Спосіб вироблення кардіоліпіну

Реферат: Спосіб вироблення кардіоліпіну з подрібнених тканин серцевого м'яза великої рогатої худоби шляхом екстракції нейтральних ліпідів ацетоном фаршу подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, наступним видаленням ацетону із отриманої суміші, екстракції фосфоліпідів метанолом, виділенням із метанольного екстракту кардіоліпіну у вигляді первинної барієвої солі, переосадженням сумішшю метанолу та розчином натрію хлориду та виділенням вторинної барієвої солі кардіоліпіну з наступним виділенням у вигляді натрієвої солі у вигляді ефірного розчину, наступним зневодненням розчину, упарюванням та отриманням спиртового розчину кардіоліпіну. Як вихідну сировину використовують жом подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, отриманий після виробництва препарату Цитохром-С. UA 118717 U (54) СПОСІБ ВИРОБЛЕННЯ КАРДІОЛІПІНУ UA 118717 U UA 118717 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до хімії природних сполук, зокрема до фармацевтичної промисловості, зокрема активних реагентів, які можуть бути використані в медицині для виготовлення діагностичних препаратів, а також в засобах для виявлення антиліпоїдальних антитіл, зокрема в серодіагностиці, а також у науково-дослідницькій роботі. Відомий спосіб вироблення кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділенням натрієвої солі, відповідно до якого подрібнену тканину серця екстрагують регенерованим ацетоном, після фільтрації екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще два рази сумішшю ацетону і ацетону регенерованого співвідношенні 1:1, зневоднену макуху серцевої маси обробляють сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу, після фільтрації макухи процес повторюють ще два рази сумішшю метанолу та хлороформу, а також сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу у співвідношенні 9,5:0,5 (Патент України № 111439). Недоліками відомого способу є застосування на етапі екстрагування ліпідів суміші метанолхлороформ. Застосування хлороформу є недоцільним з точки зору якості готового продукту. Застосування хлороформу для екстрагування викликає необхідність в додаткових способах очищення готового продукту. Найближчим аналогом є спосіб вироблення кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном фаршу з подрібнених тканин серця великої рогатої худоби, наступним видаленням ацетону із отриманої суміші, подальшої обробки метанолом, отримання метанольного екстракту осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі. (АС СРСР № 709092). За відомим способом екстракцію ацетоном здійснюють в атмосфері інертного газу при температурі від -3 °C до -10 °C, а осадження барієвої солі кардіоліпіна здійснюють при температурі від +3 °C до +5 °C. Недоліком відомого способу є значна трудомісткість процесу, недостатній ступінь очищення цільового продукту і відносно низький вихід кардіоліпіну (0,5 г з 1 кг серцевого м'яза). Відомо також, що для отримання Цитохрому-С як вихідну сировину застосовують очищений серцевий м'яз великої рогатої худоби. Для цього здійснюють екстракцію цитохрому-С з очищеної подрібненої маси сердець великої рогатої худоби. Екстракцію проводять шляхом додавання в реактор з розчином сульфату амонію очищеної подрібненої маси з сердець великої рогатої худоби, перемішують при заданих параметрах і додають розчин сірчаної кислоти. При встановленому значенні рН 4,3-0,05 суміш розділяють на екстракт цитохрому-С і жом (зневоднений серцевий м'яз великої рогатої худоби). Екстракт цитохрому-С подають на подальшу обробку, а жом (зневоднений серцевий м'яз) утилізують. Передача жому з серцевого м'яза на утилізацію призводить до завищення витрат на виробництво фармацевтичних препаратів з сировини тваринного походження. Однак, з'ясувалось, що у серцевому м'язі після зневоднення та екстракції цитохрому залишаються ліпіди, з яких можна в подальшому екстрагувати кардіоліпін. Тому, автори вирішили використати цей жом як вихідну сировину у виробництві кардіоліпіну. В основу корисної моделі поставлено задачу: за рахунок зміни початкового етапу використання вихідної сировини і застосування як вихідної сировини жому серцевого м'яза великої рогатої худоби, отриманого після екстрагування цитохрому-С, зменшити тривалість процесу отримання, знизити собівартість та зменшити