Спосіб ідентифікації campylobacter jejuni

Реферат: Спосіб ідентифікації Campylobacter jejuni включає ідентифікацію збудника, виготовлення кампілобактерійного антигену та кампілобактерійної діагностичної сироватки. Campylobacter змивають фізіологічним розчином з додаванням формаліну, шляхом центрифугування відмивають від часток гелю і доводять до необхідної робочої концентрації мікробних клітин. Перед імунізацією мікробну суспензію відмивають від формаліну, проводять контрольне дослідження на стерильність, імунізацію піддослідних тварин проводять шляхом внутрішньовенного введення бактеріальної маси. Після імунізації відбирають кров та отримують сироватку. Під час реакції аглютинації антиген реагує позитивно тільки з видоспецифічною сироваткою. Виділення збудника проводять з кишечника великої рогатої худоби. Антиген вирощують на твердому поживному середовищі, а фізіологічний розчин для змивання мікробної суспензії містить 0,3 % формаліну. Концентрація мікробних клітин в 3 антигені становить 2 млрд/см . Перед імунізацією тварин додатково ставлять реакцію на нешкідливість мікробної суспензії. Імунізацію проводять в дозах 10, 20, 40 млрд мікробних клітин на 7, 14, 21 добу. Проводять поставку реакції аглютинації на активність. Отримана сироватка становить титр антитіл 1:320, 1:640. З високоактивної і видоспецифічної сироватки проводять виділення, мічення флуоресцеїну ізотіоціанатом та очистку глобулінів від незв'язаного флуорхрому для постановки реакції непрямої імунофлуоресценції для індикації та ідентифікації Campylobacter jejuni з досліджуваних проб. UA 115037 U (12) UA 115037 U UA 115037 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, а саме до ветеринарно-санітарної експертизи, мікробіології та епізоотології, і може бути використана для експрес індикації та ідентифікації мікроорганізмів Campylobacter jejuni у харчових продуктах, об'єктах довкілля та патологічному матеріалі методом імунофлуоресцентної мікроскопії. Відомий штам Campylobacter jejuni subspecies jejuni (патент України № 62017, опубл. 10.08.2011 р., бюл. № 15 "Штам Campylobacter jejuni subspecies jejuni C. 2008 для виготовлення імунобіологічних препаратів", який здатний до прискореного росту, високого накопичення бактеріальної маси та в реакції аглютинації не дає перехресних реакцій з гетерологічними культурами (сальмонелами, шигелами і стафілококами), що депоновано за № 478 у Депозитарії Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (м. Київ). Відомий спосіб (патент України № 65594, опубл. 12.12.2011 р., бюл. № 23 "Спосіб селективної ізоляції мікроорганізмів роду Campylobacter із харчових продуктів"), який включає висів проб досліджуваного матеріалу на селективне поживне середовище для культивування кампілобактерій. Найближчий аналог (патент України № 67265, опубл. 15.06.2004 р., бюл. № 6 "Штам бактерій Campylobacter fetus subspecies fetus 5-ов серологічний варіант II, що використовується для виготовлення кампілобактерійного антигену та кампілобактерійної діагностичної сироватки серологічний варіант II"), де Campylobacter fetus subspecies fetus 5-ов серологічний варіант II використовували для виготовлення кампілобактерійного антигену та кампілобактерійної діагностичної сироватки, щоб забезпечити високу антигенну активність, широку спорідненість з культурами кампілобактерій серологічного варіанта II. Штам Campylobacter fetus subspecies fetus 5-ов виділений з аборт-плоду вівці в 1975 році в Золотоношському районі Черкаської області. Використано як антиген для імунізації кролів з метою отримання діагностичної сироватки, яка не дає перехресної реакції аглютинації з біофабричним антигеном Campylobacter fetus subspecies venerealis серологічного варіанта І і тому не потребує адсорбції при отриманні сироватки. Виготовляли антиген, для імунізації кролів, шляхом вирощування культур Campylobacter fetus subspecies fetus 5-ов серологічний варіант II на напіврідкому агарі в 3 пробірках та флаконах місткістю 20-100 см , в ексикаторах з підвищеним вмістом вуглекислого газу в атмосфері за температури 37,5±0,5 °C протягом двох діб. Культуру змивали фізіологічним розчином з додаванням 0,5 % розчину формаліну, шляхом центрифугування 3 відмивали від часток гелю та доводили до робочої концентрації 5 млрд мікробних клітин в 1 см . Перед імунізацією суспензію бактеріальних клітин відмивали від формаліну, проводили контрольне дослідження на стерильність