Спосіб одержання поверхнево-активних речовин
Номер патенту: 115495
Опубліковано: 10.11.2017
Автори: Тимошук Катерина Вікторівна, Никитюк Лілія Вікторівна, Пирог Тетяна Павлівна
Формула / Реферат
Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, який відрізняється тим, що для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію.
Текст
Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить UA 115495 C2 (12) UA 115495 C2 мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію. Для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію. UA 115495 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані як антимікробні агенти у харчовій промисловості, медицині та сільському господарстві. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii IMB В-7405 [Пат. 101395 UA, Спосіб одержання поверхневоактивних речовин / Пирог Т.П., Панасюк К.В., Никитюк Л.В. Опубл. 10.09.2015, Бюл. № 17], який включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, з використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Недоліком цього способу є недостатньо високі антимікробні властивості синтезованих ПАР. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання ПАР, який покращує антимікробні властивості поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію. Згідно винаходу для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання відпрацьованої після смаження картоплі олії для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 1,8-3,5 разів (до 8-50 мкг/мл). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO47H2O-0,1, СаСl22Н2О 0,1, KН2РО4-0,1, FeSO47H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію (мережа ресторанів швидкого харчування Mcdonald's, Київ) у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % відпрацьованої після смаження картоплі олії. Інокулят, в якому 4 5 чисельність бактерій становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію синтезованих ПАР у 1,8-3,5 разів (до 8-50 мкг/мл). Приклад 1. Антимікробні властивості ПАР N. vaccinii IMB В-7405 залежно від якості пересмаженої олії у середовищі культивування. Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO47H2O-0,1, СаСl22Н2О - 0,1, КН2РО4-0,1, FeSO47H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують відпрацьовану після смаження картоплі і м'яса олію (мережа ресторанів швидкого харчування Mcdonald's, Київ) у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % відповідної олії. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Позаклітинні поверхнево-активні речовини виділяють так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 Μ НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів 1 UA 115495 C2 5 10 15 20 25 30 35 протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Антимікробні властивості поверхнево-активних речовин аналізують за показником мінімальної інгібуючої концентрації. МІК - це найменша концентрація препарату, що пригнічує видимий неозброєним оком ріст тест-культури. МІК є незалежним показником, за допомогою якого можна одночасно порівняти ефективність кількох антимікробних агентів. На відміну від інших методів аналізу активності відповідних препаратів, визначення МІК має ряд переваг: простота і швидкість аналізу, можливість одночасного визначення для кількох тест-культур, дослідження ефективності різних концентрацій препарату, можливість порівняння ефективності різних препаратів чи препаратів різного ступеня очищення. Визначення МІК є важливим фактором у лабораторній діагностиці для виявлення стійкості мікроорганізмів до антимікробних препаратів, а також для контролю ефективності нових лікарських засобів. У медичній практиці за допомогою цього показника обирають антибіотики та встановлюють необхідні їх дози для лікування пацієнтів. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють методом двократних серійних розведень у м'ясопептонному бульйоні (МПБ) для бактерій і рідкому суслі для дріжджів. У стерильних умовах у 10 пробірок вносять по 1 мл середовища, у першу додають 1 мл розчину ПАР певної концентрації, після чого перемішують, відбирають 1 мл і переносять у наступну пробірку. Аналогічно проводять розведення для наступних дев'яти пробірок. З останньої пробірки відбирають 1 мл. Таким чином, кінцевий об'єм у кожній пробірці становить 1 мл (МПБ чи рідке сусло і розчин ПАР), а концентрація ПАР у кожній наступній пробірці знижується у 2 рази. Як контроль використовують 1 мл МПБ (рідкого сусла) без додавання розчину ПАР. Далі у 5 6 кожну з пробірок вносять по 0,1 мл суспензії тест-культур (10 -10 КУО/мл), та перемішують. Пробірки інкубують впродовж 24 год. при 28-30 °C. Результати оцінюють візуально за помутнінням середовища: (+) - пробірки, в яких спостерігають помутніння середовища (ріст тест-культури), (-) - помутніння немає (ріст відсутній). Мінімальну інгібуючу концентрацію розчину ПАР визначають як середнє значення між концентраціями ПАР в останній пробірці, де ріст відсутній, і в попередній, де він наявний. Як тест-культури під час визначення антимікробних властивостей ПАР використовують штами бактерій {Escherichia coli IEM-1, Bacillus subtilis БТ-2) і дріжджів {Candida albicans Д-6) з колекції живих культур кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій, а також фітопа-тогенні бактерії з Української колекції мікроорганізмів (УКМ): Pectobacterium carotovorum УКМ В-1095, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens УКМ В1015 і Xanthomonas campestris pv. campestris УКМ В-1049. Значення мінімальної інгібуючої концентрації ПАР залежно від типу пересмаженої соняшникової олії наведено у табл. 1. 