трудомісткість процесу отримання кардіоліпіну. Поставлена задача вирішується тим, що у способі вироблення кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном фаршу з подрібнених тканин серця великої рогатої худоби, наступним видаленням ацетону із отриманої суміші, подальшої обробки метанолом, отримання метанольного екстракту, осадження цільового продукту розчином хлористого барію, упарювання і виділення у вигляді натрієвої солі, видалення ефіру шляхом випарювання при вакуумі, згідно з корисною моделлю, як вихідну сировину використовують жом подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, отриманий після виробництва препарату Цитохром-С. Згідно з корисною моделлю, перед упарюванням здійснюють додаткове осадження та очищення кардіоліпіну. Згідно з корисною моделлю, отримання кардіоліпіну видалення ефіру здійснюють при вакуумі із застосуванням ротаційного випарного апарата. Згідно з корисною моделлю, упарювання здійснюють при показниках вакууму 0,06-0,05 МПа і температурі 37±3 °C. Спосіб вироблення кардіоліпіну здійснюють наступним чином. 1 UA 118717 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Подрібнений серцевий м'яз, отриманий після екстрагування цитохрому, зважують і промивають ацетоном. Надлишок рідини відфільтровують, і зневоднений фарш подають в реактор. В реактор додають охолоджений ацетон і перемішують суміш протягом трьох годин. Задані умови дозволяють провести екстрагування ліпідів за короткий термін (біля 3 годин). Після закінчення екстрагування суміш серцевої маси з ацетоном відфільтровують і відфільтровану серцеву масу знову подають в реактор. Таким чином екстрагування повторюють двічі. По закінченні екстрагування серцевий м'яз очищують від ацетону метанолом. Зневоднений фарш серцевих м'язів завантажують в реактор і додають метанол для екстракції фосфоліпідів. Перемішують при температурі 20±2 °C. Задані умови дозволяють провести екстрагування фосфоліпідів за короткий термін (3 години). Після закінчення екстрагування суміш відфільтровують і відфільтровану серцеву масу знову подають в реактор. Таким чином екстрагування повторюють двічі. Метанольний екстракт перекачують в реактор та охолоджують. Первину барієву сіль кардіоліпіну отримують шляхом осадження розчином барію хлориду. Осад первинної барієвої солі розчиняють в ефірі та проводять переосадження сумішшю метанолу та розчину барію гідроокису 20 %. Осад вторинної солі розчиняють в ефірі, додають розчин натрію хлориду та отримують натрієву сіль кардіоліпіну. Проводять очищення додаючи ефірно-метанольну суміш та центрифугують, відділяючи надосадкову рідину, яку направляють на повторне осадження. Осадження проводять шляхом повторного отримання барієвої солі кардіоліпіну та наступним отримання натрієвої солі кардіоліпіну. Очищену натрієву сіль кардіоліпіну у вигляді ефірного розчину зневоднюють натрію сульфатом безводним. Відповідно до заявленого способу, проводять випарювання зневодненого ефірного розчину у вакуумі, із застосуванням ротаційного випарювального апарата, та отримують кардіоліпін, до якого додають етанол та фільтрують. Ефективність способу підтверджується наступними прикладами: Приклад 1 Відповідно до технології, що заявляється, 45 кг подрібненого серцевого м'яза, отриманого після екстрагування цитохрому, промивають 15 л ацетону для зневоднення. Отриманий зневоднений фарш завантажити в реактор, додати охолоджений до температури мінус (10-12) ºС ацетон та перемішувати при 60 об/хв при температурі (4-7) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування нейтральних ліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш серцевої маси з ацетоном відфільтрувати на нутч-фільтрі та промити ацетоном. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Зневоднений фарш завантажити в реактор, додати 100 л метанолу та перемішувати при 60 об/хв при температурі (20±2) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування фосфоліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш промити на нутч-фільтрі. