Спосіб визначення присутності giardia lamblia у досліджуваному зразку та набір праймерів для його здійснення

Реферат: Винахід належить до набору праймерів для детекції присутності Giardia lamblia та до способу визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, при якому як набір праймерів використовують високоточні прямий і зворотний праймери. UA 110767 C2 (12) UA 110767 C2 UA 110767 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до мікробіології, молекулярної біології та медицини і може бути використаний для виявлення Giardia lamblia при діагностиці та лікуванні інфекцій, що передаються переважно статевим шляхом. Проблема лямбліозу на сьогоднішній час є актуальною в зв'язку з широкою розповсюдженістю Giardia lamblia в навколишньому середовищі і в людській популяції, а також з урахуванням відсутності загальновизнаних стандартів в лікуванні цієї патології (Венгеров Ю.Я. Инфекционные и паразитарные болезни: справочник практического врача / Ю.Я. Венгеров, Т.Э. Мигманов, М.В. Нагибина. - М.: МЕДпрессинформ, 2010. - 448 с. [1]). Обмежений вибір високоефективних і одночасно малотоксичних антипротозойних препаратів, високий рівень реінфекції, формування нестійкого антипротозойного імунітету в умовах зниження імунологічного захисту робить досить проблематичним лікування лямбліозу, в тому числі лямбліозу сечостатевої системи, який є також досить складним у діагностичному аспекті. (Мавров И.И. Половые болезни. / ИИ. Мавров - М.: ACT-ПРЕСС КНИГА. - 2002. - 752 с: ил. (Медицинская энциклопедия) [2]). Протягом багатьох років лямбліоз, в основному, розглядали як гостру форму гастроентериту. Проте, збільшення частоти захворювання на лямбліоз в розвинених країнах світу в останні роки свідчить, що в сучасних умовах одним з основних шляхів передачі цього захворювання є статеві контакти. У останні десятиліття у США, Великобританії та інших країнах західної Європи спостерігається певне зростання рівня захворюваності на лямбліоз сечостатевої системи. Його поширеність варіює від 2 до 30 % в різних країнах світу (Centers of Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines // MMWR. 2002. - Vol. 51. - P. 32-36. [3]). Інфікування сечостатевої системи Giardia lamblia особливо поширене серед осіб з нетрадиційною статевою орієнтацією (Keyston J.S., Keyston D.L., Proctor Е.М.. Intestinal parasitic infections in homosexual men: prevalence, symptoms and factors in transmission http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1704818/pdf/canmedaj01466-0054.pdf. [4]). Сучасні способи діагностики лямбліозу, що базуються на фазово-контрастній мікроскопії (Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов - 4-е изд., испр. и доп. / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - СПб.: СпецЛит. - 2008. - 660 с. [5]) є не досить чутливими, а специфічність в багатьох випадках залежить від людського фактора (достовірність складає до 65 %). Більш сучасний, та чутливий спосіб діагностики лямбліозу - метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), зокрема: (Widad Hashim Yahya, Jameel Jerri Yousif Adiagnostic Study Of The Giardia lamblia Parasite Genotypes, Which Causes Diarrhea Among The Patients In Najaf, Province, By Using The PCR Technique // Journal of Kufa for Nursing Science Vol. (3) No.(2) 2013. [6]). За допомогою цього методу напрацьовуються короткі фрагменти ДНК, що мають унікальну послідовність, яка належить лише досліджуваному біологічному об'єктові. За рахунок сучасного обладнання та доступності придбання всіх необхідних компонентів для проведення ПЛР, а також зменшення ризику впливу людського фактора, значною мірою підвищується рівень чутливості та специфічності для діагностики збудників різних захворювань. Достовірність даного методу діагностики складає 86-95 %. (Кулага В.В. Кожные и венерические болезни практикующему врачу. / Кулага В.В, Лемешко В.А. // Медицинская литература книга плюс. 2012. - 238 с. [7]). На сучасному етапі найбільш перспективним напрямком для діагностики збудників інфекційних захворювань є метод полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі. Чутливість та достовірність даного методу для діагностики мікроорганізмів збільшується до 96-99 %. (Ворошилина Е.С. Структура дисбиотических нарушений у женщин репродуктивного возраста по результатам исследования методом количественной ПЦР в реальном времени / Е.С. Ворошилина, Л.В. Тумбинская, А.Е. Донников // Молекулярная диагностика - 2010. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Том III. - Москва. - 2010. - С. 197-200. [8]). Молекулярно-генетичні методи діагностики лямбліозу є більш чутливими, ніж інші (Голубовська О.