Спосіб корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові при експериментальній емфіземі легень

Реферат: Спосіб корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові при експериментальній емфіземі легень полягає у введенні піддослідним тваринам природної сполуки. Щурам протягом 2 тижнів вводять щоденно підшкірно 5 % розчин сукцинату натрію дозою 100 мг/кг маси тіла. UA 119848 U (12) UA 119848 U UA 119848 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, насамперед до біохімії та експериментальної пульмонології, і може бути використана для корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові при експериментальній емфіземі легень. Згідно з сучасними дослідженнями в патогенезі багатьох захворювань, особливо захворювань органів дихання, вагому роль відіграють метаболічні порушення, зокрема активація процесу перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), посилення якого призводить до накопичення його високотоксичних продуктів, що сприяють розвитку й підтримці запальних процесів, а також є важливим механізмом формування фіброзної тканини (див. Шмелев Е.И. Свежий взгляд на ХОБЛ [Текст] / Е.И. Шмелев // Атмосфера. Пульмонология и аллергология. 2011. - № 4. - С. 51-54). Емфізема легень є хронічним прогресуючим захворюванням, яке відносно часто призводить до інвалідності. Вважається, що в загальній популяції хворі із симптомами емфіземи зустрічаються більш ніж у 4 %; по даних аутопсії вона реєструється у 60 % померлих чоловіків і у 30 % жінок. Дана форма легеневої патології наростає з віком і після 60 років є однією з провідних клінічних проблем. Важливу роль у патогенезі емфіземи легень відіграє окисний (або оксидативний) стрес, основною причиною якого є дисбаланс "оксиданти-антиоксиданти", який виражається у надмірному посиленні утворення активних форм кисню (АФК) і ослабленні ефективності антиоксидантного захисту (АОЗ). При емфіземі легень розвивається локальна й системна гіпоксія, яка впливає на метаболізм різних органів і тканин. Страждають клітинні структури крові, зокрема, сама численна їхня фракція - еритроцити. Зміни в еритроцитах торкаються й системи АОЗ (див. Аспекты патогенеза эмфиземы легких у больных ХОБЛ [Текст] // А.В. Аверьянов и др. // Пульмонология. - 2008. - № 3. - С. 35-41). Проявленню ушкоджуючої дії вільних радикалів і перекисних сполук перешкоджає складна багатокомпонентна антиоксидантна система (АОС), яка забезпечує зв'язування й модифікацію радикалів, попереджає утворення або руйнування перекисів (див. Роль окислительного стресса в патогенезе хронической обструктивной болезни легких [Текст] / Л.Е. Муравлева и др. // Успехи современного естествознания. - 2012. - № 9. - С. 12-16). За специфікою біологічного впливу систему АОЗ розділяють на три рівні. Перший рівень антигіпероксидний (супероксиддисмутаза, глутатіон-пероксидаза, каталаза, глутатіон-редуктаза). Другий рівень антирадикальний (токоферол, ретинол, аскорбат, глутатіон і ін.). Третій рівень - антиперекисний (див. Окислительный стресе. Прооксиданты и антиоксиданты [Текст] / Е.Б. Меньшикова и др. Москва: Слово, 2006. - 576 с.). Провідною ланкою системи АОЗ є перший рівень, потужність якого забезпечується активацією фізіологічних і біохімічних механізмів, відповідальних за збереження прооксидантно-антиоксидантної рівноваги. Функціонування всіх ферментів взаємопов'язане й взаємозалежне - продукти реакції, які каталізуються ферментом з однієї лінії системи АОЗ, є субстратами для ферментів наступних ліній, та одночасно можуть виступати в ролі їх алостеричних ефекторів (Калматов Р.К. Роль механізмів свободнорадикального окиснення в патогенезі локальної поразки верхніх дихальних шляхів [Текст] / Р.К. Калматов, С.Т. Жолдошев // Молодий учений. - 2015. - № 10. - С. 417-422). Одним із можливих критеріїв активності патологічного процесу при емфіземі легень може бути стан перекисного окиснення ліпідів і антиоксидантної системи, оскільки ці системи контролюють стан клітинних мембран як у нормі, так і при патологічних станах, їх рівновага забезпечує нормальну проникність мембран і іонний транспорт, регулює біоенергетичні реакції мітохондрій, впливає на репарацію клітинних мембран, а зміна властивостей клітинних мембран - одна із складових будь-якого патологічного процесу (див. Григорьева, Н.