Спосіб визначення присутності pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку та набір праймерів для його здійснення

Реферат: Винахід належить до набору праймерів для детекції присутності Pentatrichomonas hominis та до способу визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, при якому як набір праймерів застосовують високоточні прямий і зворотний праймери. UA 110759 C2 (12) UA 110759 C2 UA 110759 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до мікробіології, вірусології, молекулярної біології та медицини і може бути використаний для виявлення Pentatrichomonas hominis при діагностиці та лікуванні трихомоніазу. Трихомоніаз, що є захворюванням сечостатевої системи, викликається найпростішим одноклітинним паразитом Trichomonas vaginalis і передається переважно статевим шляхом або, в окремих випадках, шляхом контамінації (Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путем. - М.: Медицинская книга. - 2006. - 425 с. [1]). Щорічно у світі захворювання трихомоніазом діагностується приблизно у 170 млн. випадків (Туркевич О.Ю. Деякі питання етіопатогенетичного обґрунтування комплексного лікування бактеріального вагінозу. / Український журнал дерматології, венерології, косметології. - Київ, 2010, № 1 (36), с. 92-96 [2]). Це захворювання не має сезонного характеру та здатне вражати усі шари населення. Вважається, що трихомонада, що здатна існувати у урогенітальному тракті, є Trichomonas vaginalis. Однак, здатність найпростіших до патоморфозу та, з іншого боку, суттєві зміни стереотипу сексуальної поведінки сучасної людини, зокрема, збільшення практики орального та анального сексу, - призвели до можливості існування у урогенітальному тракті іншого типу трихомонад, а саме Pentatrichomonas hominis. З рівня техніки відомі способи діагностики трихомоніазу, що базуються на фазовоконтрастній мікроскопії, зокрема: Клименко Б.В. Трихомониаз. - Л.: Медицина, 1987 [3], UA, патент на корисну модель № 39256 U [4], RU, 2466731 [5], - проте, чутливість цього методу є недостатньо високою (не перевищує 65 %). Відомі способи діагностики трихомоніазу методом полімеразної ланцюгової реакції, зокрема: L.F. Lawing, S.R. Hedgers, J.R. Schwebke. Detection of Trichomonosis in Vaginal and Specimens from Woman by Culture and PCR (Journal of clinical microbiology. - 2000. - v.38, N.10-p. 3585-3588 [6]), RU, патент № 2389016 ([7]). В основі методу полімеразної ланцюгової реакції полягає можливість збільшити малі концентрації визначених фрагментів нуклеїнової кислоти ДНК у біологічному матеріалі шляхом багатократного вибіркового копіювання визначеної ділянки нуклеїнової кислоти ДНК за допомогою ферменту у штучних умовах. При цьому за допомогою набору праймерів: прямого і зворотного, - відбувається копіювання тільки тієї ділянки ДНК-матриці, яка задовольняє заданим умовам, і тільки у тому випадку, якщо ця ділянка присутня у досліджуваному зразку. Молекулярно-генетичні методи діагностики трихомоніазу є більш чутливими, розробка їх пов'язана з підбором компонентів реакції: вибір праймерів, комплементарних протилежним кінцям різних ланцюгів потрібного фрагмента ДНК, складу інкубаційної суміші, - а також підбору програми ампліфікації. Проте, відомі способи діагностики трихомоніазу методом полімеразної ланцюгової реакції також не забезпечують потрібної чутливості, причому проблема не тільки у виборі компонентів для проведення ампліфікації і її умов, а також і в тому, що у зазначених способах здійснюється ідентифікація тільки трихомонад Trichomonas vaginalis. Актуальність виявлення трихомонад типу Pentatrichomonas hominis у сечостатевій системі пацієнтів, хворих на інфекції, що передаються статевим шляхом, пов'язана як з високим рівнем захворювання на трихомоніаз, так і з можливістю більш точного діагностування трихомоніазу і, в результаті, проведення більш спрямованого лікування, що підвищує його ефективність. Найбільш близьким є спосіб визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, зокрема (Crucitti Т., Abdellati S., Ross D.A., Changalucha J., van Dyck E., Buve A. Letters in Applied Microbiology 