шляхом висіву на живильне середовище. Імунізацію проводили шляхом внутрішньовенного введення бактеріальної суспензії з інтервалом 3 доби в дозах від 5 до 20 млрд мікробних клітин на голову. Через 14 днів після імунізації у кролів відбирали кров та отримували сироватку з титром антитіл 1:1600-1:3200. В реакції аглютинації сироватка реагувала з антигеном Campylobacter fetus subspecies fetus серологічний варіант II та не реагувала з антигенами Campylobacter fetus subspecies venerealis серологічний варіант І та Campylobacter sputorum subspecies bubulus серологічний варіант III. Використання штаму Campylobacter fetus subspecies fetus 5-ов для виготовлення кампілобактерійного антигену та кампілобактерійної діагностичної сироватки, яка не дає перехресної реакції аглютинації з штамами Campylobacter fetus subspecies venerealis в нерозведеному стані і отже не потребує додаткової адсорбції, буде сприяти діагностиці кампілобактеріозу та ідентифікації епізоотичних штамів кампілобактерій. Штам бактерій Campylobacter fetus subspecies fetus 5-ов має високу антигенну активність, а також антигенну спорідненість з культурами кампілобактерій сероваріанта II, які циркулюють у овець та великої рогатої худоби. Використання штаму буде сприяти швидкій діагностиці та ідентифікації штамів збудника кампілобактерійної інфекції та оперативно попереджувати захворювання на кампілобактеріоз. Недоліком аналога є те, що відсутнє отримання флуоресцентного імуноглобуліну для експрес-діагностики Campylobacter jejuni в харчових продуктах методом імунофлуоресціюючих антитіл. Задачею корисної моделі є створення способу ідентифікації Campylobacter jejuni прямим методом імунофлуоресцентної мікроскопії, який слугуватиме експрес-діагностиком під час проведення ветеринарно-санітарної. оцінки харчових продуктів щодо їх контамінації збудниками кампілобактеріозу, а саме Campylobacter jejuni, з метою попередження спалахів інфекцій, що перебігають з ознаками токсикоінфекцій у людей під час вживання контамінованих харчових продуктів мікроорганізмами Campylobacter jejuni. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб ідентифікації Campylobacter jejuni включає ідентифікацію збудника, виготовлення кампілобактерійного антигену "та кампілобактерійної діагностичної сироватки, Campylobacter змивають фізіологічним розчином з додаванням 1 UA 115037 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 формаліну, шляхом центрифугування відмивають від часток гелю і доводять до необхідної робочої концентрації мікробних клітин, перед імунізацією мікробну суспензію відмивають від формаліну, проводять контрольне дослідження на стерильність, імунізацію піддослідних тварин проводять шляхом внутрішньовенного введення бактеріальної маси, після імунізації відбирають кров та отримують сироватку, під час реакції аглютинації антиген реагує позитивно тільки з видоспецифічною сироваткою, згідно з корисною моделлю, виділення збудника проводять з кишечнику великої рогатої худоби, антиген вирощують на твердому поживному середовищі, а фізіологічний розчин для змивання мікробної суспензії містить 0,3 % формаліну, концентрація 3 мікробних клітин в антигені становить 2 млрд/см , а перед імунізацією тварин додатково ставлять реакцію на нешкідливість мікробної суспензії, імунізацію проводять в дозах 10, 20, 40 млрд мікробних клітин на 7, 14, 21 добу, проводять поставку реакції аглютинації на активність, отримана сироватка становить титр антитіл 1:320, 1:640, надалі з високоактивної і видоспецифічної сироватки проводять виділення, мічення флуоресцеїну ізотіоціанатом та очистку глобулінів від незв'язаного флуорхрому для постановки реакції непрямої імунофлуоресценції для індикації та ідентифікації Campylobacter jejuni з досліджуваних проб. Соматичний антиген для імунізації тварин-донорів виготовляють із мікробних клітин Campylobacter jejuni. Накопичують бактеріальну масу на одному з твердих селективних середовищ: М994, агар Престона, колумбійський агар в мікроаерофільних умовах. Оптимальне газове середовище для культивування бактерій роду Campylobacter має такий склад: двоокис карбону (СО2) - 10 %, оксиген (О2) - 5 %, нітроген (N2) - 85 %. Культивування посівів здійснюється в анаеробному інкубаторі або СО2-інкубаторі, що дозволяє підтримувати температуру 42±1 °C. За відсутності оптимального газового середовища можна використовувати посуд із щільною кришкою: на дно мікроанаеростата