Спосіб прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro

Реферат: Винахід стосується сільського господарства і може бути використаний при одержанні генетично однорідних саджанців нових високопродуктивних сортів хмелю. Згідно з винаходом регенеранти хмелю, отримані в стерильних умовах, в подальшому вирощують в нестерильних умовах в касетах з сумішшю торфу та піску в співвідношенні 3:1-3:2 з рН - 5,5-6,5, після чого їх висаджують у ванночки з шаром агроперліту, отримані мікросаджанці пересаджують у ґрунт. UA 111188 C2 (12) UA 111188 C2 UA 111188 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується сільського господарства й може бути використаний при одержанні генетично однорідних саджанців нових високопродуктивних сортів хмелю. Відома in vitro технологія оздоровлення, культивування, розмноження та адаптації до умов in vivo рослин хмелю (HUMULUS LUPULUS L) ароматичних сортів, що включає введення в культуру in vitro, оздоровлення методом хіміотерапії та термотерапії, клонування в умовах in vitro, адаптацію рослин до умов in vivo, при цьому для введення в культуру in vitro рослинних експлантатів їх стерилізують від фітопатогенів (бактерій, грибів, вірусів) 70 % етанолом протягом 30 с, 50 % розчином відбілювача протягом 7 хв., після кожної стадії промивають рослинний матеріал у стерильній дистильованій воді протягом 48 годин при температурі +38 °С проводять термотерапію рослинних зразків, пасують рослинні експлантати на штучних поживних середовищах у стерильних умовах, культивують, клонують на базовому середовищі Мурасіге та Скуга з додаванням (для регенерації мерисистем) фітогормону 6бензиламінопурину в концентрації 0,2 мг/л, для пагоноутворення до середовища Мурасіге та Скуга додають індолілоцетову кислоту в концентрації 0,5 мг/л та гіберелову кислоту 0,5 мг/л, нафтилоцетову кислоту - 0,03 мг/л, використовують як носій субстанцій торфомасу, керамзит чи перліт фракцією 3-5 мм (див. деклараційний патент України на винахід № 59131 А, МПК А01Н 4/00, 2003 p.). Однак при такому способі розмноження рослин хмелю можливе утворення калюсної тканини, що підвищує ризик виникнення мутацій та генетичної нестабільності у рослин, що негативно впливає на сортову стабільність матеріалу, що розмножується. Крім того при використанні цього методу регенерація мікросаджанця досягається у два етапи, що ускладнює процес одержання садивного матеріалу, при цьому забезпечується розмноження тільки ароматичних сортів хмелю. Відомий спосіб мікроклонального розмноження регенерантів хмелю, вирощених з апексів in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів, укорочують довжину листових пластинок, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасіге й Скуга, макроелементами, вітамінами у вигляді тіаміну-НС, піридоксину-НС і мезоінозиту, джерелом вуглеводів, фітогармонів у вигляді βіндолілоцетової кислоти, агар-агару, причому мікроживці виконують розмірами 10-20 мм із довжиною листових пластинок - 0,5-1,0 довжини мікроживця, поживне середовище формують з макроелементами за прописом Ніча й Ніч, при цьому до вітамінів додають фолієву кислоту в кількості - 1-5 мг/л, а тіамін-НС виконують у кількості - 1-5 мг/л, піридоксин-НС - 1-5 мг/л, мезоінозит - 80-120 мг/л, крім того як джерело вуглеводів застосовують глюкозу в кількості - 2040 г/л, причому як фітогармони додатково застосовують кінетин у кількості 0,05-0,5 мг/л, а βіндолілоцетову кислоту - 6-15 мг/л, при цьому мікроживці вирощують на поживному середовищі при температурі +23-27 °С, освітленості 1,5-3 кілолюкс, при 14-17-годинному світлоперіоді до формування вкоріненого мікросаджанця, далі процес повторюють до одержання необхідної кількості мікросаджанців, причому останні висаджують у суміш торф-пісок у співвідношенні 3:13:2 з РН - 5,5-6,5, вологістю 40-70 %, попередньо видаливши залишки поживного середовища із кореневої системи й провівши обробку останньої у фунгіциді. Однак, весь процес розмноження регенерантів хмелю здійснюють в стерильних умовах, використовуючи дуже дорогі складові для створення необхідних умов для вирощування. Крім того, термін розмноження регенерантів хмелю достатньо тривалий. Все це обумовлює високу собівартість продукції, яку отримують в результаті реалізації цього способу. Задачею по створенню способу прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro, що заявляється, є спрощення технології розмноження хмелю шляхом поділу технології на два етапи, в останньому із яких можливо прискорене вирощування регенерантів хмелю в нестерильних умовах з використанням відносно дешевих складових для створення необхідних умов для вирощування, що дозволяє зменшити собівартість продукції, яку отримують в результаті реалізації цього способу. