Спосіб підтримання життєздатності bradyrhizobium japonicum

Реферат: Винахід належить до способу підтримання життєздатності Bradyrhizobium japonicum, що включає приготування поживного середовища з добавкою-стабілізатором, його стерилізацію та культивування бульбочкових бактерій сої в приготованому середовищі, де як добавкустабілізатор використовують альгінат натрію та культивують у ньому Bradyrhizobium japonicum в умовах періодичного культивування. UA 107857 C2 (12) UA 107857 C2 UA 107857 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до способів підтримання життєздатності Bradyrhizohium japonicum та може бути використаний при виготовленні бактеріальних препаратів, які застосовуються в технологіях вирощування сої. Відомо, що штами Bradyrhizohium japonicum [1-4] використовуються при виготовленні мікробних препаратів для передпосівної обробки сої [5]. Найбільш близьким до винаходу аналогом, що прийнятий за прототип є рідкий бактеріальний інокулянт для бактеризації насіння сої [5]. Проте термін зберігання вітчизняних рідких препаратів на основі бульбочкових бактерій, які адаптовані до ґрунтово-кліматичних умов України, становить 20 діб, що в декілька разів менше у порівнянні з порошкоподібними на основі торфу. В основу винаходу поставлено задачу подовжити термін зберігання рідкого інокулянту до 45 місяців (при титрі не меншому 1 млрд. кл./мл препарату), при цьому забезпечивши високу функціональну активність Bradyrhizohium japonicum. Поставлена задача вирішується шляхом культивування Bradyrhizohium japonicum у середовищі, в яке вноситься добавка-стабілізатор. Спосіб підтримання життєздатності Bradyrhizohium japonicum складається з наступних етапів: 1) приготування рідкого поживного середовища для вирощування Bradyrhizohium japonicum; 2) внесення в рідке поживне середовище добавки-стабілізатора альгінату натрію (АН) в кількості від 0,1 до 0,3 % від об'єму середовища; 3) стерилізація поживного середовища з альгінатом натрію за температури 120° С упродовж 30 хвилин; 4) культивування Bradyrhizohium japonicum у приготованому стерильному поживному середовищі зі стабілізатором в умовах періодичного культивування за температури 28±2 °C упродовж 72 годин. Даний спосіб забезпечує збереження життєздатності Bradyrhizohium japonicum та підтримання їх функціональної активності впродовж 4-5 місяців, а також формування більш активного рослинно-ризобіального симбіозу і збільшення урожайності у порівнянні з прототипом, який зберігався 4 місяці. Суть винаходу пояснюється такими прикладами. Приклад 1. Бактерії Bradyrhizohium japonicum M-8 культивували в рідкому поживному середовищі наступного складу, мас. %: відвар насіння гороху - 10,0, глюкоза - 1,0, сахароза - 0,5, (NH4)2SO40,1, КН2РО4 × 2Н2О - 0,05, К2НРО4-0,05, MgSO4 × 7H2O-0,02, СаСО3-0,03, вода дистильована до 100. В поживне середовище вносили альгінат натрію (АН) в таких концентраціях: 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,5 % (Фіг. 1). Встановлено, що при культивуванні бульбочкових бактерій з АН у концентрації від 0,1 % до 0,3 %, їх чисельність була достатньою для виготовлення рідких бактеріальних препаратів. Збільшення вмісту стабілізатору в поживному середовищі до 0,5 % призводило до істотного зниження титру мікроорганізмів. Приклад 2. Життєздатність ризобій, культивованих у поживному середовищі з альгінатом натрію перевіряли протягом п'яти місяців. Для прикладу використовували різні штами: Bradyrhizohium japonicum М-8 і Bradyrhizohium japonicum 634 б. Встановлено, що титр бульбочкових бактерій сої, культивованих без альгінату натрію, вже через 3 місяці був нижче 1,0 млрд. кл./мл (Фіг. 2). Через місяць зберігання культури, титр Bradyrhizohium japonicum 6346, культивованих без альгінату натрію, на 10 % був вищим, ніж у варіанті зі стабілізатором (Фіг. 3). Після другого місяця зберігання альгінат натрію сприяв кращій збереженості бульбочкових бактерій: чисельність життєздатних клітин у цьому варіанті перевищувала контроль на 22 %. При подальшому зберіганні культури Bradyrhizohium japonicum 6346 за використання альгінату натрію, титр бактерій знижувався повільніше, ніж без нього: через 4 місяці зберігання чисельність ризобій у контрольному варіанті була нижче 1,0 млрд. кл. /мл, за використання стабілізатору титр мікроорганізмів був вище 1,0 млрд. кл. /мл на два місяці довше. Приклад 3. Вплив інокулянту, отриманого пропонованим способом на нодуляційну активність і ефективність Bradyrhizohium japonicum вивчали в польових дослідах. Встановлено, що у фазі стеблування найбільше бульбочок утворилось у варіантах із бактеризацією Bradyrhizohium japonicum, культивованих у середовищі з АН (табл. 1), у фазі цвітіння - у варіанті з бактеризацією свіжеотриманою культурою ризобій, вирощених без стабілізатора (але цей показник істотно не відрізнявся від варіантів з АН), у фазі наливу бобів - у варіанті з 1 UA 107857 C2 5 бульбочковими бактеріями, культивованими з АН (зберігання 4 місяці). Маса бульбочок у фазах стеблування, цвітіння і наливу бобів була найвищою за обробки насіння сої свіже отриманою культурою В. japonicum, вирощеними з АН. У всі фази розвитку рослин варіант із бактеризацією бульбочковими бактеріями через 4 місяці зберігання не поступався за