Спосіб виробництва кардіоліпіну

Реферат: Спосіб виробництва кардіоліпіну шляхом екстракції нейтральних ліпідів ацетоном фаршу подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби включає видалення ацетону із отриманої суміші, екстракцію фосфоліпідів метанолом, виділення із метанольного екстракту кардіоліпіну у вигляді первинної барієвої солі. Здійснюють переосадження сумішшю метанолу та розчином натрію хлориду та виділенням вторинної барієвої солі кардіоліпіну з наступним виділенням у вигляді натрієвої солі у вигляді ефірного розчину. Потім зневоднюють розчин, упарюють при вакуумі та отримують спиртовий розчин кардіоліпіну. Перед упарюванням здійснюють додаткове осадження та очищення кардіоліпіну. UA 118715 U (54) СПОСІБ ВИРОБНИЦТВА КАРДІОЛІПІНУ UA 118715 U UA 118715 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хімії природних сполук, зокрема до фармацевтичної промисловості, зокрема стосується активних реагентів, які можуть бути використані в медицині для виготовлення діагностичних препаратів, а також в засобах для виявлення антиліпоїдальних антитіл, зокрема в серодіагностиці, а також у науково-дослідницькій роботі. Відомий спосіб виробництва кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном подрібненої тканини серця великої рогатої худоби, обробки метанолом, осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділенням натрієвої солі, відповідно до якого подрібнену тканину серця екстрагують регенерованим ацетоном, після фільтрації екстрагування нейтральних ліпідів повторюють ще два рази сумішшю ацетону і ацетону регенерованого співвідношенні 1:1, зневоднену макуху серцевої маси обробляють сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу, після фільтрації макухи процес повторюють ще два рази сумішшю метанолу та хлороформу, а також сумішшю регенерованого метанолу та хлороформу у співвідношенні 9,5:0,5 (Патент України № 111439). Недоліками відомого способу є застосування на етапі екстрагування ліпідів суміші метанолхлороформ. Застосування хлороформу є недоцільним з точки зору якості готового продукту. Застосування хлороформу для екстрагування викликає необхідність в додаткових способах очищення готового продукту. Відомий також спосіб виробництва кардіоліпіну шляхом екстракції ацетоном фаршу з подрібнених тканин серця великої рогатої худоби, наступного видалення ацетону із отриманої суміші, подальшої обробки метанолом, отримання метанольного екстракту осадження цільового продукту розчином хлористого барію і виділення у вигляді натрієвої солі. (Авторське свідоцтво СРСР № 709092). Даний спосіб вибраний як найближчий аналог. За відомим способом екстракцію ацетоном здійснюють в атмосфері інертного газу при температурі від -3 ºС до -10 ºС, а осадження барієвої солі кардіоліпіна здійснюють при температурі від +3 ºС до+5 ºС. Недоліком відомого способу є значна трудомісткість процесу, недостатній ступінь очищення цільового продукту і відносно низький вихід кардіоліпіну (0,5 г з 1 кг серцевого м'яза). В основу корисної моделі поставлено задачу: за рахунок зміни процесів осадження та випарювання зменшити трудомісткість процесу, підвищити ступінь очищення цільового продукту і збільшити вихід кардіоліпіну. Поставлена задача вирішується тим, що у способі виробництва кардіоліпіну шляхом екстракції нейтральних ліпідів ацетоном фаршу подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, наступним видаленням ацетону із отриманої суміші, екстракції фосфоліпідів метанолом, виділенням із метанольного екстракту кардіоліпіну у вигляді первинної барієвої солі, переосадженням сумішшю метанолу та розчином натрію хлориду та виділенням вторинної барієвої солі кардіоліпіну з наступним виділенням у вигляді натрієвої солі у вигляді ефірного розчину, наступним зневодненням розчину, упарюванням при вакуумі та отриманням спиртового розчину кардіоліпіну, згідно з корисною моделлю, перед упарюванням здійснюють додаткове осадження та очищення кардіоліпіну. Згідно з корисною моделлю, додаткове осадження проводять шляхом повторного отримання барієвої солі кардіоліпіну та наступного отримання натрієвої солі кардіоліпіну, додаючи кожен раз до верхнього шару ефір, 18 % розчин натрію хлориду і не менш ніж 96відсотковий спирт етиловий. Додаткове очищення та осадження полягає в переосадженні барієвої солі кардіоліпіну, видаленні домішок та