Спосіб виділення фактора viii згортання крові

Реферат: Спосіб виділення фактора VIII згортання крові методом негативної афінної сорбції на макропористих кремнеземних сорбентах з лігандами - активними триазиновими барвниками. Як додаткові процедури очищення перед етапом афінної хроматографії пропонується проведення переосадження на гелі гідроксиду алюмінію, поліетиленгліколем (ПЕГ-4000), антивірусної СДобробки та іонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose. UA 107509 U (12) UA 107509 U UA 107509 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології - одержання очищених білкових препаратів, а саме способу очищення фактора згортання крові VIII (FVIII) - і може бути використаний в медико-біологічній промисловості, на станціях переливання крові, а також в науково-дослідних лабораторіях. Плазмові препарати FVIII отримують з плазми крові людини. Кріопреципітат був першим препаратом FVIII, отриманим з цієї сировини. Плазмові продукти, такі як свіжозаморожена плазма та кріопреципітат з низькою питомою активністю FVIII, що використовувалися на ранніх етапах лікування хворих гемофілією, втрачають актуальність на даний час [10]. Кріопреципітат заморожений - білковий компонент плазми крові людини, що містить не менше 70 MO FVIII (антигемофільного глобуліну - АГГ) в одній дозі - і не менше 140 ME в двох дозах, являє собою осад кріоглобулінів білого кольору з 30-40 мл або 65-75 мл залишкової плазми в замороженому стані, і отриманий з однієї або двох доз свіжозамороженої плазми об'ємом, відповідно, не менше 200,0 або 400,0 мл [3]. У замороженому стані - тверда маса жовтуватого кольору, а при розморожуванні і розчиненні на водяній бані при температурі 3537 °C - прозора жовтуватого кольору рідина, не містить механічних домішок. Цей компонент донорської крові заготовляють на гемокоагулянтах з карантинізованої плазми, стерильний, тестований на антитіла до HIV-1/2, вірусу гепатиту С, збудника сифілісу, поверхневого антигену вірусу гепатиту В [6]. Фармокологічні властивості кріопреципітату: володіє антигемораргічним ефектом при підвищених кровотечах, пов'язаних зі зниженням активності та вмісту антигемофільного глобуліну (FVIIIC), фактора фон Віллебранда (FVIIIvW), фібринстабілізуючого фактора (FXIII) і фібриногену (FI). Система гемостазу у фізіологічних умовах забезпечує цілісність судинної стінки та рідкий стан крові в судинному руслі. Це складний ферментативний процес, в якому беруть участь ряд білків-протеаз, активаторів та інгібіторів процесу [1]. Гемофілія А - важкий розлад системи згортання крові, викликаний дефіцитом або повною відсутністю FVIII, що зустрічається приблизно в 1 з 5000 чоловіків і на його поширення не впливає етнічна приналежність. Раніше, на початкових етапах лікування використовували переливання пацієнту цільної крові [12]. В сучасних умовах, з метою корекції дефіциту фактора або для запобігання кровотеч у пацієнтів з гемофілією А, проводять замісну терапію, яка полягає у введені плазмових або рекомбінантних препаратів FVIII [8]. Препарат FVIII використовують як діагностичний для лабораторних досліджень, так і для терапевтичних цілей в медичній практиці при лікуванні хворих на гемофілію А та хворобу фонВіллебранда. Широке застосування препаратів FVIII у лікуванні пацієнтів, хворих на гемофілію А та хворобу фон Віллебранда, стало одним із значних успіхів в історії лікування захворювань. Таке лікування сьогодні дозволяє пацієнтам здолати негативні наслідки і запобігати кровотечам, що призводить до поліпшення якості життя [10]. Способи, які використовують для отримання препаратів FVIII, є поєднанням кількох різних етапів очищення, а саме кріоосадження, осадження домішкових білків методами висолювання, а також використання різного роду хроматографій (іоонообмінної, гель-проникної, афінної та ін.) [11]. Хроматографічні методи передбачають високу специфічність і селективність, дозволяють