40 2 UA 115495 C2 Таблиця 1 Мінімальна інгібуюча концентрація поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii IMB В-7405, синтезованих на олієвмісних субстратах Олія як субстрат для синтезу ПАР Відпрацьована після смаження м'яса Відпрацьована після смаження картоплі 5 10 15 20 Тест-культура В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) В. subtilis БТ-2 (спори) Е.соlі IEМ-1 С. albicans Д-6 P. syringae pv. atrofaciens УКМ В- 1015 X. campestris pv. campestris УКМ В-1049 P. corotovorum УКМ В-1095 В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) В. subtilis БТ-2 (спори) E. coli IEM-1 С. albicans Д-6 P. syringae pv. atrofaciens УКМ В-1015 X. campestris pv. campestris УКМ В-1049 P. corotovorum УКМ В-1095 MIK, мкг/мл 56 142 28 71 49 28 90 16 50 8 33 14 16 50 Наведені дані свідчать, що ПАР, синтезовані на відпрацьованій після смаження картоплі олії, проявляють вищі антимікробні властивості, ніж одержані на відпрацьованому після смаження м'яса субстраті: МІК становить 8-50 і мкг/мл 28-142 відповідно. Приклад 2. Залежність антимікробних властивостей ПАР N. vaccinii IMB В-7405 природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,8 % меляси (масова частка), 0,5 % відпрацьованої після смаження картоплі олії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР і визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, значення МIК ПАР, синтезованих з використанням для одержання інокуляту відпрацьованої після смаження картоплі олії, є в 1,8-3,5 разу нижчими, ніж показники, встановлені для ПАР, одержаних із застосуванням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Таблиця 2 Вплив природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту на антимікробні властивості ПАР N. vaccinii IMB В-7405, синтезованих на відпрацьованій після смаження картоплі олії Джерело вуглецю у середовищі Тест-культури МІК, мкг/мл для одержання інокуляту В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) 45 В. subtilis БТ-2 (спори) 90 Меляса Е. соlі IEМ-1 28 С. albicans Д-6 90 В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) 16 50 Відпрацьована після смаження В. subtilis БТ-2 (спори) картоплі олія Ε соli IЕМ-1 8 С. albicans Д-6 33 + Приклад 3. Активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази N. vaccinii IMB В-7405 від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту 3 UA 115495 C2 5 10 15 20 Оскільки штам IMB В-7405 синтезує комплекс гліко-, фосфо-, аміно- та нейтральних ліпідів, цілком ймовірно, що в різних умовах культивування N. vaccinii IMB В-7405 може змінюватися співвідношення компонентів комплексу. За літературними даними аміноліпіди є ефективнішими антимікробними агентами порівняно з гліколіпідами. Отже, можливо, що за використання відпрацьованої олії як для одержання інокуляту. так і біосинтезу ПАР вміст аміноліпідів у складі синтезованого комплексу є вищим, ніж при вирощувані посівного матеріалу на середовищі з + мелясою. Для перевірки цього припущення аналізують активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази - ключового ферменту біосинтезу аміноліпідів у N. vaccinii IMB В-7405. Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 2 упродовж 24 і 48 год. Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв, + 4 °C). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05 Μ К -фосфатним буфером (рН 7,0), центрифугуючи (4000 g, 15 хв, 4 °C). Відмиті клітини ресуспендують в 0,05 Μ + К -фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнують ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 60 с при 4 °C на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000 g, 30 хв, 4 °C), осад відділяють, а супернатант використовують як безклітинний екстракт. Активність глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4) аналізують за утворенням глутамату під час окиснення НАДФН при 340 нм. + Як видно з наведених у табл. 3 даних, активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 на відпрацьованій після смаження картоплі олії є вищою у разі вирощування інокуляту на такому самому субстраті. Таблиця 3 Вплив природи джерела вуглецю у середовищі для одержання + інокуляту на активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази N vaccinii IMB В-7405 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Меляса Відпрацьована після смаження картоплі олія 25 -1 -1 Активність (нмоль хв. мг білка) у фазі росту ранній експоненційній пізній експоненційній 800±40 950±47 1200±60 1600±80 Отже, використання відпрацьованої після смаження картоплі олії для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію синтезованих поверхнево-активних речовин у 1,8-3,5 разу (до 8-50 мкг/мл). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, який відрізняється тим, що для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4
ДивитисяДодаткова інформація
МПК / Мітки
МПК: C12N 1/14, C12P 1/06, C12R 1/365
Мітки: речовин, поверхнево-активних, спосіб, одержання
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/6-115495-sposib-oderzhannya-poverkhnevo-aktivnikh-rechovin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб одержання поверхнево-активних речовин</a>
Попередній патент: Кришка для колодязя зі зміцненого волокном полімерного матеріалу
Наступний патент: Спосіб очищення води від іонів важких металів активованими біомінералами
Випадковий патент: Шпиндельний вузол верстата