виділенні вторинної натрієвої солі кардіоліпіну, що приводить до збільшення відсотка вмісту ліпідів та чистоти кардіоліпіну. Спосіб виробництва кардіоліпіну здійснюють наступним чином: Серця великої рогатої худоби очищають від жиру, крові та сполучної тканини і подрібнюють. Отриманий фарш подають в ємність і промивають ацетоном. Надлишок рідини відфільтровують, і зневоднений фарш подають в реактор. В реактор додають охолоджений ацетон і перемішують суміш протягом трьох годин. Задані умови дозволяють провести екстрагування ліпідів за короткий термін (3 години). Після закінчення екстрагування суміш серцевої маси з ацетоном відфільтровують і відфільтровану серцеву масу знову подають в реактор. Таким чином екстрагування повторюють двічі. По закінченні екстрагування серцевий м'яз очищують від ацетону метанолом. Зневоднений фарш серцевих м'язів завантажують в реактор і додають метанол для екстракції фосфоліпідів. Перемішують при температурі 20±2 °C. Задані умови дозволяють провести екстрагування фосфоліпідів за короткий термін (3 години). Після закінчення екстрагування суміш відфільтровують і відфільтровану серцеву масу знову подають в реактор. Таким чином екстрагування повторюють двічі. 1 UA 118715 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Метанольний екстракт перекачують в реактор та охолоджують. Первину барієву сіль кардіоліпіну отримують шляхом осадження розчином барію хлориду. Осад первинної барієвої солі розчиняють в ефірі та проводять переосадження сумішшю метанолу та розчину барію гідроокису 20 %. Осад вторинної солі розчиняють в ефірі, додають розчин натрію хлориду та отримують натрієву сіль кардіоліпіну. Проводять додаткове очищення додаючи ефірнометанольну суміш та центрифугують, відділяючи надосадкову рідину, яку направляють на повторне осадження. Додаткове осадження проводять шляхом повторного отримання барієвої солі кардіоліпіну та наступним отриманням натрієвої солі кардіоліпіну. Очищену натрієву сіль кардіоліпіну у вигляді ефірного розчину зневоднюють натрію сульфатом безводним. Проводять випарювання зневодненого ефірного розчину та отримують кардіоліпін, до якого додають етанол та фільтрують. Ефективність способу підтверджується наступними прикладами: Приклад 1 150 кг очищеного від крові, жиру та сполучної тканини серцевого м'яза ВРХ подрібнити та переробити на фарш. Провести зневоднення фаршу 15 л ацетону. Отриманий зневоднений фарш завантажити в реактор, додати охолоджений до температури мінус (10-12) ºС) ацетон та перемішувати при 60 об/хв при температурі (4-7) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування нейтральних ліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш серцевої маси з ацетоном відфільтрувати на нутч-фільтрі та промити ацетоном. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Зневоднений фарш завантажити в реактор, додати 100 л метанолу та перемішувати при 60 об/хв. при температурі (20±2) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування фосфоліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш промити на нутч-фільтрі. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Метанольний екстракт зібрати в реактор охолодити до температури (4±2) ºС та додати при безперервному перемішуванні до 2,9 л, охолодженого до температури (4±2) ºС, 20 % розчину барію хлориду. Реакційну масу витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. Зібрати осад та додати до нього 24 л метанолу, перемішати та провести центрифугування протягом 20 хв. при 2500 об/хв. і температурі (4±2) ºС. Отриманий осад первинної барієвої солі розчинити в 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення осаду. Додати 9,6 л метанолу та 0,096 л розчину барію хлориду 20 %. Суміш перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення. До ефірної суміші долити 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду та 0,96 л спирту етилового. Розділити отриману суміш на ділильної воронці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару 2 л ефіру, по 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду і по 0,96 л спирту етилового для кращого очищення. Відповідно до технології, що заявляється, до отриманого ефірного розчину додати 6,4 л метанолу, перемішати, витримати при кімнатній температурі 30 хв., відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. протягом 20 хв. при