Спосіб комплексної переробки плодів глоду для отримання засобу з імуномодулюючою дією

Реферат: Спосіб комплексної переробки плодів глоду для отримання засобу з імуномодулюючою дією шляхом послідовної обробки сировини хлороформом, при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:8-1:10; екстракцією отриманого шроту етилацетатно-спиртовою сумішшю (8:2), при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:10-1:13; екстракцією водою з наступним концентруванням. Як рослинну сировину використовують плоди глоду м'якуватого (Crataegus submollis Sarg.), екстрагують гарячою водою, при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:4-1:5, тричі по 30 хвилин, з наступним видаленням білково-полісахаридного комплексу, при загальному співвідношенні водний витяг:96 % етанол 1:3. UA 116466 U (12) UA 116466 U UA 116466 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до хіміко-фармацевтичної галузі, а саме до способів одержання з рослинної сировини біологічно активних комплексів з імуномодулюючою активністю. Під впливом екологічних та соціальних факторів, психо-емоційного перенавантаження у населення спостерігається зниження імунітету, що є пусковим фактором для виникнення різноманітних захворювань. При порушенні функцій імунної системи спостерігається загострення хронічних захворювань, зниження активності, підвищення чутливості до запальних захворювань [1, 2]. При лікуванні інфекційних захворювань, коли зазвичай використовують антибіотикотерапію, слід пам'ятати, що антибактеріальні препарати сприяють пригніченню розвитку збудника, а за його елімінацію відповідають фактори імунітету, що свідчить про необхідність відновлення або стимулювання функціональної активності імунної системи [3, 4]. З метою зміцнення та корекції імунної системи поряд з синтетичними препаратами широко використовують лікарські засоби рослинного походження, для яких характерні низька токсичність, комплексна дія за рахунок різноманітних біологічно активних речовин (ВАР) та м'яка імуномодулююча дія. Оскільки асортимент імуномоделюючих засобів рослинного походження на фармацевтичному ринку України досить обмежений, актуальним для медицини та фармації є пошук та розробка вітчизняних ефективних лікарських засобів рослинного походження з імуномодулюючою дією. При одержанні лікарських засобів рослинного походження важливе місце займає питання комплексної переробки сировини. Відомий спосіб комплексної переробки плодів горобини звичайної шляхом послідовної екстракції повітряно-сухої подрібненої сировини розчинниками з різною діелектричною сталою, зокрема водою та гідрофільними і гідрофобними органічними розчинниками, причому на кожному етапі екстракції, починаючи з другого, екстрагують шрот після видалення з нього попереднього розчинника, екстракцію здійснюють у 6 етапів послідовно водою при температурі 90-95 °C, розчинниками з діелектричною сталою відповідно 75-51, 50-26, 25-11, 10-1 при температурі 18-25 °C та підкисленим або підсоленим, або слаболужним водним розчином при температурі 60-80 °C [5]. Недоліком даного способу є його багатостадійність, трудомісткість та довготривалість. Спосіб потребує додаткових енергозатрат та використання різних органічних розчинників, що не завжди економічно доцільно. Відомий спосіб отримання сухого екстракту звіробою, який складається з таких етапів: екстрагування ВАР з рослинної сировини ацетоном в апараті Сокслета (16-20 циклів) та випаровування екстракту під вакуумом до густого залишку; рослинну сировину, яка залишилася після екстрагування ацетоном, висушують та екстрагують 70 % етанолом (1:10) методом перколянії протягом 24 годин та упарюють до смолистого залишку; сировину знову сушать при 25-30 °C протягом 6 годин та проводять екстракцію ВАР 30 % етиловим спиртом [6]. Недоліком цього способу є складність, обумовлена довготривалістю, а також використання вогненебезпечних та токсичних розчинників. Відомий спосіб одержання білково-полісахаридних комплексів імуномодулюючої дії з різних рослин, у тому