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що при здійсненні способу прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів із розмірами 10-20 мм із укороченою довжиною листових пластинок - 0,5-1,0 довжини мікроживця, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасіге й Скуга, з макроелементами за прописом Ніча й Ніч, вітамінами у вигляді тіаміну-НС у кількості - 1-5 мг/л, піридоксину-НС - 1-5 мг/л, мезоінозиту - 80-120 мг/л і фолієвої кислоти - 1-5 мг/л, джерелом вуглеводів у вигляді глюкози в кількості - 20-40 г/л, фітогормонів у вигляді β-індолілоцетової кислоти в кількості - 6-15 мг/л та кінетину у кількості 0,05-0,5 мг/л і вирощують на поживному середовищі на основі агар-агару при температурі +23-27 °С, освітленості 1,5-3 кілолюкс, при 14-17-годинному світловому періоді 1 UA 111188 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до утворення коріння і стебла висотою 8-10 см, формування вкоріненого регенеранту з наступним повторенням процесу до одержання необхідної на етапі стерильних умов кількості регенерантів, відповідно до винаходу, регенеранти, які отримані в стерильних умовах, в подальшому розмножують в нестерильних умовах шляхом висадження у касети з сумішшю торфу та піску в співвідношенні 3:1-3:2 з РН - 5,5-6,5, причому касети розміщують у культуральних кімнатах і вирощують до отримання мікросаджанців при температурі повітря 1824 °С, відносною вологістю повітря 70-80 %, освітленні 4-6 кілолюкс та довжиною світлового періоду 16 годин, при цьому після досягнення рослинами висоти 10-15 см їх обрізають на рівні другого знизу міжвузля, одержані стебла живцюють на відрізки завдовжки 1,5-2,5 см з однією парою листів з умовою залишення над міжвузлям не більш ніж 0,5 см стебла, висаджують у ванночки з шаром агроперліту товщиною 2,5-3,5 см, заливають розчином 4-6 мг/л βіндолілоцтової кислоти у дистильованій воді до верхнього рівня шару агроперліту і накривають ванночки агроволокном з наступним витримуванням протягом трьох тижнів при температурі 2425 °С, освітленні 3-4 кілолюкси і доливанням дистильованої води, в разі потреби, а касети з обрізаними мікросаджанцями знову поміщають в культуральні кімнати на повторне культивування, в разі потреби, причому у відрізків стебла при висадці обрізають листя, залишаючи тільки 1/3-1/4 їх площі, ванночки використовують за висотою, що дозволяє розвиток рослин у внутрішньому просторі ванночки протягом трьох тижнів, а отримані після трьох тижнів вирощування в ванночках мікросаджанці пересаджують у ґрунт, попередньо провівши обробку кореневої системи у фунгіциді. Крім того, в стерильних умовах поживне середовище можуть формувати з мікроелементами за прописом Мурасіге й Скуга: Н2ВО3 - 6,2 мг/л, MnSO4*4H2O - 22,3 мг/л, СоСl2*6Н2О - 0,025 мг/л, CuSO4*5H2O - 0,025 мг/л, ZnSO4*7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4*2H2O - 0,25 мг/л, KJ - 0,83 мг/л, з макроелементами за прописом Ніча й Ніч: KNO3 - 950,0 мг/л, NH4NO3 - 720,0 мг/л, MgSO4*7H2O 185,0 мг/л, СаСl2 - 166 мг/л, КН2РО4 - 68,0 мг/л, FeSO*7H2O - 27,8 мг/л, Nа2ЕДТА*2Н2О - 37,3 мг/л, з вітамінами: фолієва кислота - 2,0 мг/л, тіамін-НС - 2,0 мг/л, піридоксин-НС - 2,0 мг/л, мезоінозит - 100,0 мг/л, а глюкозу в кількості - 30,0 г/л, β-індолілоцтову кислоту - 10,0 мг/л, кінетин - 0,1 мг/л, а в нестерильних умовах для заливки агроперліту в ванночках використовують розчин 5 мг/л β-індолілоцтової кислоти у дистильованій воді, причому для розмноження можуть бути використані ванночки з пластмаси чи оцинкованого заліза висотою 12-16 см. Застосування пропонованого способу прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro, дозволяє