температурі (4±2) ºС. До осаду додати 6,4 л метанолу та перемішати до повного розчинення, витримати протягом 30 хв. при температурі (2±1) ºС, долити 0,96 л 20 % розчину барію хлориду (попередньо охолодженого до температури (4±2) ºС). Суміш перемішати та витримати при температурі (4±2) ºС протягом 1218 годин для формування осаду. Отриманий осад після проведення додаткового очищення, відділити центрифугуванням при 2500 об/хв. протягом 20 хв. при температурі (4±2) ºС. До осаду додати 4,8 л ефіру та перемішати до повного розчинення. Додати 9,6 л метанолу та 0,096 л розчину барію хлориду 20 % для отримання вторинної барієвої солі. Суміш перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення. До ефірної суміші долити 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду та 0,96 л спирту етилового. Розділити отриману суміш на ділильній лійці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару 2 л ефіру, 5,8 л 18 % розчину натрію хлориду і 0,96 л спирту етилового для кращого очищення. До ефірного розчину кардіоліпіну додати 3 кг натрію сірчанокислого, перемішати та витримати при температурі (6±2) ºС на 12-18 годин. Після витримки відфільтрувати осад, а 2 UA 118715 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зневоднений ефірний розчин направити на випарювання для відділення ефіру при вакуумі 0,060,05 МПа та при температурі (37±3)°С. Після відділення ефіру до очищеного кардіоліпіну додати 5 л спирту абсолютованого, перемішати до повного розчинення та профільтрувати. Приклад 2 150 кг очищеного від крові, жиру та сполучної тканини серцевого м'яза ВРХ подрібнити та переробити на фарш. Провести зневоднення фаршу 15 л ацетону. Отриманий зневоднений фарш завантажити в реактор, додати охолоджений до температури мінус (10-12) ºС) ацетон та перемішувати при 60 об/хв. при температурі (4-7) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування нейтральних ліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш серцевої маси з ацетоном відфільтрувати на нутч-фільтрі та промити ацетоном. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Зневоднений фарш завантажити в реактор, додати 100 л метанолу та перемішувати при 60 об/хв. при температурі (20±2) ºС протягом трьох годин для проведення екстрагування фосфоліпідів. Протягом цього терміну за заданих умов проходить екстрагування за найбільш короткий термін. Після закінчення екстрагування суміш промити на нутч-фільтрі. Таким чином процес екстрагування провести ще два рази з обов'язковим перемішуванням. Метанольний екстракт зібрати в реактор, охолодити до температури (4±2) ºС та додати при безперервному перемішуванні до 2,9 л, охолодженого до температури (4±2) ºС, 20 % розчину барію хлориду. Реакційну масу витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. Зібрати осад та додати до нього 24 л метанолу, перемішати та провести центрифугування протягом 20 хв. при 2500 об/хв. і температурі (4±2) ºС. Отриманий осад первинної барієвої солі розчинити в 4,8 л ефіру та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення осаду. Суміш розділити на чотири ємності в рівній кількості для зручності проведення процесу. Надалі всі операції проводити з цими чотирма ємностями. У кожну ємність додати по 2,4 л метанолу та по 0,024 л розчину барію хлориду 20 %. Суміш перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати по 1,2 л ефіру в кожну ємність та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення. До ефірної суміші долити по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду та по 0,24 л спирту етилового в кожну ємність. Розділити отриману суміш на ділильної лійці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару по 0,5 л ефіру, по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду і по 0,24 л спирту етилового на кожну ємність для кращого очищення. Відповідно до технології, що заявляється, до отриманого ефірного розчину додати по 1,6 л метанолу в кожну ємність, перемішати, витримати при кімнатній температурі 30 хв., відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. протягом 20 хв. при температурі (4±2) ºС. До осаду додати по 1,6 л метанолу та перемішати до повного розчинення, витримати протягом 30 хв. при температурі (2±1) ºС, долити по 0,24 л 20 % розчину барію хлориду (попередньо охолодженого до температури (4±2) ºС). Суміш перемішати та витримати