А. Інфекційні хвороби. / О.А. Голубовська. // Київ ВСВ «Медицина». - 2012. - 171 с. [9]). Розробка молекулярно-генетичного методу діагностики пов'язана, насамперед, з підбором компонентів реакції: вибір праймерів, комплементарних протилежним кінцям різних ланцюгів потрібного фрагмента ДНК, складу інкубаційної суміші, - а також підбору програми ампліфікації. Актуальність виявлення Giardia lamblia у сечостатевій системі пацієнтів, хворих на інфекції, що передаються статевим шляхом, пов'язана зі зміною стереотипів сексуальної поведінки сучасної людини і збільшенням практики анального і орального сексу, а також хибною думкою 1 UA 110767 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 багатьох пересічних людей про необов'язковість захищення бар'єрними засобами контрацепції при таких видах статевих зносин. Внаслідок цього рівень зараження на лямбліоз сечостатевої системи пацієнтів, хворих на ІПСШ може сягати понад 6 %. Можливість діагностування лямбліозу сечостатевої системи, насамперед, більш точного діагностування, і в результаті, проведення більш спрямованого лікування при запаленнях урогенітального тракту, має підвищити його ефективність. Найбільш близьким є спосіб визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, зокрема (Elham Sadat Roointan, Abdollah Rafiei, Ali Reza Samarbaf-Zadeh, Ali Akbar Shayesteh, Ahmad Shamsizadeh and Mahdi Pourmahdi Borujeni Molecular identification of Giardia lamblia isolates from adult human cases in southwest of Iran // African Journal of Biotechnology Vol. 12(9), pp. 901-906, 27 February, 2013. [10]). Однак, такий спосіб не дає можливості отримати точні результати щодо наявності Giardia lamblia у досліджуваному зразку тому, що детекцію проводили з використанням електрофорезу. Відповідна неточність негативно впливає на діагностування лямбліозу та ефективність його лікування. Задачею винаходу є удосконалення способу визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку, в якому за рахунок підібраних праймерів і умов здійснення ампліфікації забезпечується точність у виявленні наявності Giardia lamblia. Задачею винаходу є також створення набору праймерів для детекції Giardia lamblia, що дозволяє отримати дані щодо присутності цього мікроорганізму у досліджуваному зразку за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу. Поставлена задача вирішується запропонованим способом визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, в якому при проведенні полімеразної ланцюгової реакції як набір праймерів використовують прямий і зворотний праймери для детекції Giardia lamblia нуклеотидного складу: Forward: 5' - TCAACGTCAACCGCGGCTTCCGCGTCC - 3' (SEQ ID NO: 1), та Revers: 5' - ACCGTGTTGTTGTCCTTGCACATCTCC - 3' (SEQ ID NO: 2). Як інкубаційну суміш використовують склад з кінцевим об'ємом 35 мкл, що включає: 6 мМ Tris-HCl (рН 8,5, 25 °С), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та 0,02 % буфер Tween-20, ампліфікацію здійснюють за програмою: 94 °С - 2 хв - 1 цикл, 94 °С - 30 с, 59 °С - 20 с - 5 циклів, 72 °С - 35 с, 94 °С - 10 с, 62 °С - 30 с - 45 циклів, 72 °С - 20 с, при цьому ампліфікацію і детекцію Giardia lamblia здійснюють в режимі реального часу. Поставлена задача вирішується також набором праймерів для детекції Giardia lamblia, що включає прямий і зворотний праймери нуклеотидного складу: Forward: 5' - TCAACGTCAACCGCGGCTTCCGCGTCC - 3' (SEQ ID NO:1), та Revers: 5' - ACCGTGTTGTTGTCCTTGCACATCTCC - 3' (SEQ ID NO:2) Експериментально підібраний нами авторський діагностикум, що був створений спеціально для визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, за рахунок підібраного набору праймерів для детекції Giardia lamblia (олігонуклеотиди SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2), підібраного складу інкубаційної суміші та підібраної програми аплікації дозволив отримати точні дані щодо присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку. Набір праймерів для детекції Giardia lamblia був підібраний з послідовності нуклеїнових кислот Giardia lamblia gene for Ad-155 NADP-dependent glutamate dehydrogenase, отриманих з бази даних «GenBank» Ref. AY 178745.1 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ [11]). Для перевірки унікальності праймерів використовувалася on-line програма (www.ucsc.edu [12]). Спосіб визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі здійснюється таким чином. Здійснюють забір біологічного матеріалу для дослідження на присутність