Спосіб підвищення енергозабезпечення ацинарних клітин підшлункової залози

Реферат: Спосіб підвищення енергозабезпечення ацинарних клітин підшлункової залози включає додавання до суспензії ізольованих клітин субстрату окиснення. Як субстрат використовують піруват у концентрації 2 ммоль/л. UA 118820 U (54) СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ ЕНЕРГОЗАБЕЗПЕЧЕННЯ АЦИНАРНИХ КЛІТИН ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ UA 118820 U UA 118820 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біології та медицини, а саме фізіології органів травлення, та може бути використана для моделювання терапії або профілактики захворювань підшлункової залози in situ. Відомий способ лікування гострого панкреатиту, за яким пацієнтам внутрішньовенно уводять дипептид глутаміл-глутамін (Zhong X. et al. Intravenous glutamine for severe acute pancreatitis: A meta-analysis // World J. Crit. Care Med. - 2013. - Vol. 2(1). - P. 4-8). У цій роботі проведено мета-аналіз чотирьох рандомізованих контрольованих досліджень, в яких 190 пацієнтам робили ін'єкцію глутаміл-глутаміну, що забезпечив зниження смертності, тривалості перебування у стаціонарі і частоти ускладнень. Недоліком такого способу є те, що окиснення 2+ глутаміну не є Са -залежним, глутамін не може підтримувати високого рівня окисного 2+ фосфорилювання за умов токсичного впливу катіонів Са у надмірно високих концентраціях, зумовлених чинниками розвитку панкреатиту (Gerasimenko J.V. et al. Calmodulin protects against 2+ alcohol-induced trypsinogen activation elicited via Ca release through IP3-receptors // PNAS. - 2011. - Vol. 108. - P. 5873-5878). Найближчим аналогом вибрано спосіб внутрішньовенного введення розчину етилпірувату щурам з індукованим гострим панкреатитом (Luan Z.-G. et al. Protective effect of ethyl pyruvate on pancreas injury in rats with severe acute pancreatitis // J. Surgical Research. - 2013. - Vol. 108. - P. 76-84), що запобігає активації некротичних факторів, а також покращує стан пошкоджених клітин. Недоліком такого способу є те, що етанол, який утворюється у результаті розпаду етилпірувату, є токсичним для клітин. Вплив етилпірувату на роботу мітохондріального апарату панкреатичних ацинусів, який відіграє ключову роль у життєзабезпеченні досліджуваних клітин, не досліджено. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб підвищення енергозабезпечення ацинарних клітин підшлункової шляхом використання пірувату як субстрату окиснення, що дасть змогу забезпечити мітохондрій цих клітин достатньою кількістю енергії. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб підвищення енергозабезпечення ацинарних клітин підшлункової залози до суспензії ізольованих клітин додають субстрат окиснення, відповідно корисної моделі як субстрат використовують піруват у концентрації 2 ммоль/л. Гострий панкреатит - це захворювання людини, за якого травні проферменти, що синтезується в панкреатичних ацинарних клітинах, активуються всередині залози, руйнують тканину та спричиняють запалення. Панкреатит здебільшого ускладнюється болісними відчуттями, некрозом підшлункової залози, поліорганною недостатністю і тривалою госпіталізацією. Загальний рівень смертності у пацієнтів з гострим панкреатитом становить приблизно 5 % (Pandol S.J. et al. Acute pancreatitis: bench to bedside // Gastroenterology. - 2007. Vol. 132. - P. 1127-1151). Одним із способів покращення стану хворих є нормальний раціон харчування, а також приймання протизапальних препаратів, однак повністю зупинити запалення та усунути його наслідки вдається рідко. Автори вперше запропонували використовувати піруват для підвищення енергозабезпечення ацинарних клітин підшлункової залози. Піруват утворюється як кінцевий продукт гліколізу і далі окислюється до ацетил-КоА, який включається у цикл Кребса і забезпечує енергетичні процеси в клітині. Фіг. 1. Швидкість дихання ацинарних клітин підшлункової залози за наявності у середовищі інкубації наступних речовин: - глюкози (10 ммоль/л), - пірувату (2 ммоль/л) на тлі глюкози, - глутаміну (2 ммоль/л) на тлі глюкози, - пірувату, глутаміну і глюкози; * - статистично вірогідна різниця порівняно зі швидкістю дихання за окиснення глюкози з Р  0,05. Фіг. 2. Швидкість дихання ацинарних клітин підшлункової, коли у середовищі інкубації є глутамін (2 ммоль/л) на тлі глюкози (10 ммоль/л): - контроль, - за дії холецистокініну (0,5 нмоль/л), - за дії ацетилхоліну (1 мкмоль/л); # - статистично вірогідна різниця швидкості дихання за дії ацетилхоліну порівняно з контролем з Р  0,05; ** - статистично вірогідна різниця швидкості дихання за дії холецистокініну порівняно з контролем з Р  0,01. Фіг. 3. Швидкість дихання ацинарних клітин підшлункової залози за наявності в середовищі інкубації пірувату (2 ммоль/л) на тлі глюкози (10 ммоль/л): - контроль, - за дії холецистокініну (0,5 нмоль/л), - за дії ацетилхоліну (1 мкмоль/л); # - статистично вірогідна різниця швидкості дихання за дії ацетилхоліну порівняно з контролем з Р  0,05; ## - з Р  0,01; * - статистично вірогідна різниця швидкості дихання за дії холецистокініну порівняно з контролем з Р  0,05;**- з Р0,01. 