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Метанольний екстракт зібрати в реактор охолодити до температури (4±2) ºС та додати при безперервному перемішуванні до 2,9 л, охолодженого до температури (4±2) ºС, 20 % розчину барію хлориду. Реакційну масу витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. Зібрати осад та додати до нього 24 л метанолу, перемішати та провести центрифугування протягом 20 хв. при 2500 об/хв. і температурі (4±2) ºС. Отриманий осад первинної барієвої солі розчинити в 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення осаду. Додати 9,6 л метанолу та 0,096 л розчину барію хлориду 20 %. Суміш перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв до повного розчинення. До ефірної суміші долити 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду та 0,96 л спирту етилового. Розділити отриману суміш на ділильної воронці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару 2 л ефіру, по 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду і по 0,96 л спирту етилового для кращого очищення. До отриманого ефірного розчину додати 6,4 л метанолу, перемішати, витримати при кімнатній температурі 30 хв., відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв протягом 20 хв при температурі (4±2) ºС. До осаду додати 6,4 л метанолу та перемішати до повного розчинення, витримати протягом 30 хв. при температурі (2±1) ºС, долити 0,96 л 20 % розчину барію хлориду (попередньо охолодженого до температури (4±2) ºС). Суміш перемішати та витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. 2 UA 118717 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отриманий осад після проведення очищення, відділити центрифугуванням при 2500 об/хв протягом 20 хв при температурі (4±2) ºС. До осаду додати 4,8 л ефіру та перемішати до повного розчинення. Додати 9,6 л метанолу та 0,096 л розчину барію хлориду 20 % для отримання вторинної барієвої солі. Суміш перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв до повного розчинення. До ефірної суміші долити 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду та 0,96 л спирту етилового. Розділити отриману суміш на ділильній воронці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару 2 л ефіру, 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду і 0,96 л спирту етилового для кращого очищення. До ефірного розчину кардіоліпіну додати 3 кг натрію сірчанокислого, перемішати та витримати при температурі (6±2) ºС на 12-18 годин. Після витримки відфільтрувати осад, а зневоднений ефірний розчин направити на випарювання для відділення ефіру. Відділення ефіру проводять при вакуумі 0,06-0,05 МПа та при температурі (37±3)°С у ротаційному випарному апараті, що дозволяє значно скоротити процес виділення ефіру та досягти вищого ступеня чистоти кардіоліпіну. Після відділення ефіру до очищенного кардіоліпіну додати 5 л спирту абсолютованого, перемішати до повного розчинення та профільтрувати. Приклад 2 Відповідно до технології, що заявляється, 45 кг подрібненого серцевого м'яза, отриманого після екстрагування цитохрому, промивають 15 л ацетону для зневоднення. Отриманий зневоднений фарш завантажити в реактор, додати охолоджений до температури мінус (10-12) ºС) ацетон та перемішувати при 60 об/хв при температурі (4-7) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування нейтральних ліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш серцевої маси з ацетоном відфільтрувати на нутч-фільтрі та промити ацетоном. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Зневоднений фарш завантажити в реактор, додати 100 л метанолу та перемішувати при 60 об/хв при температурі (20±2) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування фосфоліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш промити на нутч-фільтрі. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Метанольний екстракт зібрати в реактор охолодити до температури (4±2) ºС та додати при безперервному перемішуванні до 2,9 л, охолодженого до температури (4±2) ºС, 20 % розчину барію хлориду. Реакційну масу витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. Зібрати осад та додати до нього 24 л метанолу, перемішати та провести центрифугування протягом 20 хв. при 2500 об/хв. і температурі (4±2) ºС. Отриманий осад первинної барієвої солі розчинити в 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення осаду. Суміш розділити на чотири ємності в рівній кількості для зручності проведення процесу. Надалі всі операції проводити з цими чотирма ємностями. У кожну ємність додати по 2,4 л метанолу та по 0,024 л розчину барію хлориду 20 %. Суміш перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати по 1,2 л ефіру в кожну ємність та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення. До ефірної суміші долити по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду та по 0,24 л спирту етилового в кожну ємність. Розділити отриману суміш на ділильної воронці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару по 0,5 л ефіру, по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду і по 0,24 л спирту етилового на кожну ємність для кращого очищення. До отриманого ефірного розчину додати по 1,6 л метанолу в кожну ємність, перемішати, витримати при кімнатній температурі 30 хв., відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. протягом 20 хв. при температурі (4±2) ºС. До осаду додати по 1,6 л метанолу та перемішати до повного розчинення, витримати протягом 30 хв. при температурі (2±1) ºС, долити по 0,24 л 20 % розчину барію хлориду (попередньо охолодженого до температури (4±2) ºС). Суміш перемішати та витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. Отриманий осад після проведення очищення, відділити центрифугуванням при 2500 об/хв протягом 20 хв при температурі (4±2) ºС. До осаду в ємностях додати по 1,2 л ефіру та перемішати до повного розчинення. Додати по 2,4 л метанолу та по 0,024 л розчину барію 3 UA 118717 U 5 10 15 20 25 30 35 40 хлориду 20 % в кожну ємність для отримання вторинної барієвої солі. Суміш в ємностях перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати по 1,2 л ефіру в кожну ємність та перемішати протягом 10-15 хв до повного розчинення. До ефірної суміші долити по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду та по 0,24 л спирту етилового. Розділити отриману суміш на ділильній воронці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару по 0,5 л ефіру, по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду і по 0,24 л спирту етилового до кожної ємності для кращого очищення. До ефірного розчину кардіоліпіну додати 3 кг натрію сірчанокислого, перемішати та витримати при температурі (6±2) ºС на 12-18 годин. Після витримки відфільтрувати осад, а зневоднений ефірний розчин направити на випарювання для відділення ефіру. Відділення ефіру проводять при вакуумі 0,06-0,05 МПа та при температурі (37±3)°С у ротаційному випарному апараті, що дозволяє значно скоротити процес виділення ефіру та досягти вищого ступеню чистоти кардіоліпіну. Після відділення ефіру до очищенного кардіоліпіну додати 5 л спирту (із вмістом етанолу не менше 96 %), перемішати до повного розчинення та профільтрувати. Процес отримання кардіоліпіну за заявленим способом є менш трудомістким, потребує менше часу на проведення процесу та є економічно більш доцільним, ніж спосіб, що заявлений в АС № 709092, за рахунок використання вже підготовленої сировини, яку отримують після екстрагування цитохрому. Крім того, запропонований спосіб приводить до економії сировини з подрібнених сердець великої рогатої худоби. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 1. Спосіб вироблення кардіоліпіну з подрібнених тканин серцевого м'яза великої рогатої худоби шляхом екстракції нейтральних ліпідів ацетоном фаршу подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, наступним видаленням ацетону із отриманої суміші, екстракції фосфоліпідів метанолом, виділенням із метанольного екстракту кардіоліпіну у вигляді первинної барієвої солі, переосадженням сумішшю метанолу та розчином натрію хлориду та виділенням вторинної барієвої солі кардіоліпіну з наступним виділенням у вигляді натрієвої солі у вигляді ефірного розчину, наступним зневодненням розчину, упарюванням та отриманням спиртового розчину кардіоліпіну, який відрізняється тим, що як вихідну сировину використовують жом подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, отриманий після виробництва препарату Цитохром-С. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що перед упарюванням здійснюють додаткове осадження та очищення кардіоліпіну. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на стадії отримання кардіоліпіну видалення ефіру здійснюють при вакуумі із застосуванням ротаційного випарного апарата. 4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що упарювання здійснюють при показниках вакууму 0,06-0,05 МПа і температурі 37±3 °С. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4