забезпечити наступний технічний результат: - спрощується технологія розмноження хмелю; - зменшуються витрати на матеріали та створення умов для розмноження регенерантів хмелю; - скорочується термін розмноження регенерантів хмелю в кількості, що необхідна в найбільш сприятливі терміни для подальшого їх вирощування в ґрунті; - зменшується собівартість вирощування одного саджанця за рахунок скорочення технологічних операцій і витрат. Крім того: - покращуються економічні показники підприємства, що займається розмноженням регенерантів хмелю за рахунок скорочення технологічного процесу. Регенеранти хмелю, вирощені з апікальних меристем in vitro, переносять у бокс і живцюють у стерильних умовах за кількістю міжвузлів. З одного регенеранту вирізають 5-8 мікроживців з парою листочків і пазушних бруньок. Живці укорочують до розмірів 15±5 мм, якщо листова пластинка має розмір більше живця, тоді її обрізають на 1/2-2/3 площі. Нарізані мікроживці за допомогою стерильних пінцетів висаджують на штучне стерильне агаризоване поживне середовище. Регенерацію й клонування мікроживців хмелю проводять на поживному середовищі, в склад якого входять макроелементи за прописом Ніча й Ніч: KNO3 - 950,0 мг/л, NH4NO3 - 720,0 мг/л, MgSO4*7H2O - 185,0 мг/л, СаСl2 - 166 мг/л, КН2РО4 - 68,0 мг/л, FeSO*7H2O 27,8 мг/л, Na2ЕДTA*2H2O - 37,3 мг/л і мікроелементи за прописом Мурасіге й Скуга: Н 2ВO3 - 6,2 мг/л, MnSO4*4H2O - 22,3 мг/л, СоСl2*6Н2О - 0,025 мг/л, CuSO4*5H2O - 0,025 мг/л, ZnSO4*7H2O 8,6 мг/л, Na2MoO4*2H2O - 0,25 мг/л, KJ - 0,83 мг/л. Крім мінеральних складових до складу середовища вводять вітаміни: фолієва кислота - 2,0 мг/л, тіамін-НС - 2,0 мг/л, піридоксин-НС 2,0 мг/л, мезоінозит - 100,0 мг/л, а також глюкоза - 30 г/л, агар-агар - 4,0±0,5 г/л і фітогормони: кінетин у концентрації 0,1 мг/л і β-індолілоцетову кислоту у концентрації 10,0 мг/л. Вирощують при температурі +24-27 °С, освітленості 2-3 кілолюкс, при 16-годинному світловому періоді протягом 30-40 діб, а потім операцію повторюють до одержання необхідної кількості регенерантів. 2 UA 111188 C2 5 10 15 20 25 Для одержання мікросаджанців, придатних для висаджування в ґрунт, переводять вирощування в нестерильні умови. Для цього регенеранти, які отримані в стерильних умовах, розмножують висадженням у касети з сумішшю торфу та піску в співвідношенні 3:1-3:2 з РН 5,5-6,5. Касети розміщують у культуральних кімнатах і вирощують регенеранти до отримання мікросаджанців при температурі повітря 18-24 °С, відносною вологістю повітря 70-80 %, освітленні 4-6 кілолюкс та довжиною світлоперіоду 16 годин. Після досягнення рослинами висоти 10-15 см їх обрізають на рівні другого знизу міжвузля. Одержані стебла живцюють на відрізки завдовжки 1,5-2,5 см з однією парою листів з умовою залишення над міжвузлям не більш ніж 0,5 см стебла, висаджують у ванночки з шаром агроперліту товщиною 2,5-3,5 см, заливають розчином 5 мг/л β-індолілоцтової кислоти у дистильованій воді до верхнього рівня шару агроперліту і накривають ванночки агроволокном, причому у відрізків стебла при висадці обрізають листя, залишаючи тільки 1/3-1/4 їх площі, а ванночки використовують за висотою, що дозволяє розвиток рослин у внутрішньому просторі ванночки протягом трьох тижнів. Висаджені відрізки стебла в ванночках витримують протягом трьох тижнів при температурі 24-25 °С, освітленні 3-4 кілолюкси (в разі потреби, в ванночки доливають дистильовану воду). Отримані після трьох тижнів вирощування в ванночках мікросаджанці пересаджують у ґрунт (наприклад, у теплиці), попередньо провівши обробку кореневої системи у фунгіциді. В разі потреби касети з обрізаними мікросаджанцями знову поміщають в культуральні кімнати на повторне культивування. В дослідному господарстві заявника проводиться вирощування садивного матеріалу перспективних сортів хмелю для закладення маточних плантацій. При використанні способу, що пропонується, спостерігається значне прискорення розмноження хмелю, зменшується собівартість продукції, яку отримують в результаті реалізації цього способу. Сказане вище може бути проілюстроване наступними даними, які отримані в результаті фактичного використання способу, що