чи ексикатора ставлять і запалюють свічку, щільно накривають кришкою. Через певний проміжок часу концентрація оксигену в ексикаторі зменшується і свічка гасне. Бактеріологічною петлею відбирають типову колонію вихідної культури робочого штаму С. 3 jejuni на середовищі зберігання і висівають у бульйон Болтона, розлитий у пробірки по 10 см 3 або на тверде поживне середовище, яке розлите в бактеріологічні чашки по 12-15 см . Посіви інкубують за температури 42±1 °C впродовж 44-48 год. Ріст на бульйоні характеризується рівномірною каламуттю, а на агарі - появою колоній, характерних для С. jejuni. Дослідженням культур методом висячої або роздушеної краплі виявляють типові для С. jejuni мікробні клітини дрібні, рухливі (швидкий гвинтоподібний рух), дещо зігнуті палички, без спор і капсул, а після фарбування мазків за Грамом - дрібні, грамнегативні, злегка зігнуті палички у вигляді коми, крил "чайки в польоті" або спіралеподібної S-подібної форми. Через 44-48 год. культуру пересівають з бульйону на середовище М994 або агар Престона і культивують за температури 42 °C протягом 48 год. в мікроаерофільних умовах. Отримані культури перевіряють на типовість. Після перевірки на типовість мікробну масу клітин С. jejuni змивають з поверхні агарового середовища 0,85 % розчином натрію хлориду, осаджують центрифугуванням за 4000-4500 об./хв. протягом 20 хв., ще раз відмивають у такому ж режимі стерильним 0,85 % розчином натрію хлориду. Осад відмитих мікробних клітин суспендують у 0,85 % розчині натрію хлориду 3 та доводять концентрацію до 2 млрд/см за оптичним стандартом каламутності. Виготовлений таким чином антиген перевіряють на стерильність і нешкідливість. Зберігають антиген за температури 0-4 °C в холодильнику. 3 Стерильність антигену перевіряють шляхом висівання його по 0,5 см на МПБ, МПА і тіогліколеве середовище (ТГС) (по 5 пробірок на кожну окрему серію виготовленого антигену). Посіви витримують у термостаті за температури 42 °C протягом 2 діб у мікроаерофільних умовах. Відсутність росту у всіх пробірках вказує на стерильність антигенного препарату. Нешкідливість антигену перевіряють на 2-4 білих мишах, масою 18-20 г, яким підшкірно 3 вводять по 0,2-0,3 см виготовленого антигенного препарату. Спостереження за тваринами ведуть впродовж 5 діб. Препарат вважають нешкідливим у випадку відсутності захворювання та загибелі всіх піддослідних тварин. Для проведення імунізації тварин-донорів і отримання сироваток проти С. jejuni як донори сироватки крові використовують бугаїв будь-якої породи, віком 10-12 міс. Тварин імунізують за схемами, що ґрунтуються на триразовому внутрішньовенному уведенні антигену в дозах - 10, 20 і 40 мільярдів мікробних тіл. Через 18-21 добу після останнього введення антигену відбирають кров з яремної вени по 3 150-200 cм у стерильні циліндри чи колби, які змочені 0,85 % розчином натрію хлориду. Взяту кров витримують протягом 1 год. за температури 37 °C, потім обводять згусток і циліндри (колби) з кров'ю витримують у холодильнику за температури 2-4 °С впродовж 12-24 год. 2 UA 115037 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Сироватку, що відійшла, зливають у стерильний посуд. Зберігають сироватку за температури 0-4 °C. Одержані сироватки проти ОН-антигенів С. jejuni перевіряють на активність і специфічність у реакціях аглютинації та непрямої імунофлуоресценції. 3 Розгорнуту реакцію аглютинації (РА) ставлять в об'ємі 1 см у пластикових планшетах. 3 Роблять десять послідовних розведень. У ряд лунок вносять по 0,5 см двократних розведень 3 сироватки, починаючи з розведення 1:5 і до 1:2560, і додають пo 0,5 см антигену: а) як антиген для дослідження активності використовують двомільярдну суспензію мікробних тіл антигену; б) як антиген для дослідження на специфічність використовують двомільярдні суспензії дворазово відмитих формалінізованих мікробних клітин 44-48-годинних культур двох інших штамів С. jejuni, а також отримані подібним чином двомільярдні суспензії формалінізованих мікробних клітин 18-24-годинних культур таких мікроорганізмів як Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella spp. тощо. ; Після з'єднання компонентів вміст лунок старанно перемішують круговими рухами планшету, не відриваючи його від поверхні стола, і витримують за температури 37 °C впродовж 4 год., а потім 18-20 год. - за кімнатної температури і оцінюють результати реакції аглютинації