одержувати біологічні сполуки з адекватною чистотою і в умовах збереження біологічних особливостей. Хроматографія також стала визнаним засобом для промислового отримання терапевтичних біопрепаратів. При отриманні низки препаратів, включаючи рекомбінанатні білки і глікопротеїни, обов'язково використовують одну або кілька хроматографічних стадій очищення [9]. Найближчим по сукупності ознак, подібним до даного винаходу є спосіб [4], який полягає в підвищенні ступеня очищення препарату кріопреципітату шляхом додаткового застосування негативної афінної сорбції на кремнеземних сорбентах з лігандами - активними барвниками триазинової групи та спосіб отримання концентрату FVIII з плазми крові людини [5]. Спосіб корисної моделі [5] полягає в кріоосадженні, розчиненні кріопереципітату в водному розчині гепарину та солюбілізації, сорбції факторів протромбінового комплексу гідроксидом алюмінію, видаленні домішкових білків з допомогою PEG-4000, вірусній інактивації за допомогою сольвент-детергенту, фільтрації та аніонообмінній хроматографії на EDM-TMAE Fractogel, елюції буфером, що містить NaCl, стабілізації альбуміном та ліофілізації отриманого зразка. У патенті України на винахід [4] передбачено декілька стадій виробництва: 1 UA 107509 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1) одержання кріопреципітату із плазми шляхом її заморожування-розморожування, відділення кріопреципітату центрифугуванням; розчинення осаду кріопреципітату у буферному розчині; 2) афінна хроматографія розчину кріопреципітату на кремнеземних макропористих сорбентах з різними лігандами - барвниками триазинового ряду (Силохром-Procion blue HB, Силохром-Procion blue MXR, Силохром-Активний яскраво-голубий К та Силохром-Активний червоний 4ЖТ). Задачею корисної моделі є підвищення ступеня очищення та безпеки препарату кріопреципітату замороженого шляхом поєднання проведення попереднього осадження домішкових білків, сольвент-детергентної (СД) антивірусної обробки, іоонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose та етапу негативної афінної хроматографії на макропористих кремнеземних сорбентах з барвниками-лігандами. Поставлена задача вирішується поетапним осадженням домішкових білків гідроксидом алюмінію, поліетиленгліколем ПЕГ-4000, СД-антивірусною обробкою та проведенням двох послідовних хроматографічних процесів: іонообмінної та негативної афінної. Відмінність запропонованого способу від прототипу [4] полягає в удосконаленні технології одержання препарату за рахунок етапів очищення кріопреципітату (сольове та ПЕГфракціонування), СД-обробки та проведення іонообмінної хроматографії. Синтез кремнеземних сорбентів з іммобілізованими барвниками здійснювали згідно роботи [7]. Кількісне визначення FVIII проводили за одностадійною уніфікованою методикою [2]. В представлених прикладах кількість білка наведена в мг, питома активність антигемофільного фактора виражена в міжнародних одиницях МО/мг білка. Приклад 1. Кріопрециптат розморожували на водяній бані при температурі +(35-37)°С, центрифугували 30 хв. при 2700 g на центрифузі фірми Eppendorf 5702R при +8 °C. Осадження домішкових білків у кріосупернатанті проводили 3 %-ним гідроксидом алюмінію при кімнатній температурі, перемішуючи на магнітній мішалці протягом 15 хв. Додаткове осадження білків та ліпопротеїнів здійснювали за допомогою розчину PEG-4000 до кінцевої концентрації поліетиленгліколю 3,5 % за аналогічних умов. Центрифугували 20 хв. при 2700 g на центрифузі фірми EPPENDORF 5702R при +8 °C. Отриманий супернатант піддавали СД обробці (Твін 80 1 %/три-(n-бутил)фосфат 0,1 %) при 20 °C протягом 6 год. Забуферювали до рН 7,0. Кінцева концентрація складових буферу: 0,05М тріс-НСl; 0,001 М СаСl2; 0,1М NaCl та 0,01 М Na3цитрату. Наступним етапом проводили іонообмінну хроматографію на DEAE-Sepharose, забуферену цим же буфером. Елюцію FVIII здійснювали вихідним буфером з підвищеною іонною силою - 0,3М NaCl. Далі проводили наступний етап афінної хроматографії на сорбенті Силохром-Procion blue НВ, врівноваженого 0,05 М тріс-НСl буфером, рН 7,4. Оскільки FVIII не зв'язується цим сорбентом, в проскоці відмітили зростання питомої активності в наслідок зв'язування з хроматографічною матрицею домішкових білків. В результаті чого питома активність FVIII зросла в 74 рази (від 0,087 МО/мг білка до 6,471 МО/мг білка відповідно); у порівнянні з прототипом в 47 разів (від 0,138 МО/мг білка до 6,471 МО/мг білка). Приклад 2 Кріопрециптат розморожували на водяній бані при температурі +(35-37)°С, центрифугували 30 хв. при 2700 g на центрифузі фірми Eppendorf 5702R при +8 °C. Осадження домішкових білків у кріосупернатанті проводили 3 %-ним гідроксидом алюмінію при кімнатній температурі, перемішуючи на магнітній мішалці протягом 15 хв. Додаткове осадження білків та ліпопротеїнів здійснювали за допомогою розчину PEG-4000 до кінцевої концентрації поліетиленгліколю 3,5 % за аналогічних умов. Центрифугували 20 хв. при 2700 g на центрифузі фірми EPPENDORF 5702R при +8 °C. Отриманий супернатант піддавали СД обробці (Твін 80 1 %/три-(nбутил)фосфат 0,1 %) при 20 °C протягом 6 год. Забуферювали до рН 7,0. Кінцева концентрація складових буферу: 0,05М тріс-НСl; 0,001 М СаСl2; 0,1М NaCl та 0,01 М Na3-цитрату. Наступним етапом проводили іонообмінну хроматографію на DEAE-Sepharose, забуферену цим же буфером. Елюцію FVIII здійснювали вихідним буфером з підвищеною іонною силою - 0,3М NaCl. Наступний етап афінної хроматографії проводили на сорбенті Силохром-Активний яскравоголубий К, врівноваженого 0,05 М тріс-НСl буфером, рН 7,4. В проскоці відмітили зростання питомої активності в наслідок зв'язування з хроматографічною матрицею домішкових білків. В результаті чого питома активність зросла в 77 раз (від 0,087 МО/мг білка до 6,7568 МО/мг білка відповідно), у порівнянні з прототипом приблизно в 50 разів (від 0,137 МО/мг білка до 6,7568 МО/мг білка). Приклад 3 2 UA 107509 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Кріопрециптат розморожували на водяній бані при температурі +(35-37)°С, центрифугували 30 хв. при 2700 g на центрифузі фірми Eppendorf 5702R при +8 °C. Осадження домішкових білків у кріосупернатанті проводили 3 %-ним гідроксидом алюмінію при кімнатній температурі, перемішуючи на магнітній мішалці протягом 15 хв. Додаткове осадження білків та ліпопротеїнів здійснювали за допомогою розчину PEG-4000 до кінцевої концентрації поліетиленгліколю 3,5 % за аналогічних умов. Центрифугували 20 хв. при 2700 g на центрифузі фірми EPPENDORF 5702R при +8 °C. Отриманий супернатант піддавали СД обробці (Твін 80 1 %/три-(nбутил)фосфат 0,1 %) при 20 °C протягом 6 год. Забуферювали до рН 7,0. Кінцева концентрація складових буферу: 0,05М тріс-НСl; 0,001 М СаСl2; 0,1М NaCl та 0,01 М Na3-цитрату. Наступним етапом проводили іонообмінну хроматографію на DEAE-Sepharose, забуферену цим же буфером. Елюцію FVIII здійснювали вихідним буфером з підвищеною іонною силою - 0,3М NaCl. Далі проводили наступний етап афінної хроматографії на сорбенті Силохром-Активний червоний 4ЖТ, зрівноваженого 0,05 М тріс-НСl буфером, рН 7,4. Питома активність зросла в 75 раз (від 0,087 МО/мг білка до 6,5517 МО/мг білка відповідно), у порівнянні з прототипом в 52 рази (від 0,125 МО/мг білка до 6,5517 МО/мг білка). Приклад 4 Кріопреципітат розморожували на водяній бані при температурі +(35-37)°С, центрифугували 30 хв. при 2700 g на центрифузі фірми Eppendorf 5702R при +8 °C. Осадження домішкових білків у кріосупернатанті проводили 3 %-ним гідроксидом алюмінію при кімнатній температурі, перемішуючи на магнітній мішалці протягом 15 хв. Додаткове осадження білків та ліпопротеїнів здійснювали за допомогою розчину PEG-4000 до кінцевої концентрації поліетиленгліколю 3,5 % за аналогічних умов. Центрифугували 20 хв. при 2700 g на центрифузі фірми EPPENDORF 5702R при +8 °C. Отриманий