1 UA 118820 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Фіг. 4. Базальна швидкість дихання та максимальна швидкість FCCP-стимульованого дихання ацинарних клітин підшлункової залози за інкубації з: 1 - піруватом, 2 - сумішшю холецистокініну, етанолу і пірувату, 3 - глутаміном, 4 - сумішшю холецистокініну, етанолу і глутаміну; * - статистично вірогідна різниця з Р  0,05. Переваги способу можна продемонструвати на прикладі ізольованих ацинусів підшлункової залози щурів. Дослідження проводять на суспензії ізольованих клітин, наприклад, підшлункової залози щурів, яку отримують за способом Вільямса (Williams J.A., Korc M., Dormer R.L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini // Am. J. Physiol. 1978. - Vol. 235, № 5. - P. 517-524). Ацинуси ізолюють у середовищі виділення, що має такий склад, ммоль/л: NaCl-140,0, КСl-4,7, СаСl2-1,3, MgCl2-1,0, HEPES-10,0, глюкоза - 10,0, піруват 2, глутамін - 2, амінокислоти модифікованого середовища Ігла (MEM); pH 7,4. Середовище містить також бичачий сироватковий альбумін (2,5 мг/мл) та соєвий інгібітор трипсину (0,1 мг/мл). Для перевірки цілісності плазматичних мембран клітини фарбують у 0,1 %-му розчині трипанового синього. Підрахунок клітин здійснюють за допомогою камери Горяєва. Коли кількість незабарвлених клітин становить 95 % і більше, проводять подальше дослідження. Швидкість споживання кисню визначають полярографічно за допомогою закритого електрода Кларка. Температура інкубації становить 37 °C. Як субстрати окиснення використовують піруват або глутамін (по 2 ммоль/л) за наявності глюкози (10 ммоль/л). Для стимуляції енерговитрат клітинами використовують первинні агоністи ацетилхолін (1 мкмоль/л) або холецистокінін (0,5 2+ нмоль/л), дія яких реалізується через підвищення цитозольної концентрації Са . Для моделювання гострого панкреатиту in vitro використовують комбінацію холецистокініну (0,1 нмоль/л) та етанолу (20 ммоль/л). Дихання ізольованих ацинусів стимулюють протонофором FCCP у концентраціях від 0,5 до 2 мкмоль/л. За отриманими даними визначають максимальну швидкість FCCP-стимульованого дихання, якою характеризують максимальну окисну здатність мітохондрій. Необхідні статистичні розрахунки проводять за допомогою комп'ютера з використанням пакету програм Microsoft Office Excel. Базальна швидкість дихання не залежала від субстрату окиснення. Протонофор стимулював інтенсивність дихання у всіх випадках, проте максимальна швидкість дихання була різною і залежала від субстрату окиснення. Так, за наявності пірувату та глутаміну або лише глутаміну (на максимальна швидкість дихання була різною і залежала від субстрату окиснення. Так, за наявності пірувату та глутаміну або лише глутаміну (на тлі глюкози) швидкість дихання досягала свого максимум за концентрації FCCP 1,5 мкмоль/л і була вищою порівняно з швидкістю дихання за окиснення лише глюкози. А за окиснення пірувату на тлі глюкози чи лише глюкози швидкість дихання була максимальною за концентрації 1 мкмоль/л FCCP; подальше стимулювання спричинило лише зниження інтенсивності дихання (Фіг. 1). Первинні агоністи ацетилхолін (1 мкмоль/л) або холецистокінін (0,5 нмоль/л) стимулюють базальне дихання ацинарних клітин у середовищі, де як субстрат окиснення використовується глутамін, відповідно до 1,21±0,11 і 1,29±0,14 в.о (Фіг. 2). За наявності у середовищі пірувату стимульоване ацетилхоліном чи холецистокініном дихання становить відповідно 1,36±0,14 і 1,37±0,12 в.о. (Фіг. 3). Максимальна швидкість дихання мітохондрій панкреатичних ацинусів за окиснення глутаміну на тлі глюкози не змінюється під впливом первинних агоністів (Фіг. 2). Однак за наявності у середовищі пірувату вона статистично вірогідно зростає за дії ацетилхоліну і холецистокініну до 3,48±0,59 і 3,11±0,57 в.о. відповідно (Фіг. 3). У моделі гострого панкреатиту за окиснення глутаміну максимальна окисна здатність статистично вірогідно знижується на 21,4 %, а за окиснення пірувату не змінюється (Фіг. 4). Отже, на відміну від глутаміну піруват здатний запобігати негативному впливу етанолу на мітохондріальне дихання ацинарних клітин підшлункової залози. Запропонований спосіб дає змогу забезпечити постачання необхідної енергії для мітохондрій ацинарних клітин підшлункової залози. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб підвищення енергозабезпечення ацинарних клітин підшлункової залози, що включає додавання до суспензії ізольованих клітин субстрату окиснення, який відрізняється тим, що як субстрат використовують піруват у концентрації 2 ммоль/л. 2 UA 118820 U 3 UA 118820 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4