числі трави фіалки, шляхом екстракції рослинної сировини водою, осадження суми полісахаридів різними дегідратуючими агентами з подальшою їх очисткою [7]. Проте, даний спосіб не включає комплексну переробку сировини, а отже, не дозволяє виділити інші групи БАР з різноманітною фармакологічною активністю. За прототип було вибрано спосіб одержання засобу з антимікробною активністю з трави підмаренника справжнього шляхом попередньої обробки рослинної сировини хлороформом, багаторазовою екстракцією отриманого шроту органічним розчинником з наступним концентруванням, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують траву підмаренника справжнього (Galium verum L), екстракцію здійснюють етилацетатно-спиртовою сумішшю (8:2) з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:10-1:15 при постійно підтримуваній температурі 70-75 °C протягом 12 годин [8]. Цей спосіб обмежується отриманням етилацетатно-спиртового комплексу з трави підмаренника справжнього і не ставить за мету вилучення інших БАР зі шроту, який залишається. Проведеними раніше дослідженнями встановлено, що хлороформний та етилацетатноспиртовий витяги з плодів глоду м'якуватого (Crataegus submollis Sarg.) родини розові Rosaceae L, містять жирні кислоти, терпeноїди, каротиноїди та виявляють антимікробну активність. Шрот, 1 UA 116466 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який залишається після отримання ліпофільних фракцій, містить значну кількість БАР і може бути використаний для отримання біологічно-активних субстанцій. Задача корисної моделі полягає у створенні нового способу комплексної переробки лікарської рослинної сировини, в якому шляхом поєднання параметрів одержання екстрактів, параметрів застосовуваних в способі екстрагентів, умов та режимів обробки сировини забезпечує одержання БАР імуномодулюючої дії при вичерпній екстракції сировини. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі комплексної переробки рослинної сировини для отримання засобу з імуномодулюючою дією шляхом послідовної обробки сировини хлороформом при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:8-1:10; екстракцією отриманого шроту етилацетатно-спиртовою сумішшю (8:2) при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:10-1:13; екстракцією водою з наступним концентруванням, згідно з корисною моделлю, рослинну сировину екстрагують гарячою водою при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:4-1:5, тричі по 30 хвилин, з наступним видаленням білково-полісахаридного комплексу при загальному співвідношенні водний витяг:96 % етанол 1:3. Корисною моделлю передбачено, що як рослинну сировину використовують плоди глоду м'якуватого. Глід м'якуватий (Crataegus submollis Sarg.) дерево до 8 м заввишки з м'ясистими, соковитими плодами, рослина належить до родини розові (Rosaceae L.) та використовується в народній медицині як гіпотензивний засіб [9]. Експериментальним шляхом встановлено, що ефективним при здійсненні заявленого способу є використання трикратної екстракції сировини водою, співвідношення сировини до води 1:4-1:5 та одержанні витягу, який за об'ємом дорівнює масі сировини. При цьому, якщо співвідношення менше 1:4, то не забезпечується достатня екстракція БАР, що призводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Якщо співвідношення більше 1:5, то це призводить до ускладнення та подовження технологічного процесу, збільшення енерговитрат. З метою зменшення витрат етанолу доцільним є концентрування водного витягу до 1/3 об'єму. Отриманий екстракт плодів глоду м'якуватого - це темно-жовті блискучі кристали з характерним запахом. Усі параметри заявленого способу визначено експериментальним шляхом з урахуванням біологічної активності одержаного засобу, ефективності, доступності та нешкідливості реактивів, практичного відтворення способу у промислових умовах. Сукупність ознак заявленого способу є новою, невідомою із джерел інформації. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Заготовлені у фазу повної стиглості плоди глоду м'якуватого піддають вичерпній екстракції хлороформом при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:8-1:10 та загальній тривалості екстракції 12-15 годин при температурі 60 °C-65 °C (ліпофільний комплекс). Висушений на повітрі при кімнатній температурі шрот вичерпно екстрагують у замкненому циклі етилацетатно-спиртовою сумішшю (8:2) при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:10-1:13 протягом 12 годин при постійно підтримуваній температурі 75-80 °C (фенольний комплекс). Потім висушений на повітрі шрот заливають гарячою водою у співвідношенні 1:4-1:5 та витримують на водяному нагрівнику при температурі 90 °C протягом 30 хвилин. Екстракцію водою проводять тричі. Отримані водні витяги об'єднують, концентрують спочатку до об'єму, що відповідає масі сировини, а потім до 1/3 частини попереднього об'єму і концентрат додають до трикратного об'єму 96 % спирту етилового. Осад відфільтровують, а фільтрат упарюють до видалення екстрагенту і отримання сухого залишку. Вихід цільового продукту становить 10 %. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. 1,0 кг заготовлених у фазу повного достигання плодів подрібнювали та завантажували у циркуляційний екстрактор, заливали 8,0 л хлороформу та вичерпно екстрагували при постійно підтримуваній температурі 60 °C протягом 12 годин з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі. Одержаний знежирений і висушений на повітрі шрот заливали етилацетатно-спиртовою сумішшю (8:2) і вичерпно екстрагували при постійно підтримуваній температурі 75 °C протягом 12 годин з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі. Висушений на повітрі при кімнатній температурі шрот тричі заливали по 1,0 л гарячої води : (t= 90 °C) та витримували на киплячому водяному нагрівнику протягом 30 хвилин. Отримані витяги об'єднували та концентрували до об'єму 1,0 л, а потім до 300 мл, після чого осаджували полісахариди 900 мл 96 % спирту етилового при перемішуванні, осад відфільтровували, фільтрат упарювали на роторно-вакуумному апараті до видалення екстрагенту і отримання сухого залишку. 2 UA 116466 U 5 10 15 20 Вихід цільового продукту становить 10 %. Приклад 2. Імуномодулюючу дію субстанції з плодів глоду м'якуватого, одержаного за заявленим способом, вивчали in vitro в реакції макрофагальної трансформації мононуклеарів периферичної крові [10, 11, 12]. Первинні культури імунокомпетентних клітин одержували з гепаринізованої крові донорів шляхом відстоювання при температурі 4-8 °C. Мононуклеарні клітини крові культивували в середовищі 199 з 10 % фетальної сироватки. До живильного середовища додавали по 100 ОД/см натрієвої солі бензилпеніциліну та стрептоміцину, а також амфотеріцин В. Сухі екстракти вносили до первинних культур імунокомпетентних клітин у кількості 5 мкг/мл, 50 мкг/мл і 100 мкг/мл та інкубували при 37 °C протягом 23 годин. З метою оцінки фагоцитарної активності макрофагів і їх попередників через 23 години культивування в культуру вносили референтний штам Staphylococcus aureus-209P, інактивований прогріванням. Оцінку імуномодулюючої дії сухих екстрактів на імунокомпетентні клітини проводили за наступними показниками: ПМТМ - показник макрофагальної трансформації мононуклеарів; фагоцитарний індекс (ФІ); фагоцитарне число. Контроль включав постановку реакції макрофагальної трансформації мононуклеарів периферичної крові без додавання досліджуваних екстрактів. Випробування проводили п'ятикратно. Одержані показники статистично обробляли за допомогою програми "Microsoft Excel" [13]. Результати досліджень наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Вплив сухого екстракту плодів Crataegus submollis на показники макрофагальної трансформації й фагоцитарної активності гематогенних попередників макрофагів, n=5 Сухий екстракт Концентрація, мкг/мл Crataegus submollis Контроль 5 50 100 ПМТМ, % 34,03,9 52,64,1* 54,83,0* 32,63,4 Фагоцитарний індекс, Фагоцитарне число % 56,44,0 10,21,2 63,92,6* 12,411,4* 69,73,3* 11,80,7* 46,4 2,8 7,60,6 Примітки: * - Р