Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до cпосoбу одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту фумарату натрію масовою часткою 0,2 %, після внесення фумарату натрію рН підтримують на рівні 8,0-8,2 періодичним підкисленням розчином лимонної кислоти. UA 103817 C2 (12) UA 103817 C2 UA 103817 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis ІMB Ас-5017 [Пат. 92819 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Тарасенко Д.О., Яцук Д.В. Опубл. 10.12.2010, Бюл. № 23], який передбачає культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для підвищення концентрації ПАР та скорочення тривалості культивування продуцента на початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом чи гексадеканом вносять 0,2-0,25 % фумарату і 0,1-0,15 % цитрату. Недоліком цього способу є недостатньо висока умовна концентрація поверхнево-активних речовин. В основу винаходу поcтавлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує умовну концентрацію ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії; а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту фумарату натрію масовою часткою 0,2 %. Згідно з винаходом, після добавлення фумарату рН підтримують на рівні 8,0-8,2 періодичним підкисленням розчином лимонної кислоти. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Підтримання рН ні рівні 8,0-8,2 (після внесення у середовище культивування на початку стаціонарної фази росту фумарату натрію масовою часткою 0,2 %) періодичним підкисленням розчином лимонної кислоти дає змогу підвищити на 40^45 % умовну концентрацію ПАР. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3-1,3; MgSO47H2O0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4 0,14; FeSO47H2O-0,001; рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують гексадекан або етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % етанолу чи гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту у середовище вносять 0,2 % фумарату натрію, після чого рН підтримують на рівні 8,0-8,2 періодичним підкисленням 10 %-ним розчином лимонної кислоти. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити на 40-45 % умовну концентрацію ПАР. Приклад 1. Вплив лимонної кислоти на синтез ПАР R. erythropolis IMB Ас-5017 на гексадекані і етанолі Згідно з прототипом, фумарат і цитрат вносили у середовище культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 у вигляді натрієвих солей, асиміляція яких у мікроорганізмів здійснюється симпортом з протоном, що супроводжується підвищенням рН культуральної рідини до 9-9,5. Для більшості продуцентів мікробних поверхнево-активних речовин оптимальним для синтезу цих сполук є рН, близьке до нейтрального. У зв'язку з цим припустили, що використання замість цитрату натрію лимонної кислоти дасть змогу унеможливити значне підвищення рН і таким чином збільшити кількість синтезованих R. erythropolis IMB Ас-5017 поверхнево-активних речовин. Культивування штаму ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; MgSO47H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO47H2O0,001; рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % 1 UA 103817 C2 5 10 15 етанолу чи гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту у середовище вносять (%, масова частка): фумарат натрію - 0,2 і цитрат натрію - 0,1; а також фумарат натрію - 0,2 і лимонну кислоту - 0,08 %. Концентрації цитрату натрію (0,1 %) і лимонної кислоти (0,08 %) еквімолярні за вуглецем. Фумарат натрію, цитрат натрію і лимонну кислоту вносять у середовище у вигляді 10 %-них розчинів. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Поверхневий натяг (ςs) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності as від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР за R. erythropolis EK-1 на етанолі і гексадекані за присутності фумарату і лимонної кислоти (цитрату). Таблиця 1 Синтез ПАР за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на етанолі і гексадекані за присутності фумарату натрію, цитрату натрію і лимонної кислоти Джерело вуглецю Етанол Гексадекан 20 25 30 35 Концентрація органічних кислот, % 0 Фумарат натрію, 0,2+цитрат натрію, 0,1 (прототип) Фумарат натрію, 0,2+лимонна кислота, 0,08 0 Фумарат натрію, 0,2+цитрат натрію, 0,1 (прототип) Фумарат натрію, 0,2+лимонна кислота, 0,08 рНкін ПАР* 7,2±0,36 9,3±0,47 8,5±0,42 7,5±0,38 9,4±0,48 8,4±0,42 3,4±0,17 5,1±0,25 5,5±0,27 3,4±0,17 6,6±0,33 6,8±0,34 Як видно з наведених у табл. 1 даних, заміна цитрату натрію на лимонну кислоту супроводжується незначним підвищенням показника умовної концентрації поверхнево-активних речовин. Приклад 2. Вплив рН на