супернатант піддавали СД обробці (Твін 80 1 %/три-(nбутил)фосфат 0,1 %) при 20 °C протягом 6 год. Забуферювали до рН 7,0. Кінцева концентрація складових буферу: 0,05М тріс-НСl; 0,001 М СаСl2; 0,1M NaCl та 0,01 M Na3-цитрату. Наступним етапом проводили іонообмінну хроматографію на DEAE-Sepharose, забуферену цим же буфером. Елюцію FVIII здійснювали вихідним буфером з підвищеною іонною силою - 0,3М NaCl. Далі проводили наступний етап афінної хроматографії на сорбенті Силохром-Procion blue MXR, врівноваженого 0,05 М тріс-НСl буфером, рН 7,4. Питома активність зросла в 86 раз (від 0,087 МО/мг білка до 7,5862 МО/мг білка відповідно) у порівнянні з прототипом в 64 рази (від 0,118 МО/мг білка до 7,5862 МО/мг білка). З наведених даних видно, що ступінь очищення кріопреципітату, який характеризується підвищенням його питомої активності, вищий у пропонованих способах як мінімум в 50 раз. Таким чином, проведення додаткових етапів очищення кріопреципітату, СД-обробки та іонообмінної хроматографії перед процедурою негативної афінної сорбції покращує аналітичні показники та безпеку кінцевого продукту - діагностичного чи лікувального препарату FVIII. Джерела інформації: 1. Виговська Я. I. Гемораргічні захворювання / Виговська Я. I. // Медична література. - Львів: ВАТ "Бібльос", 1998. - 240 с. 2. Козлов А. А. Метод определения активности фактора VIII в плазме крови человека и в антигемофильных препаратах / Козлов А. А. // Весник службы крови. - 2006. - № 3. - С. 35-40. 3. Методические рекомендации "Заготовка и использование криопреципитата замороженного", Киев - 2006. 4. Патент на винахід № 94299, Україна, МПК С07 1/22, С07К 14/755. Спосіб очищення фактора VIII згортання крові / Шурко Н. О., Даниш Т. В., Новак В. Л., ДУ ІПКТМ НАМН; Заявка № 2906990; Заявл. 03.07.2009; Опубл. 26.04.2011, Бюл. № 8 від 26.04.2011. 5. Патент на изобретение № (11)2445947, Россия, МПК С2(13), А61К38/37, А61К35/16. Способ получения концентрата фактора VIII из плазмы крови человека / Воробьев А. И., Берковский А. Л., Юрьев А. С. Заявка № 2010116125/15; Заявл. 26.04.2010; Опубл. 10.11.2011. 6. Приказ МЗ Украины № 211 от 09.03.2010 г. "Порядок контроля за соблюдением показателей безопасности и качества донорской крови и ее компонентов". 7. Синтез кремнеземних сорбентів із лігандами - активними барвниками тріазинового ряду / Т. В. Даниш, М. І. Вороняк, Н. А. Дульцева, Н. О. Шурко // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2008. - В. 47. - С. 63-69. 8. Шурко И. О. Препарати фактора згортання крові VIII та способи їх отримання / Шурко Н. О., Вороняк М. І., Даниш Т. В. // Біологічні студії. - 2014. - Т. 8 (№ 1) - С. 197-204. 9. Burnouf, T. Chromatography in plasma fractionation: benefits and future trends / Burnouf T. // Journal of Chromatography B. - 1995. - Vol. 664. - P. 3-15. 3 UA 107509 U 5 10. De Waure С Gestione terapeutica dell'emofilia A / De Waure C., Cadeddu C., Gualano M.-R. // Italian Journal of Public Health, 2011; 8(2): 17-30. 11. Pat. 6831159US. Method for purifying factor VIII/vWF company by cation-exchange chromatography / M. Fischer, B. Schonberger, T. Urban et al. // Appl. № 09/367.459; Filed: 08.05.2000; Publ. 14.12.2004. 12. Ro Sen, S. Chromogenic determination of factor VIII activity in plasma and factor VIII concentrates / Ro Sen S., Casoni Chiarion M. // Chromogenix-monograph series-2000. - 34 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб виділення фактора VIII згортання крові методом негативної афінної сорбції на макропористих кремнеземних сорбентах з лігандами - активними триазиновими барвниками, який відрізняється тим, що як додаткові процедури очищення перед етапом афінної хроматографії пропонується проведення переосадження на гелі гідроксиду алюмінію, поліетиленгліколем (ПЕГ-4000), антивірусної СД-обробки та іонообмінної хроматографії на DEAE-Sepharose. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4