Ю. Хроническая обструктивная болезнь легких: новое о патогенетических механизмах [Текст] / Н.Ю. Григорьева, А.П. Кузнецов, Е.Г. Шарабрин // СТМ. - 2011. - № 1. - С. 112-116.). У зв'язку з тим, що одним із основних вторинних ушкоджуючих факторів при емфіземі легень є оксидативний стрес, який супроводжується активацією перекисного окиснення ліпідів, окисною модифікацією білків, змінами у ферментативній та неферментативній ланках антиоксидантної захисної системи, при цьому першорядну важливість здобуває антиоксидантна терапія (див. Соодаева С.К. Окислительный стресе и антиоксидантная терапия при заболеваниях органов дыхания [Текст] / С.К. Соодаева // Пульмонология. - 2006. - № 5. - С. 122-126). Відомий спосіб корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові з хронічною емфіземою легень шляхом введення коням з кормом вранці та ввечері 500 мг еміцидину - похідного 3-оксипіридину та бурштинової кислоти протягом 10 днів у складі комплексної терапії (див. Шатилов А.В. Ферментативная антиоксидантная система крови при лечении лошадей с хроническими заболеваниями легких [Текст]: дис. … канд. ветерин. наук: 16.00.01: защищ. 12.11.07: утверждена 10. 06.08 / Шатилов А.В. - М., 2008. - 132 с). Комплексне лікування коней з хронічною емфіземою легень із додатковим застосуванням еміцидину 1 UA 119848 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виявляє більш виражений терапевтичний ефект і призводить до нормалізації показників активності ферментів антиоксидантної системи крові: активність ферменту каталази 3 підвищується з 34,85±2,43 мкмоль пероксиду водню/лххв х 10 до 52,92±4,87 мкмоль пероксиду 3 водню/л х хв. x 10 , активність ферменту глутатіон-редуктази підвищується з 217,2±12,71 ммоль окисненого глутатіону/л x 5 хв до 308,3±12,89 ммоль окисненого глутатіону/л x 5 хв. Однак, спосіб не дає можливості визначити механізм, за допомогою якого реалізується терапевтична дія еміцидину на біохімічні системи - безпосередньо чи опосередковано. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові при експериментальній емфіземі легень, в якому шляхом введення піддослідним тваринам сукцинату натрію досягається розкриття механізму безпосереднього впливу даної сполуки на функціональний стан ферментів антиоксидантної системи крові, а саме, відновлення активності даних ферментів крові до рівня величин здорових тварин, а також спрощення та зменшення витрат коштів. Поставлена задача вирішується тим, що у способі корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові при експериментальній емфіземі легень, який полягає у введенні піддослідним тваринам природної сполуки, згідно з корисною моделлю, щурам протягом 2 тижнів вводять щоденно підшкірно 5 % розчин сукцинату натрію дозою 100 мг/кг маси тіла. Сукцинат - це аніон бурштинової кислоти, що утворюється в циклі трикарбонових кислот, є природним метаболітом організму. З лікувальною метою найчастіше використовують солі бурштинової кислоти, зокрема сукцинат натрію (бурштиновокислий натрій). Він сприяє збереженню енергетичного гомеостазу клітин і відновленню багатьох біохімічних процесів, має широкий спектр фармакологічної активності: антиоксидантну, стреспротективну, мембраномодулюючу, антигіпоксичну. Відомо, що при глибокій гіпоксії, що розвивається при хронічних легеневих захворюваннях, дихальний ланцюг мітохондрій одержує водень в основному від бурштинової кислоти, тому що при її окисненні водень надходить на значно більш близьку до кисню ділянку дихального ланцюга (див. Алексеева Л.В. Янтарная кислота основное действующее вещество новых метаболических препаратов [Текст] / Л.В. Алексеева [и др.] // Врач. - 2001. - № 12. - С. 29-31). Активація вільнорадикального пероксидного окиснення, окислювальний стрес, що має місце за умов папаїнової емфіземи легень, викликає окислювальну модифікацію ліпідів і білків, призводить до функціональних порушень властивостей мембран, до зниження активності антиоксидантної системи захисту (див. Біохімічні та фізіологічні зміни в крові при експериментальній емфіземі [Текст] / Я.