2004, 38, 510516. [8]). За даним способом присутність Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку визначається опосередковано, оскільки методом полімеразної ланцюгової реакції здійснюють визначення Trichomonas vaginalis, однак, при визначенні цього виду трихомонад враховують присутність Pentatrichomonas hominis, отриману експериментально-розрахунковим шляхом за молекулярно-генетичними даними, отриманими за допомогою 6-ти штамів Trichomonas vaginalis і одного штаму Pentatrichomonas hominis. Однак, такий спосіб не дає можливості отримати точні результати щодо наявності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку тому, що детекцію проводили за допомогою методу електрофорезу. Відповідна неточність негативно впливає на діагностування трихомоніазута ефективність його лікування. Задачею винаходу є удосконалення способу визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку, в якому за рахунок підібраних праймерів і умов здійснення ампліфікації забезпечується точність у виявленні наявності трихомонад Pentatrichomonas hominis. 1 UA 110759 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Задачею винаходу є також створення набору праймерів для детекції Pentatrichomonas hominis, що дозволяє отримати дані щодо присутності цього мікроорганізму у досліджуваному зразку за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу. Поставлена задача вирішується запропонованим способом визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, в якому при проведенні полімеразної ланцюгової реакції як набір праймерів використовують прямий і зворотний праймери для детекції Pentatrichomonas hominis нуклеотидного складу: Forvard 5'-GGAGGAGGTAATGACCAGTT-3' (SEQ ID NO: 1), та Revers 5'-CTCTGTCGGCATCGTTTACA-3' (SEQ ID NO: 2) як інкубаційну суміш використовують склад з кінцевим об'ємом 35 мкл, що включає: 6 мМ Tris-HCI (рН 8,5, 25 °C), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та 0,02 % буфер Tween-20, ампліфікацію здійснюють за програмою: 94 °C - 2 хв. - 1 цикл, 94 °C - 30 с, 59 °C - 20 с - 5 циклів, 72 °C - 35 с, 94 °C - 10 с, 62 °C - 30 с - 45 циклів, 72 °C - 20 с, при цьому ампліфікацію і детекцію Pentatrichomonas hominis здійснюють в режимі реального часу. Поставлена задача вирішується також набором праймерів для детекції Pentatrichomonas hominis, що включає прямий і зворотний праймери нуклеотидного складу: Forvard 5'GGAGGAGGTAATGACCAGTT-3' (SEQ ID NO: 1), та Revers 5'-CTCTGTCGGCATCGTTTACA-3' (SEQ ID NO: 2) Експериментально підібраний нами авторський діагностикум, що був створений спеціально для визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, за рахунок підібраного набору праймерів для детекції Pentatrichomonas hominis (олігонуклеотиди SEQ ID NO:1 та SEQ ID NO:2), підібраного складу інкубаційної суміші та підібраної програми аплікації дозволив отримати точні дані щодо присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку. Набір праймерів для детекції Pentatrichomonas hominis був підібраний з послідовності нуклеїнових кислот Pentatrichomonas hominis gene for SrRNA, отриманих з бази даних "GenBank" Ref. D49495.1 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ [9]). Для перевірки унікальності праймерів використовувалася on-line програма (www.ucsc.edu [10]). Спосіб визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції здійснюється таким чином. Здійснюють забір біологічного матеріалу для дослідження на присутність Pentatrichomonas hominis. Досліджуваний зразок вводять в контакт з інкубаційною сумішшю кінцевим об'ємом 35 мкл, що включає: 6 мМ Tris-НСІ (рН 8,5, 25 °C), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та буфер Tween-20, де як набір праймерів, використовують прямий праймер Forvard 5'-GGAGGAGGTAATGACCAGTT-3' (SEQ ID NO:1) і зворотний праймер Revers 5'-CTCTGTCGGCATCGTTTACA-3' (SEQ ID NO:2). У реакційну суміш додають барвник і переносять в умови, придатні для ампліфікації - детектуючий ампліфікатор. Проведення ампліфікації здійснюють за програмою: 94 °C - 2 хв. - 1 цикл, 94 °C 30 с, 59 °C - 20 с - 5 циклів, 72 °C - 35 с, 94 °C - 10 с, 62 °C - 30 