синтез ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1) у ферментаторі АК-210 (Пущино, Росія) об'ємом 10 л (робочий об'єм 7 л) упродовж 48 год. при 30 °C. Початкова концентрація гексадекану становить 0,2 % (об'ємна частка). У процесі культивування бактерій здійснюють дробне внесення субстрату порціями по 0,3-0,4 % кожні 5-6 год. до кінцевої концентрації 2,0 %. На початку процесу швидкість перемішування становить 250 об/хв, витрати повітря - 0,2 л/л середовища за хв. У процесі культивування швидкість перемішування збільшують до 380-400 об/хв, а витрати повітря - до 1,2 л/л середовища за хв, підтримуючи концентрацію розчиненого кисню (рО2) на рівні 60-70 % (від насичення повітрям). Упродовж культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 у ферментаторі значення рН підтримують на рівні 7,0; 7,5; 8.0; 8,2 і 8,5 підкисленням 1 н розчином НСІ або підлужненням 1 н розчином NaOH. Умовну концентрацію ПАР визначають як описано у прикладі 1. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Дані з впливу різних значень рН на синтез ПАР штамом ТМВ Ас-5017 наведено у табл. 2. 2 UA 103817 C2 Таблиця 2 Залежність показників синтезу поверхнево-активних речовин R. erythropolis ІMB Ас-5017 від рН середовища рН 7,0 7,5 8,0 8,2 8,5 5 10 15 20 25 30 ПАР* 2,0 3,2 5,4 5,3 4,3 Е24, % 100±5 68±3 50±2 52±2 50±2 Як видно з наведених у табл. 2 даних, оптимальним для синтезу ПАР R. erythropolis ІMB Ас5017 є рН 8,0-8,2, за якого умовна концентрація ПАР становить 5,3-5,4. Приклад 3. Дослідження можливості регуляції рН лимонною кислотою за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на середовищі з етанолом (гексадеканом) і фумаратом. Культивування штаму ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; MgSO47H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO47H2O0,001; рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують гексадекан і етанол у концентрації 2,0 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % етанолу чи гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту у середовище вносять 0,2 % (масова частка) фумарату натрію і надалі у міру підвищення рН здійснюють періодичну регуляцію рН культуральної рідини розчином лимонної кислоти. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Показники синтезу ПАР оцінюють як описано у прикладах 1 і 2. Дані щодо використання лимонної кислоти для регуляції рН у процесі культивування штаму IMB Ас-5017 на етанолі наведено у табл. 3. Результати, наведені у табл. 3 свідчать, що навіть за періодичного доведення рН до 8,0 лимонною кислотою спостерігається підвищення на 30 % умовної концентрації ПАР порівняно з показниками процесу без регуляції рН, коли у середовище з етанолом одночасно добавляли фумарат натрію і лимонну кислоту. У разі титрування лимонною кислотою показник ПАР* був на 40 % вищим, ніж за наявності у середовищі фумарату і цитрату натрію, і на 95 % - порівняно з культивуванням бактерій на середовищі без органічних кислот. За періодичної регуляції рН лимонною кислотою на 14-20 % підвищувався й індекс емульгування культуральної рідини (табл. 3). Важливо зазначити, що у разі використання замість лимонної кислоти розчину гідроокису натрію для періодичного підкислення культуральної рідини упродовж вирощування R. erythropolis ІMB Ас-5017 на середовищі з етанолом і фумаратом натрію спостерігали незначне (на 5-8 %) підвищення умовної концентрації ПАР. Таблиця 5 Вплив періодичної регуляції рН лимонною кислотою на синтез ПАР за умов росту R. erythropolis ІMB Ас-5017 на середовищі з етанолом і фумаратом Концентрація органічних кислот, % Фумарат натрію 0,2+цитрат натрію, 0,1 Фумарат натрію 0,2+лимонна к-та 0,08 Фумарат натрію 0,2 Регуляція рН упродовж процесу рНкінц ПАР*, % від контролю Е24, % від контролю 9,3±0,47 155+5 125+5 8,5±0,2 165±5 130±5 + 8,0±0,2 195±5 144±6 Примітка. Контроль (100 %) - середовище з етанолом (2 %) без внесення органічних кислот. 35 Отже, наведені дані свідчать, що заміна цитрату натрію на еквімолярну за вуглецем концентрацію лимонної кислоти супроводжується підвищенням синтезу поверхнево-активних 3 UA 103817 C2 речовин R. erythropolis ІMB Ас-5017 в результаті як регуляції рН до оптимального для синтезу ПАР рівня, так і стимуляції ліпогенезу. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, джерело вуглецю і енергії, а також внесення у середовище на початку стаціонарної фази росту фумарату натрію масовою часткою 0,2 %, який відрізняється тим, що після добавлення фумарату рН підтримують на рівні 8,0-8,2 періодичним підкисленням розчином лимонної кислоти. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4