І. Русінчук, В.І. Коржов, І.В. Ліскіна, О.О. Мельник // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. - 2016. - № 3. - С 65-67). Спосіб реалізують наступним чином. Експериментальну папаїнову емфізему легень у білих щурів відтворювали шляхом одноразового під легким ефірним наркозом інтратрахеального введення 0,5 мл розчину папаїну ("Merck KGaA", Німеччина) дозою 100 мг на кг маси тіла тварини - ферменту, який належить до цистеїнових протеаз та каталізує гідроліз білків і пептидів, сприяючи, в такий спосіб, руйнуванню легеневої тканини. З метою корекції функціонального стану ферментів антиоксидантної системи крові щурам з папаїновою емфіземою легень протягом 2 тижнів вводили щоденно підшкірно 5 % розчин сукцинату натрію дозою 100 мг/кг маси тіла, яка була визначена експериментально. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом. Об'єктом дослідження є еритроцити. Еритроцити виділяли за допомогою центрифугування (3000 об/хв) із стабілізованої розчином гепарину крові (25 ОД на 1 мл крові) і за допомогою центрифугування двічі відмивали холодним фізіологічним розчином. Гемолізат еритроцитів отримували шляхом змішування 100 мкл еритроцитів, відмитих із суцільної гепаринізованої крові, і 240 мкл холодної дистильованої води. Визначення активності глутатіон-редуктази (КФ. 1.6.4.2) проводили методом J. Carlberg (див. Верболович, В.П. Определение активности глутатион-редуктазы и супероксиддисмутазы на биохимическом автоанализаторе [Текст] / В.П. Верболович, Л.М. Подгорная // Лаб. дело. - 1987. - № 2. - С. 17-20), принцип якого полягає в реєстрації швидкості окиснення НАДФН при 340 нм. Кінетичне визначення активності глутатіон-редуктази, тобто вимір по декількох точках через визначений проміжок часу, проводили на біохімічному аналізаторі типу ФП-901 "Labsystems" (Фінляндія). Аналізатор робить 9 вимірів протягом 5 хв протікання реакції на лінійній ділянці, обчислює рівняння лінії, що проходить найбільш точно через заміряні точки, а також розкид від цієї лінії, який перетворюється в одиниці активності ферменту. 2 UA 119848 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У середовище, що містить 400 мкл 0,06 М фосфатного буфера, рН 7,4, 240 мкл 0,1 M NaCl, 30 мкл 0,01 М ЕДТА, 15 мкл гемолізату, 15 мкл 2,0 мМ окисненого глутатіону, додавали 60 мкл 2,4 мМ НАДФН, який готують безпосередньо перед експериментом на 0,01 М фосфатному буфері, рН 8,0 і інкубували 10 хв при 37 °C в кюветі з довжиною оптичного шляху 10 мм. Кінетику реакції реєстрували по заданій програмі. Активність ферменту виражали в мкмолях НАДФН, окисненого за 1 хв на 1 г гемоглобіну з використанням скорегованого, з урахуванням конструкції кювет апарата, коефіцієнта молярної екстинції - 5,66. Ступенем активності ферменту глутатіон-пероксидази (КФ. 1.11.1.9) є швидкість окиснення глутатіону в присутності гідропероксиду третинного бутилу. Концентрацію відновленого глутатіону до і після інкубації визначали колориметрично. В основі розвитку кольорової реакції лежить взаємодія SH-груп 5,5-дитіобіс(2-нітробензойної) кислоти (ДТНБК) з утворенням пофарбованого продукту - тіонітрофенільного аніону (ТНФА). Вміст останнього прямо пропорційний вмісту SH-груп, що прореагували з ДТНБК (див. Мовин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатион-пероксидазы в эритроцитах [Текст] / В.М. Мовин // Лаб. дело. - 1986. - № 12. - С. 724-722). Були використані наступні реактиви: (1). Трис-НСl-буфер 0,1 М, рН 8,5, що містить 6 мМ ЕДТА і 12 мМ азиду натрію. Безпосередньо перед аналізом на цьому буфері готували 4,8 мМ розчин відновленого глутатіону (2). Трис-НСl-буфер 0,1 М, рН 8,5 (3). Гідропероксид третинного бутилу, 20 мМ розчин (готували перед аналізом розведенням вихідного реактиву в 500 разів). (4). Трихлороцтова кислота (ТХО) - 20 г/л (5). Реактив Елмана - 0,01 М розчин (3,96 г/л) ДТНБК на метанолі. Еритроцити гемолізували рівним об'ємом дистильованої води й повторним заморожуванням та розмороженням. Концентрацію гемоглобіну доводили до 10 г/л розведенням гемолізату водою. 