загальноприйнятою системою оцінки в хрестах. Позитивною вважають реакцію не менше, ніж на два хрести. Після досягнення високої видоспецифічності та активності із сироватки виділяють загальну глобулінову фракцію білків методом висолювання насиченим розчином амонію сульфату. Наступним етапом с мічення флуоресцеїну ізотіоціанатом та очистка глобулінів від незв'язаного флуорхрому для проведення реакції. Для постановки реакції непрямої імунофлуоресценції, як антиген використовують суспензію на 0,85 % розчину натрію хлориду одноразово відмитих мікробних 44-48-годинних культур 3 мікроорганізмів, з кінцевою концентрацією мікробних тіл 250-500 тис./см . На знежирених предметних скельцях, розкреслених маркером на 10 рівних квадратів, роблять 10 мазків із суспензії вегетативних клітин досліджуваних штамів. Мазки підсушують на повітріта фіксують одним із перерахованих нижче фіксаторів: метанолом за кімнатної температури протягом 10 хв., сумішшю Нікіфорова - 15 хв., етанолом - 20 хв. або на полум'ї спиртівки чи газового пальника. Наносять на них досліджувану сироватку в двократних послідовних розведеннях, починаючи з розведення 1:2, 1:4…1:1024. Препарати витримують в умовах вологої камери за температури 37 °C протягом 30 хв., відмивають у проточній водопровідній воді 10 хв., злегка підсушують фільтрувальним папером і наносять краплю флуоресціюючих антивидових глобулінів або сироватки крові в робочому розведенні. Препарати знову витримують в умовах вологої камери за температури 37 °C, протягом 30 хв, відмивають у проточній водопровідній воді 10 хв., підсушують і розглядають під люмінесцентним мікроскопом. Оцінку результатів проводять за чотирихрестовою системою: ++++ - сіяюче німбовидне специфічне світіння бактеріальної клітини; +++ - яскрава люмінесценція периферії клітини; ++ - слабко виражене світіння з ледь помітним периферійним обідком; + - незначне гомогенне світіння клітини без видимого контуру. Позитивною вважають реакцію не менше, ніж на два хрести. Активними вважають сироватки, які позитивно взаємодіють з антигенами мікроорганізмів гомологічних штамів С. jejuni в розведенні 1:2560 і вище РНІФ та в розведенні 1:320 і більше - в РА. Запропонований спосіб є перспективним, оскільки не відбувається прямого контакту оператора зі збудником, спосіб поєднує в собі специфічність та високу чутливість імунологічних реакцій (виявляє тест-мікроб у змішаній культурі в концентрації від 100 мікробних клітин в 1 3 см ), швидку індикацію та ідентифікацію тест-мікроба в біологічному матеріалі (впродовж години від моменту надходження матеріалу), що дає право віднести цей спосіб до розряду експресметодів лабораторної діагностики інфекційних хвороб бактеріальної природи. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 60 Спосіб ідентифікації Campylobacter jejuni, що включає ідентифікацію збудника, виготовлення кампілобактерійного антигену та кампілобактерійної діагностичної сироватки, Campylobacter змивають фізіологічним розчином з додаванням формаліну, шляхом центрифугування відмивають від часток гелю і доводять до необхідної робочої концентрації мікробних клітин, перед імунізацією мікробну суспензію відмивають від формаліну, проводять контрольне 3 UA 115037 U 5 10 дослідження на стерильність, імунізацію піддослідних тварин проводять шляхом внутрішньовенного введення бактеріальної маси, після імунізації відбирають кров та отримують сироватку, під час реакції аглютинації антиген реагує позитивно тільки з видоспецифічною сироваткою, який відрізняється тим, що виділення збудника проводять з кишечнику великої рогатої худоби, антиген вирощують на твердому поживному середовищі, а фізіологічний розчин для змивання мікробної суспензії містить 0,3 % формаліну, концентрація мікробних клітин в 3 антигені становить 2 млрд/см , а перед імунізацією тварин додатково ставлять реакцію на нешкідливість мікробної суспензії, імунізацію проводять в дозах 10, 20, 40 млрд мікробних клітин на 7, 14, 21 добу, проводять поставку реакції аглютинації на активність, отримана сироватка становить титр антитіл 1:320, 1:640, надалі з високоактивної і видоспецифічної сироватки проводять виділення, мічення флуоресцеїну ізотіоціанатом та очистку глобулінів від незв'язаного флуорхрому для постановки реакції непрямої імунофлуоресценції для індикації та ідентифікації Campylobacter jejuni з досліджуваних проб. 15 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4