Giardia lamblia. Досліджуваний зразок вводять в контакт з інкубаційною сумішшю кінцевим об'ємом 35 мкл, що включає: 6 мМ Tris-HCl (рН 8,5, 25 °С), 3 мМ МgSО4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та буфер Tween-20, де як набір праймерів, використовують прямий праймер Forward: 5' - TCAACGTCAACCGCGGCTTCCGCGTCC - 3' (SEQ ID NO: 1) і зворотний праймер Revers: 5' - ACCGTGTTGTTGTCCTTGCACATCTCC - 3' (SEQ ID NO: 2). У реакційну суміш додають барвник і переносять в умови, придатні для ампліфікації детектуючий ампліфікатор. Проведення ампліфікації здійснюють за програмою: 94 °С - 2 хв - 1 цикл, 94 °С - 30 с, 59 °С - 20 с - 5 циклів, 72 °С - 35 с, 94 °С - 10 с,62 °С - 30 с - 45 циклів, 72 °С 20 с. Проведення ампліфікації і детекції Giardia lamblia здійснюють в режимі реального часу. 2 UA 110767 C2 5 10 15 20 25 30 Відомості, що підтверджують можливість здійснення винаходу. Нами у м. Києві (Україна) у період 2013-2015 року здійснювався запропонований спосіб визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку. Дослідження проводилися на групі пацієнтів, що звернулися до дерматовенерологічної установи на обстеження з приводу інфекцій, що передаються переважно статевим шляхом, за їх згодою. Група складалася з 101 пацієнтів, серед яких 47 жінок (46,6 %), і 54 чоловіки (53,4 %). Вік пацієнтів - від 20 до 65 років, у середньому - 32 роки). У всіх пацієнтів було встановлено хронічний перебіг урогенітальної інфекції. Забір біологічного матеріалу для дослідження на присутність Giardia lamblia здійснювався у відповідності до діючих рекомендацій (Мавров I.I. Уніфікація лабораторних методів дослідження в діагностиці захворювань, що передаються статевим шляхом. / І.І. Мавров, О.П. Бєлозоров, Л.С. Тацька. - Харків: Факт. - 2000. - 120 с. [13]). У чоловіків брали зіскоби з уретри одноразовими зондами і секрет передміхурової залози після її пальцьового масажу, у жінок брали забір піхвових виділень, а також зіскоби з уретри і цервікального каналу. Досліджуваний зразок вводили в контакт з інкубаційною сумішшю кінцевим об'ємом 35 мкл, що включала: 6 мМ Tris-HCl (рН 8,5, 25 °С), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та буфер Tween-20. Як набір праймерів, використовували: Forward: 5' - TCAACGTCAACCGCGGCTTCCGCGTCC - 3' (SEQ ID NO: 1), та Revers: 5' - ACCGTGTTGTTGTCCTTGCACATCTCC - 3' (SEQ ID NO: 2). У реакційну суміш додавали барвник: N',N'-диметил-N-[4-[(Е)-(3-метил-1,3-бензотіазол-2уліден)метил]-1-фенілхінолін-1-фум-2-іл]-N-пропілпропан-1,3-діамін (ціаніновий барвник SYBR Green І), і переносили у детектуючий ампліфікатор ДТ-96 (виробник - «ДНК-Технологія», Росія). Проведення ампліфікації здійснювали за програмою: 94 °С - 2 хв - 1 цикл, 94 °С - 30 с, 59 °С - 20 с - 5 циклів, 72 °С - 25 с, 94 °С - 10 с, 62 °С - 10 с - 45 циклів, 72 °С - 20 с. Проведення ампліфікації і детекції Giardia lamblia здійснювали в режимі реального часу. В результаті Giardia lamblia було виявлено у 7 пацієнтів (6,9 %), а саме: у 4 чоловіків (57,1 % пацієнтів), і 3 жінок (42,9 %). Призначене лікування сечостатевої системи у відповідних пацієнтів, специфічне до виявлених Giardia lamblia, виявилося ефективним. Заявлений спосіб визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі є чутливим і специфічним, забезпечує високу точність виявлення наявності Giardia lamblia. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 45 50 1. Спосіб визначення присутності Giardia lamblia у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі, який відрізняється тим, що при проведенні полімеразної ланцюгової реакції як набір праймерів використовують прямий і зворотний праймери для детекції Giardia lamblia нуклеотидного складу: Forward: 5' - TCAACGTCAACCGCGGCTTCCGCGTCC-3' (SEQ ID NO: 1), та Revers: 5' - ACCGTGTTGTTGTCCTTGCACATCTCC-3' (SEQ ID NO: 2), як інкубаційну суміш використовують склад з кінцевим об'ємом 35 мкл, що включає: 6 мМ TrisHCl (рН 8,5, 25 °C), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та 0,02 % буфер Tween-20, ампліфікацію здійснюють за програмою: 94 °C - 2 хв - 1 цикл, 94 °C - 30 с, 59 °C - 20 с - 5 циклів, 72 °C - 35 с, 94 °C - 10 с, 62 °C - 30 с - 45 циклів, 72 °C - 20 с, при цьому ампліфікацію і детекцію Giardia lamblia здійснюють в режимі реального часу. 2. Набір праймерів для детекції Giardia lamblia, що включає прямий і зворотний праймери нуклеотидного складу: Forward: 5' - TCAACGTCAACCGCGGCTTCCGCGTCC-3' (SEQ ID NO: 1), та Revers: 5' - ACCGTGTTGTTGTCCTTGCACATCTCC-3' (SEQ ID NO: 2). 3 UA 110767 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4