dq-08 і визначення ростових показників та інтенсивності процесів ПОЛ в міцелії та культуральному фільтраті (КФ). Для визначення ростових показників та інтенсивності ПОЛ, штами культивують глибинним методом на глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) об'ємом 50 мл. Готують ГПС наступного складу, тіл [3]: Глюкоза 10,0 Пептон 3,0 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 MgSO4·7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4·7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра. Середовище має наступні характеристики: співвідношення C:N дорівнює 13:1, рН становить 6,70 одиниць. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126 ± 2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,6 ± 0,05 од. 2 UA 79323 U 5 10 15 20 Як інокулюм використовують чисту 7-ми денну глибинну міцеліальну культуру штаму Dq-08, вирощену на ГПС. Контроль чистоти інокулюму проводять за допомогою світлового мікроскопа, наприклад XS-5520 MICROmed. Розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, констатують відсутність бактеріальних клітин. Інокуляцію здійснюють асептично шляхом внесення 5 мл (10 % за об'ємом) посівної культури за допомогою стерильної піпетки. Термін культивування складає 6 діб при температурі 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Оптимальний режим культивування визначено експериментально. Наприкінці ферментації міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат. Водневий показник культурального фільтрату встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрі „рН-150МИ". Міцелій промивають дистильованою водою. Вимірюють концентрацію абсолютно сухої біомаси міцелію ваговим методом. Для цього міцелій висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують. Інтенсивність процесів ліпідної пероксидації в водній витяжці гомогенізованого міцелію (МГ) та КФ визначають за вмістом продуктів ПОЛ, активних до тіобарбітурової кислоти (ТБК-АП), з використанням модифікації методу [4]. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакета програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Таблиця Накопичення біомаси та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів в міцелії і культуральному фільтраті штамів ксилотрофних базидіоміцетів Вид Agrocybe aegerita Daedalea quercina Flammulina velutipes Fistulina hepatica Ganoderma lucidum Pleurotus ostreatus Trametes trogii Trichaptum biforme Штам Біомаса, г/л рH КФ 167 Dq-08 F-112 F-610 Fh-09 G.1.-1 P-01 P-105 Tt-11 Tb-11 3,12 ± 0,08 3,38 ± 0,19 3,62 ± 0,09 3,39 ± 0,3 3,79 ± 0,13 1,29 ± 0,07 3,00 ± 0,08 2,65 ± 0,13 3,57 ± 0,22 2,01 ± 0,15 6,51 4,81 6,12 6,24 6,04 3,23 6,66 6,82 4,51 6,69 ТБК-АП, нмоль/г (мл) Міцелій КФ 92,32 ± 7,69 1,00 ± 0,15 72,06 ± 9,51 1,46 ± 0,06 115,24 ± 8,14 0,88 ± 0,13 114,20 ± 10,00 0,87 ± 0,06 109,15 ± 8,78 0,95 ± 0,01 82,43 ± 4,12 0,84 ± 0,01 92,00 ± 3,33 0,97 ± 0,03 73,82 ± 0,76 0,94 ± 0,04 95,21 ± 5,03 1,25 ± 0,03 123,74 ± 6,44 1,02 ± 0,08 Примітка: р ≤ 0,05 25 30 35 40 Таким чином, запропонований штам Dq-08 базидіального гриба Daedalea quercina (L.) Pers. є високоактивним продуцентом екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів і може бути використаний в при моделюванні біотехнологічних процесів і в медичній галузі, як продуцент біологічно активних речовин; екології - у біоремедіації та для деструкції відходів різних галузей промисловості і сільського господарства. Штам Dq-08 Daedalea quercina (L.) Pers. зберігається в колекції культур шапинкових грибів кафедри фізіології рослин Донецького національного університету та переданий для зберігання у Колекцію культур шапинкових грибів Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (ІВК). Джерела інформації: 1. Капич А.Н. Определение антиоксидантной активности на модели перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного грибной марганец пероксидазой / А.Н. Капич, Т.В. Корнейчик // Успехи медицинской микологии.-2007. - Т. 9. - С. 162-164. 2. Капич А.Н. Содержание в грибах продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой / А.Н. Капич, Т.С. Гвоздкова // Микология и фитопатология.-1998. - Т, 32, вып. 4. - С. 30-36. 3. Патент 57945 України. Спосіб мікотестування забруднення навколишнього середовища фенолом / Федотов О.В., Перцевой М.С. Заявка № u201009019, від 19.07.2010, МПК (2011.01), кл. A01G7/00, А01Н15/00 Бюл. № 6, від 25.03.2011. (прототип) 3 UA 79323 U 5 10 15 20 4. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили / Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68. 5. Baldrian P. Purification and characterization of laccase from the white-rot fungus Daedalea quercina and decolorization of synthetic dyes by the enzyme / P. Baldrian // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2004. - 63. - P. 560-563 6. Hammel К. Е. Reactive oxygen species as agents of wood decay by fungi / K.E. Hammel, A.N. Kapich, K.A.Jr. Jensen, Z.C. Ryan // Enzyme and Microbial Technology. - 2002. - 30. - P. 445-453. 7. Ofodile L. N. Chemomorphological study and antimicrobial activity of Daedalea quercina / L.N. Ofodile, N.U. Uma, L.E. Attah, M.S.J Simmonds, O.E. Popoola // acta SATECH. - 2010. - 3 (2). P. 102-107. 8. Wasser S.P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. / S.P. Wasser // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - 89. - P. 1323-1332. 9. Wasser S.P. Medicinal mushrooms: Past, present and future. / S.P. Wasser, K.M. Sytnik, A.S. Buchalo, E.F. Solomko // Ukrainian Botanical Journal.-2002.-59(5). - P. 499-524. 10. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka // Biochem. Eng. J. 2008. - 42. - P. 128-132. 11. Xu G. Mechanisms of wood degradation by brown-rot fungi: chelator-mediated cellulose degradation and binding of iron by cellulose / G. Xu, B. Goodell // Journal of Biotechnology. - 2001. 87. - P. 43-57. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Daedalea quercina (L.) Pers. Dq-08 продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4