чисельністю свіже отриманій культурі без стабілізатора. Таблиця 1 Вплив бактеризації на утворення бульбочок на коренях рослин сої сорту Полтава та їх азотфіксувальну активність, польовий дослід Фази вегетації рослин стеблування цвітіння наливу бобів 1 2 3 4 Кількість бульбочок на коренях рослин сої, од./рослину Контроль - без бактеризації 0 0 0 Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип) 5,7 60,1 71,5 Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із 7,0 66,1 80,6 подовженим терміном дії) Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип), 2,8 41,9 43,1 зберігання 4 місяці Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із 6,9 67,2 79,1 подовженим терміном дії), зберігання 4 місяці Маса бульбочок на коренях рослин сої, мг/рослину Контроль - без бактеризації 0 0 0 Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип) 291,1 1616,9 6844,9 Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із 315,4 1926,9 6286,9 подовженим терміном дії) Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип), 159,1 848,6 4199,8 зберігання 4 місяці Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із 288,3 1774,1 7147,3 подовженим терміном дії), зберігання 4 місяці Варіанти Продовження таблиці 1 1 2 3 Азотфіксувальна активність, мкг N / рослину Контроль - без бактеризації 0 0 Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип) 1,53 8,77 Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із 1,43 9,63 подовженим терміном дії) Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип), 0,47 5,2 зберігання 4 місяці Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із 1,37 11,57 подовженим терміном дії), зберігання 4 місяці 10 4 0 5,5 4,05 2,37 5,37 Приклад 4. Вплив бактеризації на врожайність сої вивчали в польових умовах. У польових дослідах було перевірено ефективність передпосівної бактеризації сої бактеріями, культивованими в середовищі з АН та без нього (табл. 2). 2 UA 107857 C2 Таблиця 2 Вплив передпосівної бактеризації на врожайність зерна сої, польовий дослід Варіанти досліду Контроль - без бактеризації Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип) Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із подовженим терміном дії) Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (прототип), зберігання 4 місяці Бактеризація Bradyrhizohium japonicum (інокулянт із подовженим терміном дії), зберігання 4 місяці 5 10 15 20 25 30 Урожайність, т/га 1,83 3,41 Приріст урожайності т/га % 1,58 87 3,35 1,52 83 2,12 0,29 16 3,36 1,53 84 У результаті проведених досліджень встановлено позитивний вплив передпосівної обробки насіння сої на врожайність рослин: бактеризація насіння культурою В. japonicum з АН сприяла збільшенню врожайності рослин до 84 %. Джерела інформації: 1. Пат. 39545 Україна, МПК (2006) 7 С 12 N 1/20, С 05 F 1/08. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizohium japonicum M-8 KIRCHNER, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої / Толкачов М. 3., Патика В. П., Каменева І.О., Грітчіна Л.Ю.; заявник і патентовласник Південний філіал Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук.-2000105680, заявл. 06.10.2000; опубл. 15.06.2001, бюл. №5.-5 с. 2. Пат. 36700 Україна МПК (2006) C12N1/19, C05F11/00. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizohium japonicum 36, активний симбіотичний азотфіксатор, який підвищує урожайність сої і рекомендований для приготування бактеріальних препаратів / Толкачов М.З., Дідович СВ., Абдурашитов С.Ф.; заявник і патентовласник Південна дослідна станція Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук. -№ u 200803755; заявл. 25.03.2008; опубл. 10.11.2008, бюл. № 21.-4 с. 3. Пат. 85943 Україна МПК (2009) C12N1/20, C05F11/08, C12R1/01. Штам бактерій Bradyrhizohium japonicum для одержання бактеріального добрива під сою / Ковалевська Т.М., Надкернична О.В., Крутило Д.В., Горбань В.П.; заявник і патентовласник Інститут сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук. - № а 200803755; заявл. 25.06.2007; опубл. 10.03.2009, бюл. №5.-4 с. 4. Пат. 64086 Україна МПК C05F11/08, C12N1/20. Штам бактерій Bradyrhizohium japonicum T21-2 (1MB В-7322) для одержання бактеріального добрива під сою / Коць С.Я., Воробей Н.А., Маменко П.М., Маліченко СМ., Якимчук Р.А.; заявник і патентовласник Інститут фізіології рослин і генетики Національної академії аграрних наук. - №и 201104725; заявл. 18.04.2011; опубл. 25.10.2011, бюл. № 20.-5 с. 5. Методологія і практика використання мікробних препаратів у технологіях вирощування сільськогосподарських культур / [В.В. Волкогон, А.С. Заришняк, І.В. Гринник та ін.]. - К.: Аграр. наука, 2011.-156 с. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 Спосіб підтримання життєздатності Bradyrhizobium japonicum, що включає приготування поживного середовища з добавкою-стабілізатором, його стерилізацію та культивування бульбочкових бактерій сої в приготованому середовищі, який відрізняється тим, що як добавку-стабілізатор використовують альгінат натрію у кількості від 0,1 до 0,3 % від об'єму середовища та культивують у ньому Bradyrhizobium japonicum в умовах періодичного культивування за температури 28±2 °C упродовж 72 годин. 3 UA 107857 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4