пропонується (Таблиця). Таблиця Метод Термін утворення Орієнтовна Приживлення Маса одержаних отримання мікросаджанців, собівартість одного мікросаджанців, % мікросаджанців, г мікросаджанців діб мікросаджанця, грн. Розмноження відповідно до 55-75 40-45 50-80 3,8 прототипу Розмноження відповідно до 70-90 20-25 70-110 2,4 способу, що пропонується ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 1. Спосіб прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro, при якому в стерильних умовах один регенерант хмелю ділять на мікроживці за кількістю міжвузлів із розмірами 10-20 мм із укороченою довжиною листових пластинок - 0,5-1,0 довжини мікроживця, формують поживне середовище з мікроелементами за прописом Мурасіге-Скуга, з макроелементами за прописом Ніча й Ніч, вітамінами у вигляді тіаміну-НС у кількості - 1-5 мг/л, піридоксину-НС - 1-5 мг/л, мезоінозиту - 80-120 мг/л і фолієвої кислоти - 1-5 мг/л, джерелом вуглеводів у вигляді глюкози в кількості - 20-40 г/л, фітогормонів у вигляді β-індолілоцтової кислоти в кількості - 6-15 мг/л та кінетину у кількості 0,05-0,5 мг/л і вирощують на поживному середовищі на основі агар-агару при температурі +23-27 °C, освітленості 1,5-3 кілолюкс, при 1417-годинному світловому періоді до утворення коріння і стебла висотою 8-10 см, формування вкоріненого регенеранту з наступним повторенням процесу до одержання необхідної на етапі стерильних умов кількості регенерантів, який відрізняється тим, що регенеранти, які отримані в стерильних умовах, в подальшому розмножують в нестерильних умовах шляхом висадження у касети з сумішшю торфу та піску в співвідношенні 3:1-3:2 з РН - 5,5-6,5, причому касети розміщують у культуральних кімнатах і вирощують до отримання мікросаджанців при температурі повітря 18-24 °C, відносній вологості повітря 70-80 %, освітленні 4-6 кілолюкс та довжиною світлового періоду 16 годин, при цьому після досягнення рослинами висоти 10-15 см їх обрізають на рівні другого знизу міжвузля, одержані стебла живцюють на відрізки завдовжки 1,5-2,5 см з однією парою листів з умовою залишення над міжвузлям не більш ніж 0,5 см 3 UA 111188 C2 5 10 15 20 стебла, висаджують у ванночки з шаром агроперліту товщиною 2,5-3,5 см, заливають розчином 4-6 мг/л β-індолілоцтової кислоти у дистильованій воді до верхнього рівня шару агроперліту і накривають ванночки агроволокном з наступним витримуванням протягом трьох тижнів при температурі 24-25 °C, освітленні 3-4 кілолюкси і доливанням дистильованої води, в разі потреби, а касети з обрізаними мікросаджанцями знову поміщають в культуральні кімнати на повторне культивування, в разі потреби, причому у відрізків стебла при висадці обрізають листя, залишаючи тільки 1/3-1/4 їх площі, ванночки використовують за висотою, що дозволяє розвиток рослин у внутрішньому просторі ванночки протягом трьох тижнів, а отримані після трьох тижнів вирощування в ванночках мікросаджанці пересаджують у ґрунт, попередньо провівши обробку кореневої системи у фунгіциді. 2. Спосіб прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro за п. 1, який відрізняється тим, що для розмноження беруть ванночки з пластмаси чи оцинкованого заліза висотою 12-16 см. 3. Спосіб прискореного розмноження хмелю, одержаного з культури in vitro за п. 1, який відрізняється тим, що в стерильних умовах поживне середовище формують з мікроелементами за прописом Мурасіге-Скуга: Н2ВО3 - 6,2 мг/л, MnSO4*4H2O - 22,3 мг/л, СоСl2*6Н2О - 0,025 мг/л, CuSO4*5H2O - 0,025 мг/л, ZnSO4*7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4*2H2O - 0,25 мг/л, KJ - 0,83 мг/л, з макроелементами за прописом Ніча й Ніч: KNO 3 - 950,0 мг/л, NH4NO3 720,0 мг/л, MgSO4*7H2O - 185,0 мг/л, СаСl2 - 166 мг/л, KН2РО4 - 68,0 мг/л, FeSO*7H2O - 27,8 мг/л, Nа2ЕДТА*2Н2О - 37,3 мг/л, з вітамінами: фолієва кислота - 2,0 мг/л, тіамін-НС - 2,0 мг/л, піридоксин-НС - 2,0 мг/л, мезоінозит - 100,0 мг/л, а глюкозу в кількості - 30,0 г/л, β-індолілоцтову кислоту - 10,0 мг/л, кінетин - 0,1 мг/л, а в нестерильних умовах для заливки агроперліту в ванночках використовують розчин 5 мг/л β-індолілоцтової кислоти у дистильованій воді. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4