с - 45 циклів, 72 °C - 20 с. Проведення ампліфікації і детекції Pentatrichomonas hominis здійснюють в режимі реального часу. Відомості, що підтверджують можливість здійснення винаходу. Нами у м. Києві (Україна) у період 2013-2014 року здійснювався запропонований спосіб визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку. Дослідження проводилися на групі пацієнтів за їх згодою, що звернулися до дерматовенерологічну установу на обстеження з приводу інфекцій, що передаються переважно статевим шляхом. Для чистоти дослідження у цю групу були відібрані тільки ті пацієнти, у яких методом полімеразної ланцюгової реакції було виключено інфікування на Trichomonas vaginalis. Група складалася з 72 пацієнтів, серед яких 30 жінок (41,7 %), і 42 чоловіки (58,3 %). Вік пацієнтів - від 20 до 65 років, у середньому - 32 роки). У всіх пацієнтів було встановлено хронічний перебіг урогенітальної інфекції. Забір біологічного матеріалу для дослідження на присутність Pentatrichomonas hominis здійснювався у відповідності до діючих рекомендацій (Мавров I.I. Уніфікація лабораторних методів дослідження в діагностиці захворювань, що передаються статевим шляхом. / І.І. Мавров, О.П. Белозоров, Л.С. Тацька. - Харків: Факт. - 2000. - 120 с. [11]). У чоловіків брали зіскоби з уретри одноразовими зондами і секрет передміхурової залози після її пальцьового масажу, у жінок брали забір піхвових виділень, а також зіскоби з уретри і цервікального каналу. Досліджуваний зразок вводили в контакт з інкубаційною сумішшю кінцевим об'ємом 35 мкл, що 2 UA 110759 C2 5 10 15 включала: 6 мМ Tris-HCI (pH 8,5, 25 °C), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та буфер Tween-20. Як набір праймерів, використовували: Forvard 5'-GGAGGAGGTAATGACCAGTT-3' (SEQ ID NO:1), та Revers 5'CTCTGTCGGCATCGTTTACA-3' (SEQ ID NO:2). У реакційну суміш додавали барвник: N',N'диметил-N-[4-[(Е)-(3-метил-1,3-бензотіазол-2-уліден)метил]-1-фенілхінолін-1-фум-2-іл]-Nпропілпропан-1,3-діамін (ціаніновий барвник SYBR Green І), і переносили у детектуючий ампліфікатор ДТ-96 (виробник - "ДНК-Технологія", Росія). Проведення ампліфікації здійснювали за програмою: 94 °C - 2 хв. - 1 цикл, 94 °C - 30 с, 59 °C - 20 с - 5 циклів, 72 °C - 25 с, 94 °C - 10 с, 62 °C - 10 с - 45 циклів, 72 °C - 20 с. Проведення ампліфікації і детекції Pentatrichomonas hominis здійснювали в режимі реального часу. В результаті Pentatrichomonas hominis було виявлено у 12 пацієнтів (16,4 %), а саме: у 7 жінок (58,3 % пацієнтів), і у 5 чоловіків (41,7 %) (Фіг.). Призначене в результаті виявленого типу трихомонад лікування, специфічного до Pentatrichomonas hominis, виявилося ефективним. Заявлений спосіб визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції є чутливим і специфічним і забезпечує високу точність виявлення наявності трихомонад Pentatrichomonas hominis. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 1. Спосіб визначення присутності Pentatrichomonas hominis у досліджуваному зразку методом полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що при проведенні полімеразної ланцюгової реакції як набір праймерів, використовують прямий і зворотний праймери для детекції Pentatrichomonas hominis нуклеотидного складу: Forvard 5'-GGAGGAGGTAATGACCAGTT-3' (SEQ ID NO: 1), та Revers 5'-CTCTGTCGGCATCGTTTACA-3' (SEQ ID NO: 2), як інкубаційну суміш використовують склад з кінцевим об'ємом 35 мкл, що включає: 6 мМ TrisHCI (рН 8,5, 25 °C), 3 мМ MgSO4, 2,5 мМ МgСl2, 2 мМ dNTP, 10 рМ праймерів, 1 нг ДНК матриці, 1 од. Taq-ДНК полімерази та 0,02 % буфер Tween-20, ампліфікацію здійснюють за програмою: 94 °C - 2 хв. - 1 цикл, 94 °C - 30 с, 59 °C - 20 с - 5 циклів, 72 °C - 35 с, 94 °C - 10 с, 62 °C - 30 с - 45 циклів, 72 °C - 20 с, при цьому ампліфікацію і детекцію Pentatrichomonas hominis здійснюють в режимі реального часу. 2. Набір праймерів для детекції Pentatrichomonas hominis, що включає прямий і зворотний праймери нуклеотидного складу: Forvard 5'-GGAGGAGGTAATGACCAGTT-3' (SEQ ID NO: 1), та Revers 5'-CTCTGTCGGCATCGTTTACA-3' (SEQ ID NO: 2). Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3