Спосіб індукції апоптозу лімфоїдних клітин

Спосіб індукції апоптозу лімфоїдних клітин, що включає їх виділення, активацію апоптозу та його оцінювання, який відрізняється тим, що активація апоптозу проводиться агоністами гістаміну. Корисна модель стосується галузей біології і медицини та може бути використана для індукції апоптозу клітин імунної системи при патологіях, що супроводжуються порушеннями перебігу апоптотичних процесів. Апоптоз, або програмована загибель клітини, є універсальний природній процес, що представляє собою основний компонент ембріогенезу, морфогенезу та росту тканин. Встановлена значна роль апоптозу в розвитку багатьох патологічних процесів та станів, таких, як злоякісні новоутворення, синдром набутого імунодефіциту, деякі нейродегенеративні та аутоімунні захворювання, інфекційні процеси та ін. [Кайдашев И.П. Апоптоз - как общебиологический процесе // Проблемы экологии и медицины.- 1998. - Т.2, №5. - С.9-13; Ярилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии // Актуальные проблемы патофизиологии. Под ред. Б.Б. Мороза. - М.: Медицина, 2001.-С.13-56.]. Усвідомлення ролі апоптозу в підтримці постійної чисельності клітинних популяцій, а також формоутворення та вибраковки дефектних клітин (гомеостазу організму), інтенсифікувало пошук фармакологічних речовин, здатних впливати на апоптоз [Ковальчук Л.В., Павлюк А.С., Каспаров А.А., Щигленко Н.А. и соавт. Анализ фармакологических средств на модели апоптоза лимфоцитов человека in vitro в норме и при иммунопатологии //Аллегрология и иммунология. - 2000. - Т.1, №2. С.24-30.]. Відомі способи індукції апоптозу лімфоїдних клітин за допомогою специфічної імунотерапії [Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Макаров А.Й. Апоптоз лимфоцитов - один из механизмов специфической иммунотерапии атопических заболеваний // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1998. - Т. 125. - №4. - С.434-436]. В клінічній практиці застосовують глюкокортикостероіди [Бойчук СВ., Мустафин И.Г., Фассахов Р.С. - Терещенко Д.В. Спонтанный и глюкокотрикоид - индуцированный апоптоз лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой: роль митохондрий и CD95 (АРО-1) // Аллергология. - 2002. - №1. С.1320], але вони мають небажані побічні ефекти. Найбільш близьким до запропонованого по функціональному призначенню та технічному результату є спосіб індукції апоптозу мононуклеарів периферійної крові, шляхом використання моноклональних антитіл до HLA-A, В, С, HLA-DR та CD95 молекул, який прийнято за прототип [Пат. UA №60629 А, МКВ7 А61В5/00, А61К39/00, опубл. Бюл. №10,2003]. Для здійснення цього способу використовували мононуклеари периферійної крові хворих на атонічну алергію та здорових донорів. Суспензії клітин готували шляхом виділення мононуклеарів з периферійної венозної крові центрифугуванням в одноступеневому градієнті щільності фіколверографіні. Для стимуляції апоптозу використовували моноклональні антитіла (мкАТ) анти- HLA-A, В, С, анти- HLA-DR та CD95. МкАТ вносили у середовище культивування в дозі 10 дна 106 клітин. Клітинну суспензію культивували в трьох серіях: 1 серія - 10% ембріональної сироватки телят, 2 серія - з 10% аутологічної сироватки, 3 серія - до МНПК донорів додавали 10% сироватки хворих на атопію, 4 серія - до МНПК хворих на атопію додавали 10% сироватки донорів. Культивування здійснювали 24год. при 37°С. З метою комплексної оцінки процесів апоптозу використовували забарвлення за методом МайГрюнвальд-Романовський-Гімза (цитологічний CD О) О) 10796 спензії клітин. Суспензію мононуклеарів барвник) та Hoecfast 33342 (флюоресцентний барпериферійної крові (МНПК) отримували шляхом вник). Підраховували МНПК, які мали морфологічінкубації гепарннізованої крові при 37°С протягом ні ознаки апоптозу: конденсація та фрагментація 1,5 години. Далі відбирали плазму в пробірки, кліхроматину. Флюоресценцію реєстрували за допотини осаджували центрифугуванням при могою мікроскопа Люмам Р-8 (Ломо, Росія). 