при температурі (4±2) ºС протягом 12-18 годин для формування осаду. Отриманий осад після проведення додаткового очищення, відділити центрифугуванням при 2500 об/хв. протягом 20 хв. при температурі (4±2) ºС. До осаду в ємностях додати по 1,2 л ефіру та перемішати до повного розчинення. Додати по 2,4 л метанолу та по 0,024 л розчину барію хлориду 20 % в кожну ємність для отримання вторинної барієвої солі. Суміш в ємностях перемішати протягом 30 хв. та відділити осад центрифугуванням при 2500 об/хв. при температурі (4±2) ºС протягом 20 хвилин. Процес центрифугування повторити двічі. До отриманого осаду барієвої солі додати по 1,2 л ефіру в кожну ємність та перемішати протягом 10-15 хв. до повного розчинення. До ефірної суміші долити по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду та по 0,24 л спирту етилового. Розділити отриману суміш на ділильній лійці, збираючи нижній водно-спиртовий шар. Процес розділення повторити ще двічі, додаючи кожен раз до верхнього шару по 0,5 л ефіру, по 1,44 л 18 % розчину натрію хлориду і по 0,24 л спирту етилового до кожної ємності для кращого очищення. Застосування даного етапу додаткового очищення дозволило підвищити вміст ліпідів в готовому продукті. До ефірного розчину кардіоліпіну додати 3 кг натрію сірчанокислого, перемішати та витримати при температурі (6±2) ºС на 12-18 годин. Після витримки відфільтрувати осад, а зневоднений ефірний розчин направити на випарювання для відділення ефіру при вакуумі 0,060,05 МПа та при температурі (37±3)°С. Після відділення ефіру до очищеного кардіоліпіну додати 5 л спирту (із вмістом етанолу не менше 96 %), перемішати до повного розчинення та профільтрувати. 3 UA 118715 U 5 10 15 Відповідно до технології, що заявляється, після отримання первинної барієвої солі та переводу її в натрієву сіль кардіоліпіну проводять додаткове очищення та переосаджують кардіоліпін у вигляді вторинної барієвої солі з наступним виділенням вторинної натрієвої солі кардіоліпіну. Додаткове очищення полягає в проведенні осадження, яке проводять наступним чином: до ефірного розчину первинної натрієвої солі кардіоліпіну додають метанол, витримують для формування осаду та відділяють осад центрифугуванням. До отриманої надосадкової рідини знову додають метанол, витримують для формування осаду та відділяють осад центрифугуванням. Отриманий осад розчиняють в ефірі, додають метанол та розчин барію хлориду та виділяють вторинну барієву сіль кардіоліпіну центрифугуванням. Осад вторинної барієвої солі розчиняють в ефірі, додають спирт етиловий та розчин натрію хлориду та виділяють на ділильній лійці ефірний розчин вторинної натрієвої солі кардіоліпіну. Спосіб отримання кардіоліпіну, що заявляється, має ряд переваг перед способом по Авторському Свідоцтву 709092. Кардіоліпін, що виробляється за заявленим способом, має високі якісні показники, що підтверджується такими даними: вміст ліпідів у спиртовому розчині кардіоліпіну складає 0,51-0,53 %, масова частка кардіоліпіну не менше 85 %, індекс окисленості не перевищує 1,2. В результаті застосування даних змін в технології отримання кардіоліпіну збільшився вміст ліпідів до 0,51-0,53 %, порівняно з 0,5 % без застосування додаткових етапів очищення. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 1. Спосіб виробництва кардіоліпіну шляхом екстракції нейтральних ліпідів ацетоном фаршу подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби, наступного видалення ацетону із отриманої суміші, екстракції фосфоліпідів метанолом, виділення із метанольного екстракту кардіоліпіну у вигляді первинної барієвої солі, переосадження сумішшю метанолу та розчином натрію хлориду та виділення вторинної барієвої солі кардіоліпіну з наступним виділенням у вигляді натрієвої солі у вигляді ефірного розчину, наступного зневоднення розчину, упарювання при вакуумі та отримання спиртового розчину кардіоліпіну, який відрізняється тим, що перед упарюванням здійснюють додаткове осадження та очищення кардіоліпіну. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додаткове осадження проводять шляхом повторного отримання барієвої солі кардіоліпіну та наступного отримання натрієвої солі кардіоліпіну, додаючи кожен раз до верхнього шару ефір, 18 % розчин натрію хлориду і не менш ніж 96-відсотковий спирт етиловий. 35 Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4