100 мкл гемолізату преінкубували в термостаті з 830 мкл реактиву (1) протягом 10 хв при 37° С, потім додавали 70 мкл реактиву (3) та інкубували точно 5 хв. Реакцію зупиняли додаванням 200 мкл холодної ТХО, центрифугуванням протягом 10 хв при 3000 об/хв видаляли осаджені білки. 100 мкл супернатанту вносили в 10 мл трис-НСl-буфера (реактив 2) і додавали 100 мкл реактиву Елмана. Через 5 хв проби фотометрирували при 412 им у кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см. Контрольна проба відрізнялася тим, що гемолізат вносили безпосередньо перед осадженням білків. З урахуванням розведення біологічного матеріалу і коефіцієнта молярної екстинції ТПФА при 412 нм - 11400 - розраховували активність глутатіон-пероксидази в мікромолях, витраченого в реакції субстрату по заданій формулі: (Е контр. - E досліду) x 2147 = мкмоль GSH / хв х 1 г гемоглобіну (Hb), де Е контр. - оптична густина контрольної проби; Е досліду - оптична густина дослідної проби; 2147 - коефіцієнт перерахунку, що розраховується математичним шляхом з урахуванням розведення гемолізату і коефіцієнта молярної екстинції ТНФА. Визначення активності каталази в еритроцитах (КФ. 1.11.1.6) засноване на здатності ферменту руйнувати субстрат - перекис водню, залишок Н2О2 визначали за допомогою молібдату амонію (перекис водню з солями молібдата амонія утворюють стійки комплекси жовтого кольору з максимом поглинання при довжині хвилі 410 нм) (див. Метод определения активности каталазы [Текст] / М.А. Королюк [и др.] // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-18). Реакція запускається додаванням 0,1 мл гемолізату еритроцитів (0,1 мл відмитих еритроцитів вносять у 20 мл дистильованої води) до 2 мл 0,03 % розчину Н2О2. В контрольну пробу замість гемолізату еритроцитів вносять 0,1 мл дистильованої води. Реакцію зупиняють через 10 хв додаванням 4 % молібдату амонію. Інтенсивність забарвлення виміряли на аналізаторі при довжині хвилі 410 нм проти холостої проби, в яку замість Н 2О2 вносять 2 мл Н2О. Активність каталази розраховували за формулою: -1 Е = (А контр. пр. - А досл. пр.) х v x t x k x l мкмоль х (с/л) , х -1 де Е - активність каталази в мкмоль (с/л) ; А контр. пр. - активність контрольної проби; А досл. пр. - активність дослідної проби; V - об'єм проби, що вносимо: 0,1 мл = 0,1 × 10" л; t - час інкубації - 600 с; 3 -1 -1 k - коефіцієнт мілімолярної екстинції перекису водню, що дорівнює 22,2 × 10 ммоль хсм ; 1 - довжина шляху променя хвилі дорівнює 1 см. 3 UA 119848 U 5 10 За результатами проведених досліджень встановлено, що при введенні піддослідним тваринам з експериментальною емфіземою легень щоденно підшкірно 5 % розчину сукцинату натрію дозою 100 мг/кг маси тіла протягом 2 тижнів відбувається вірогідне зростання активності -1 глутатіон-редуктази в еритроцитах з 2,32±0,12 мкмоль НАДФН х (хв/г Нb) до 3,41±0,30 мкмоль -1 -1 НАДФН х (хв/г Нb) , активності глутатіон-пероксидази з 170,84±10,40 мкмоль GSH x (хв/г Нb) -1 -1 до 275,38±19,03 мкмоль GSH x (хв/г Нb) та активності каталази з 38,54±3,32 мкмольх(с/л) до -1 63,99±2, 31 мкмольх(с/л) (див. таблицю). Отже, антиоксидантна терапія сукцинатом натрію за умов експериментальної емфіземи легень протягом 2 тижнів дозою 100 мг/кг маси тіла сприяє відновленню зниженої активності ферментів антиоксидантної системи захисту, і, як наслідок, відновленню балансу окисного метаболізму. Таблиця Активність ферментів антиоксидантної системи крові щурів за умов експериментальної емфіземи легень та корекції сукцинатом натрію (М ± m) Групи тварин Інтактні тварини (n=8) Тварини з емфіземою легень, (n=8) Тварини з емфіземою легень, що отримували сукцинат натрію (n=8) Глутатіон-редуктаза, Глутатіон-пероксидаза, Каталаза, мкмоль мкмоль НАДФН х (хв/г Нb) мкмоль GSH x (хв/г -1 х (с/л) 1 -1 Нb) 3,45±0,19 276,04±14,60 61,04±2,46 2,32±0,12* 170,84±10,40* 3,41±0,30* 275,38±19,03 # 38,54±3,32* 63,99±2,31 # Примітки: * - різниця показників відносно інтактних щурів вірогідна (Р