1500об/хв протягом 5 хвилин із наступною відмивЗагальними ознаками способу, що заявляєтькою фізіологічним розчином та подальшим ресусся, і прототипу є: пендуванням. Суспензії тимоцитів, спленоцитів та 1. виділення лімфоїдних клітин; лімфоцитів готували за стандартними методика2. активація апоптозу лімфоїдних клітин; ми. Загальну кількість клітин у суспензії підрахову3. оцінка апоптозу. вали в камері Горяєва. Життєздатність клітин виНедоліком відомого способу є: значали в тесті з трипановим синім. 1. індукція апоптозу здійснюється in vitro; 2. індукується апоптоз лише однієї лімфоїдної Методом проточної лазерної цитофлюорометсубпопуляції. рії (ГТЛЦ) визначали експресію апоптотичнихмарВ основу корисної моделі поставлено завданкерів лімфоїдних клітин за допомогою анексину V ня створити такий спосіб індукції апоптозу лімфоїміченого FITC (виробництва Caltag, США), а також дних клітин шляхом удосконалення відомого, який за допомогою флюорисцентного барвника пропідідозволяє здійснювати індукцію апоптозу всіх субума йодида (двохкольорове забарвлення). популяцій лімфоїдних клітин в умовах in vivo, заОцінка кінцевих стадій апоптозу (гіперхромбезпечити більш достовірну комплексну оцінку ність ядер, конденсацію й фрагментацію хроматипроцесів апоптозу на різних стадіях для регулюну) включала морфологічний метод - забарвлення вання кількості субпопуляцій імунокомпетентних цитоцентрифужних препаратів за Майклітин, з метою модулювання функціонального Грюнвальдом-Романовським-Гімзою (МГРГ). Підстану імунної системи людини. рахунок клітин проводили за допомогою бінокулярного мікроскопу „Биолам Р11", (Ломо, Росія). Ця задача вирішується наступним чином: Комплексна оцінка апоптозу включала відсотковий у способі індукції апоптозу лімфоїдних клітин, вміст клітин, що знаходяться в стадії апоптозу. що включає їх виділення, активацію апоптозу та Статистичну оцінку отриманих результатів експейого оцінку, згідно корисної моделі, активація апорименту проводили за допомогою програми птозу проводиться агоністами гістаміну. "STATISTICA", використовуючи непараметричні Відрізняльною ознакою є те, що активація методи статистичних пакетів. апоптозу проводиться агоністами гістаміну. Спосіб пояснюється конкретним прикладом Дослідження, здійснені запропонованим спойого здійснення. собом, показали наступні результати. При введенні гістаміну в дозі 0,1мкг/кг маси тіла щурам підІндукція апоптозу здійснюється in vivo з настушкірно 1 раз на день протягом 5 днів реєстрували пним виділенням лімфоїдних клітин (мононуклеаприскорення процесів апоптозу як при цитофлюорів периферійної крові, тимоцитів, спленоцитів та рометричному, так і морфологічному методі. Клілімфоцитів) та подальшою комплексною оцінкою тини лімфовузлів та тимоцити виявилися більш апоптозу морфологічним та цитофлюорометриччутливими до гістамін-індукованого апоптозу на ним методами. Цитофлюорометричний аналіз ранніх стадіях процесу, ніж спленоцити та мононуздійснюють з використанням флюорисцентних клеари. Всі субклітинні популяції показали достобарвників анексину V та пропідіуму йодиду. вірні зміни прискорення апоптозу на пізніх стадіях Експериментальні дослідження були проведепроцесу (морфологічний метод). Значно збільшуні на самцях щурів лінії Вістар. Індукцію апоптозу валось число клітин, що підлягали "вторинному лімфоїдних клітин здійснювали шляхом підшкірнонекрозу", пройшовши стадію апоптозу. Це демонго введення гістаміну дигідрохлориду (Sigma, стрували всі клітинні субпопуляції. США) в дозі 0,1мкг/кг маси тіла протягом 5 діб. Контрольну групу складали інтактні щури. Як показано на діаграмі, гістамін в дозі У експериментальних тварин після забою під 0,1мкг/кг викликав збільшення кількості клітин, що тіопенталовим наркозом забирали тимус, селезінзнаходились на різних стадіях апоптозу, в усіх субку, периферичні лімфатичні вузли та кров з правоклітинних популяціях. го шлуночка серця з подальшим отриманням су 5 10796 6 Гістамін-індукований апоптоз лімфоїдних клітин т: а, т І Примітка: *- вірогідність відмін при порівнянні з апоптозом в інтактній групі, р